Un romanzo In Vitro ferita guarigione test per valutare la migrazione cellulare

L'obiettivo di questa procedura è quello di mostrare come valutare la capacità di alcune molecole immunomodulatorie, come gli antimicropeptidi, di stimolare la migrazione cellulare, che è un evento limitante la velocità durante il processo di guarigione delle ferite. In generale, la procedura di base per studiare la migrazione cellulare in vitro prevede la creazione di un monostrato cellulare, la produzione di pseudo-ferite, l'acquisizione di immagini a diversi intervalli di tempo fino al raggiungimento della chiusura della ferita e l'analisi della sequenza di immagini per quantificare la migrazione cellulare. Ora, il vantaggio di questo metodo rispetto al test classico, che si basa su un graffio fatto manualmente, è dovuto all'utilizzo di speciali inserti di coltura in silicone per creare il campo pseudo-avvolto, che è completamente privo di cellule e con una larghezza molto ben definita, 500 micrometri.

Inoltre, grazie a un programma di analisi delle immagini automatizzato basato sul web, è possibile ricevere rapidamente in pochi minuti dati quantitativi sulla velocità di chiusura della ferita e sulla migrazione cellulare. Quindi, nel complesso, questa è una tecnica sperimentale affidabile che può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula aderente con un'altissima riproducibilità dei dati. Qui, viene fornito, a titolo di esempio, l'effetto di un antimicropeptide della pelle di rana sulla migrazione delle cellule epiteliali bronchiali e come il pretrattamento di queste cellule con inibitori specifici possa fornire informazioni sul meccanismo molecolare alla base di tali eventi.

Più precisamente, verrà mostrato come la migrazione cellulare indotta da peptidi coinvolga l'attivazione del recettore del fattore di crescita epidermico. Per iniziare l'esperimento, rimuovere il pallone contenente le cellule dall'incubatore per colture cellulari e controllare la circonferenza su un microscopio invertito dotato di un sistema di acquisizione automatica delle immagini. Se si raggiunge il 90% della confluenza completa, passare a una cappa di biosicurezza e aspirare con cura il terreno di coltura utilizzando una pipetta di plastica da 10 millilitri in condizioni sterili e gettare delicatamente il terreno nel flacone di scarto.

Lavare le cellule con sei millilitri di PBS senza calcio e magnesio, cioè CMF. Scuotere delicatamente il pallone manualmente e scartare il CMF. Quindi, aggiungere altri 10 millilitri di CMF per rimuovere ulteriormente i detriti cellulari e le cellule non attaccate.

A questo punto, chiudete il pallone, e rimettetelo nell'incubatore per colture cellulari per 10 minuti. Estrarre il pallone, scartare il CMF e aggiungere delicatamente due millilitri di tripsina-EDTA per staccare le cellule dalla superficie di plastica. Agitare delicatamente il pallone manualmente, lasciando che la soluzione copra completamente le cellule, e incubare il pallone per altri 10 minuti.

Successivamente, rimuovere il pallone dall'incubatrice e verificare se il processo di aggiunta della tripsina è completo. In questo caso, le cellule saranno in sospensione e appariranno arrotondate al microscopio. Per inattivare la tripsina, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura integrati con il 10% di siero bovino inattivato a caldo e lavare accuratamente il pallone.

Raccogliere la sospensione cellulare, trasferire questo volume in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare il campione. Dopo la centrifugazione, controllare la formazione del pellet, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura da sei millilitri integrato con siero. Pipettare la sospensione cellulare su e giù per diverse volte per rompere la formazione di grumi.

Questo processo potrebbe richiedere alcuni minuti. Successivamente, estrarre 10 microlitri con la punta di una micropipetta, iniettare il volume sotto il vetro di copertura di una camera Burker o Neubauer e contare il numero di cellule. In ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, mettere l'inserto di coltura con l'aiuto di una pinzetta sterile.

Ogni inserto è dotato di due scomparti separati da una parete di 500 micrometri e c'è una parte inferiore adesiva per consentire l'adesione. Tuttavia, per mezzo di una pinzetta, applicare una certa pressione lungo i bordi dell'inserto per fissarli alla superficie della piastra. Riempire ogni scomparto dell'inserto con 70 microlitri di sospensione cellulare contenente circa 3,5 per 10 o quattro cellule per camera.

È importante sottolineare che la concentrazione di cellule applicate in ciascun compartimento dipende dal tipo di cellule. Si consiglia di utilizzare una densità cellulare che porti alla completa confluenza entro 24 ore. Al microscopio con ingrandimento quadruplo, verificare che le cellule non fuoriescano dagli scomparti dell'inserto, quindi incubare la piastra per 24 ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente gli inserti con una pinzetta sterile senza rompere i monostrati cellulari e trasferire l'inserto su carta assorbente. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di terreno per pozzetto. Fare attenzione a non aggiungere il terreno direttamente sopra i monostrati di celle, per evitare che si interrompano.

Chiudere la piastra e farla oscillare delicatamente manualmente. Aspirare il terreno e sostituirlo con un millilitro di terreno fresco per pozzetto. Visualizza le lacune prive di cellule al microscopio e acquisisci immagini al tempo zero.

Estrarre il terreno dai pozzetti e aggiungere PBS integrato con calcio e magnesio. Agitare la piastra, rimuovere il PBS e infine aggiungere i composti in esame ai pozzetti. Per i campioni di controllo non trattati, viene utilizzato un mezzo millimetrico.

Incubare la piastra. Per ogni campione, osservare la migrazione cellulare al microscopio a un ingrandimento quadruplo e acquisire immagini dopo 15, 20 e 24 ore di incubazione. Durante questo passaggio, provare a catturare le immagini nelle stesse aree del tempo zero.

La scelta degli intervalli di tempo in cui vengono acquisite le immagini dipende dalla velocità di migrazione delle celle selezionate. Al termine dell'esperimento, selezionare le immagini per ogni campione a intervalli di tempo diversi e creare un file zip. È importante avere almeno tre repliche per ogni campione ad ogni intervallo di tempo.

Apri il programma automatizzato di analisi delle immagini Wimasis e carica il file zip utilizzando l'ingrandimento più basso. Il programma fornirà automaticamente via email un file riassuntivo contenente i dati sperimentali dell'area coperta da cellule e delle aree di graffio in percentuale di ogni singolo campione, ad esempio i campioni 1a e 2a, nei punti temporali selezionati. Calcolare un valore medio di tutti i campioni al tempo zero.

Normalizza tutti i dati rispetto al valore medio al tempo zero. Calcolare un valore medio di tutti i campioni in ogni punto temporale e l'errore standard relativo. Utilizzando il test ANOVA bidirezionale, eseguire analisi statistiche.

I dati ottenuti possono essere tracciati in un grafico come un istogramma che mostra la percentuale di area coperta da cellule in diversi punti temporali per diversi gruppi di campioni. Questi istogrammi mostrano la chiusura della ferita ottenuta dopo 15, 20 e 24 ore di trattamento delle cellule bronchiali con diverse concentrazioni dell'antimicropeptide esculentin 1-21-1c o esculentin 1-21 rispetto al controllo. Come evidenziato dagli istogrammi e da alcune micrografie rappresentative, l'esculentina 1-21-1c è più efficiente nel promuovere la riepitelizzazione della pseudo-ferita nelle cellule bronchiali indotta nella chiusura quasi completa del campo della ferita entro circa 20 ore ad un micromolare, mentre una concentrazione maggiore è necessaria per l'esculentina 1-21, cioè 10 micromolari.

Per studiare il ruolo di alcuni recettori, come il recettore del fattore di crescita epidermico, sulla migrazione cellulare, è necessario pretrattare i monostrati cellulari con un inibitore specifico, ad esempio il composto AG1478. A tale scopo, prima di rimuovere l'inserto, aspirare il terreno in ogni scomparto, lavarlo una volta e aggiungere 70 microlitri di terreno integrati con cinque micromolari AG1478. Incubare la piastra per 30 minuti.

Quindi, rimuovere l'inserto con una pinzetta e procedere come descritto in precedenza. Questi sono i dati finali che mostrano che la migrazione cellulare indotta dai peptidi coinvolge l'attivazione del recettore del fattore di crescita epidermico. Infatti, dopo il pretrattamento con l'inibitore AG1478, la percentuale di area coperta dalle cellule è significativamente ridotta a tutti gli intervalli di tempo rispetto ai risultati riscontrati quando le cellule non sono pre-incubate con AG1478 prima di aggiungere il peptide.

In conclusione, il metodo descritto ha un alto potenziale per migliorare significativamente la comprensione della caratteristica migratoria di diversi tipi di cellule, nonché la selezione dei promotori e/o inibitori della guarigione delle ferite più promettenti, in breve tempo e con un'elevata precisione.