Name: Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri il modello di attività contrattile cronica per studiare gli adattamenti del muscolo scheletrico nel ratto. Questo metodo consente di osservare in soli sette giorni le modifiche fenotipiche tipiche di un allenamento di sei settimane, analizzando biogenesi mitocondriale e autofagia.

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Siamo grati a Liam Tyron per la sua lettura esperta del manoscritto. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) D. A. cappa. D. A. Hood è anche titolare di un Canada Research Chair in fisiologia cellulare.

Tutte le procedure relative agli animali erano esaminate e approvate dal comitato di cura di York University degli animali. All'arrivo presso la struttura animale all'Università di York, tutti i ratti sono stati dati un minimo di cinque giorni per acclimatarsi al loro ambiente prima della procedura chirurgica, con cibo fornito ad libitum. Anche se questo protocollo è stato applicato in precedenza per altre specie15,17,22, la carta corrente si basa sul lavoro pionieristico di Pette e colleghi23 e si concentra sul modello del ratto, in particolare.
1. preparazione dell'unità di attività contrattile cronica
<ol><li>Utilizzando un voltmetro, controllare il potenziale delle batterie al litio moneta. Nota: Il potenziale di ogni batteria deve essere 3.0 ± 0,10 V.</li>
	<li>Inserire due o tre batterie nello slot dell'unità in modo che il potenziale totale è 6-9 V. Nota: È a discrezione dei ricercatori a considerare quanto potenziale (6 o 9 V) per mantenere durante la procedura intera sperimentale. Secondo lo studio di progettazione e l'intensità desiderata dello stimolo, 2 o 3 batterie possono essere usate.</li>
	<li>Verificare che l'unità stia funzionando correttamente tramite l'indicatore di impulso, di esporre l'unità a 1 impulso emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.</li>
</ol>2. intervento chirurgico di attività contrattile cronica
Nota: Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica. Durante e immediatamente dopo l'intervento chirurgico, la temperatura corporea dei topi è mantenuta da un rilievo di riscaldamento. È preferibile eseguire l'intervento chirurgico su un telo chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti chirurgici sterili, nonché un camice da laboratorio pulito. Se necessario, si consiglia di indossare una maschera respiratore monouso.
<ol><li>Anestetizzare ratti sotto 1-3% isoflurane inalazione con l'ossigeno, che è gestito da un sistema di Vaporizzatore gas. Confermare l'animale è completamente sedata controllando hindlimb pizzico di punta e osservando la frequenza e profondità respiratoria. Applicare il lubrificante oculare sugli occhi per evitare la secchezza. Applicare un'iniezione sottocutanea di Meloxicam (0,5 mg/mL) a 2 mg/kg. Nota: Si consiglia inoltre di avere un'applicazione multi-modale di analgesia (ad es., Meloxicam più lidocaina) per ridurre al minimo qualsiasi dolore durante e dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Delicatamente Radere l'arto posteriore sinistro, come pure una striscia intorno al tronco dalla parte posteriore del collo, intorno alle spalle degli arti anteriori e attraverso il torace anteriore. Strofinare delicatamente le zone rasate con iodio e alcol etilico per disinfettare.</li>
	<li>Con l'animale che pone sul suo stomaco, praticare una piccola incisione (~0.5 cm) sul retro del collo al centro della regione rasata (l'area palpabile tra scapole) usando un bisturi (lama n. 10).</li>
	<li>Individuare il nervo peroneo comune.<ol>
<li>Animale sul suo lato destro del rullo e fare un ~ 2-3 cm-lungo taglio nella pelle dell'arto posteriore sinistro. L'area di incisione intorno i gruppi muscolari di coscia superiore che è monumentale tra la fossetta dell'articolazione del ginocchio e la parte posteriore vicino all'origine della coda di destinazione. Nota: Fare attenzione a non contaminare la prima area di incisione quando si cambia la posizione del corpo.</li>
		<li>Utilizzando punte blunt curvo forbici chirurgiche, sezionare la zona sottocutanea ampiamente ~3.5 - 4 cm, che separa la pelle dal muscolo sottostante al fine di rendere una tasca tra la pelle aperta e muscolo sottostante. Aprire la pelle dal tessuto di fondo su tutta la circonferenza dell'incisione (~1.5 cm2).</li>
		<li>Praticare una piccola incisione (meno di 0,5 cm) sul muscolo bicipite femorale con forbici chirurgiche, assicurando che le punte delle forbici sono di taglio basso direttamente attraverso il muscolo.</li>
		<li>Aprire delicatamente la zona del taglio fino a quando i gruppi muscolari interna e il nervo peroneo comune sono visibili (la profondità dei tessuti muscolari esterne (cioè, bicipite femorale) è di circa ~0.5 cm). Utilizzando forcipe, delicatamente tocco/pizzico il nervo visibile e osservare le risposte dei gruppi muscolari di destinazione (ad es., TA muscolo) e dita dei piedi (visibile dorsiflexion) per confermare che il nervo peroneo comune è isolato. Nota: Questo passaggio deve essere effettuato con estrema cautela per evitare di tagliare o danneggiare il nervo.</li>
		<li>Fissare la finestra tirandola aperta con metallo divaricatori tale che la dimensione della finestra è ~1.5 cm2 con il nervo peroneo che si trova al centro della finestra. Utilizzare il piccolo gancio metallico collegato a cinghie e/o elastici che vengono fissate alla superficie del tavolo (o bordo di chirurgia) (Figura 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fissare il cavo a entrambi i lati del nervo.<ol>
<li>Preparazione di ~ 50-60 cm di politetrafluoroetilene (PTFE)-rivestito di filo di acciaio sottile e piegarlo a metà. Nota: Potrebbe essere utile per esporre PTFA-rivestito filo sotto la luce UV prima dell'intervento.</li>
		<li>Agganciare la parte piegata del filo nella fessura di una canna di acciaio inox lungo cm 30. Passare l'asta, insieme con il filo, per via sottocutanea da tasca aperta del hindlimb verso l'area piccola incisione sul retro del collo, in un modello di L-forma fino alla gamba e lungo il centro della schiena.</li>
		<li>Trovare le due estremità del filo presso l'arto posteriore. Spelare i fili dal momento che tutti i fili sono isolati in PTFE. Con attenzione usando un bisturi, spelare le estremità del filo di ~1.5 cm. Se i fili diventano sfilacciati, ritagliale e ri-strip. Avvolgere le estremità dei conduttori spogliato intorno ad un ago 21G smussata (5 volte), rendendo una bobina. Una volta che le bobine siano state effettuate correttamente, rimuovere l'ago da loro.</li>
		<li>Utilizzando una dimensione di seta chirurgica 6-0, fissare ciascuna delle bobine su entrambi i lati del nervo peroneo comune (Figura 2A).<ol>
<li>Fare un nodo alla fine della bobina e si sutura sul lato sinistro del nervo. Assicurarsi che la bobina sia 1.5-2.5 mm dal nervo.</li>
			<li>Per fissare la bobina, applicare due o tre suture supplementari lungo la bobina.</li>
			<li>Ripetere questi passaggi sul lato destro del nervo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL) e quindi con attenzione la finestra (cioè, tessuto del muscolo bicipite femorale) usando la seta di dimensioni 5-0 suturare.</li>
	</ol></li>
	<li>Senza bloccare vento slack rimanenti di filo (circa il diametro del dito indice) e spingere la tasca sottocutanea sopra l'incisione suturata del muscolo bicipite femorale (circa sopra l'anca).</li>
	<li>Applicare 2-3 gocce di soluzione antibiotica nuovamente (ampicillina in soluzione salina; 132 mg/mL). Chiudere la pelle aperta di pinzatura.</li>
	<li>Collegare i fili (che fuori dell'area di incisione del collo) per lo stimolatore CCA.<ol>
<li>Collegare prese pin con i fili.<ol>
<li>Tagliare l'anello del filo che esce l'incisione nella parte superiore del collo per creare 2 estremità del filo (questi conducono le bobine suturato ai lati del nervo peroneo).</li>
			<li>Usando un bisturi, spelare le estremità dei fili da ~0.5 cm. tagliare i fili sfilacciati, se presente.</li>
			<li>Lentamente spingere le parti spogliate dei cavi nel foro delle prese pin e utilizzando un saldatore, saldare i fili sulle prese pin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Facoltativamente, selezionare la connessione dei cavi.<ol>
<li>Collegare i pin ad un'unità di stimolatore grande benchtop tramite morsetti a coccodrillo.</li>
			<li>Fornire un singolo impulso di 9 V (0,1 ms, 10 Hz) per confermare che TA muscoli contratti e sinistra piede dorsiflexes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Passare le estremità dei conduttori collegati pin attraverso il tampone di garza sterile che è ~ 4 x 4 cm.</li>
		<li>Collegare i pin per l'unità di stimolatore CCA.<ol>
<li>Passare i cavi attraverso il foro nella base della casella di stimolatore. Nota: Questa casella è una camera fatta in casa per l'unità di stimolatore CCA ed è 3,5 cm × 3,5 cm × 2,5 cm13.</li>
			<li>Inserire le spine nelle prese di connessione dell'unità di CCA. Inserire delicatamente l'unità CCA nel vano. Utilizzare una virata appiccicosa per fissare l'unità CCA nella parte inferiore della camera.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando un nastro atletico o il nastro chirurgico poroso, difficoltà della camera con nastro adesivo intorno il torso rasato. Chiudere il coperchio dell'alloggiamento con tre strati di nastratura e finire avvolgendo un nastro intorno ai lati della finestra di stimolatore per garantire la casella (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifica se il CCA sta lavorando di esporre l'unità a un singolo impulso di luce infrarossa (spettro di lunghezza d'onda > 770 nm) che viene emesso da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi. Nota: Se il CCA è correttamente funzionante, i ricercatori sarà in grado di vedere che i muscoli del hindlimb (cioè, TA) sono contraenti in risposta alla luce a infrarossi.</li>
	<li>Il ratto di osservare e monitorare la temperatura fino a quando non ha pienamente riacquistato coscienza. Casa in una gabbia di singolo occupante per prevenire qualsiasi danno da altri animali e non lasciare alcun tunnel o oggetti di plastica nella gabbia per il resto dello studio per mitigare il rischio di danni all'apparecchio stimolatore o lesioni all'animale. Alimentazione con una bottiglia di acqua incluso Amoxicillin (0,5 mg/mL).</li>
	<li>Applicare la dose di 1 mg/kg di Meloxicam per via sottocutanea ogni 24 h dopo l'intervento chirurgico, che continua almeno per 72 h.</li>
</ol>3. cronica attività contrattile
<ol><li>Dopo l'intervento chirurgico, consentire almeno 5-7 giorni per un pieno recupero dell'incisione e zone di sutura in/intorno i muscoli scheletrici. Nota: Durante e dopo la procedura CCA, controllare accuratamente la condizione di ogni animale osservando i loro comportamenti (ad es., mangiare, bere, e/o in movimento). Inoltre, determinare qualsiasi stress grave o effetti negativi verificando un cambiamento di peso corporeo prima e dopo la procedura CCA.</li>
	<li>Il giorno di stimolazione di CCA, accendere CCA esponendo l'unità stimolatore ad un singolo impulso di luce infrarossa (lunghezza d'onda > 770 nm) da una portatile luce stroboscopica ad infrarossi.</li>
	<li>Applicare 3 o 6 h di stimolazione CCA 10 Hz. Nota: I tempi per la stimolazione è fino al ricercatore. La frequenza di stimolazione non è mai stata alterata in questi esperimenti, e solo molto modesti miglioramenti nell'adattamento mitocondriale sono state osservate estendendo la stimolazione da 3 a 6 ore al giorno, nella nostra esperienza. Se possibile, controllare la stimolazione e l'animale ogni 30-60 min.</li>
	<li>Successivamente al periodo CCA desiderato, spegnere l'unità CCA tramite esposizione alla luce a infrarossi (stessa procedura di accensione dell'unità).</li>
	<li>Se l'applicazione di più giorni, ripetere il passo 3.2. 3.4.</li>
	<li>Determinare i tempi di raccolta del tessuto. Ad esempio, raccogliere tessuti 24 h dopo l'inizio del combattimento finale di CCA (cioè, 18 h dopo l'ultima stimolazione di CCA di 6 h), che si svolge sotto l'anestesia, come fatto durante la procedura chirurgica di CCA. Immediatamente dopo aver raccolto tutti i tessuti, eutanasia animali asportando il cuore mentre l'animale è ancora sotto anestesia.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il modello di attività contrattile cronica (CCA) di esercizio, attraverso il muscolo bassa frequenza stimolazione in vivo, è un eccellente modello per studiare gli adattamenti fenotipica del muscolo per esercitare13,24,25 , 26. come dimostrato in precedenti studi20,27, CCA è un efficace strumento mediante il quale i ricercatori...

Muscolo scheletrico può adattarsi per esercitare attività di formazione attraverso i cambiamenti nella sua bioenergetica e struttura fisica1. Una delle principali alterazioni provocate da allenamento di resistenza è la biogenesi mitocondriale, che può essere valutata da un aumento nell'espressione di componenti mitocondriali (ad es., le unità secondarie del citocromo c ossidasi [COX]), così come l'espressione di il coactivator transcriptional, PGC-1 α2. Un crescente numero di studi hanno indicato che numerosi altri fattori, tra cui fatturato mitocondriale e mitophagy, sono anche importanti per l'adattamento del muscolo. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali esercizio acuto o cronico regolano questi processi in muscolo scheletrico sono ancora poco chiari.
Per delineare le vie che regolano gli adattamenti indotti dall'esercizio muscolare, vari modelli di esercizio sono stati utilizzati comunemente negli studi nei roditori, tra cui tapis roulant, corsa ruota e il nuoto esercizio. Tuttavia, questi protocolli hanno alcune limitazioni, in quanto sono necessarie ~ 4-12 settimane per osservare questi cambiamenti fenotipici3,4,5. Come metodo alternativo sperimentale, bassa frequenza indotta da stimolazione cronica attività contrattile (CCA) è stato effettivamente utilizzato, come può portare ad adattamenti muscolari in un periodo sostanzialmente più corto (cioè, fino a 7 giorni) e suoi effetti sembrano essere paragonabile o addirittura superiore di altri protocolli di esercizio. Inoltre, la presenza di ormonale6, temperatura7ed effetti neurologici8 può rendere difficile capire muscolo-specifiche risposte all'esercizio cronico. Ad esempio, dell'ormone tiroideo9,10 e fattore di crescita insulino-simile (IGF) -111 sono stati identificati per mediare adattamenti indotto dall'allenamento del muscolo, che possono regolare anche altre vie di segnalazione in scheletrico muscolo. In particolare, gli effetti indotti da CCA minimamente sono regolati da fattori sistemici, che permette di concentrare attenzione sulla risposta diretta del muscolo scheletrico all'attività contrattile.
L'unità esterna per CCA fu introdotto da Tyler e Wright12ed è stato sviluppato con modifiche12. In breve, l'unità si compone di tre parti principali: un rivelatore ad infrarossi che può essere attivato e disattivata tramite l'esposizione a luce infrarossa, un generatore di impulsi e un indicatore del polso (Figura 1). Il disegno di circuito dettagliate dell'unità stimolatore è stato descritto in precedenza13. Le caratteristiche dettagliate e specifiche di CCA possono essere trovate maggiore profondità in un numero di revisione articoli14,15,16,17. In breve, il protocollo di stimolazione è progettato per attivare il nervo peroneo comune a bassa frequenza (cioè, 10 Hz), e i muscoli innervati (tibiale anteriore [TA] e muscolo estensore digitorum longus [EDL]) sono costretti a contratto per un lunghezza predeterminata di tempo (ad esempio, 3-6 h). Nel corso del tempo, questo sposta i muscoli di cui sopra ad un fenotipo più aerobico, dimostrato da un aumento della densità capillare18 sia contenuto mitocondriale19,20,21. Pertanto, questo metodo è un modello collaudato di imitare alcuni degli adattamenti formazione resistenza principali all'interno del muscolo scheletrico di ratti.
Questa carta presenta una procedura dettagliata della chirurgia l'impianto dell'elettrodo per indurre CCA in modo che i ricercatori possono applicare questo modello nei loro studi di esercizio. CCA è un eccellente modello per studiare il corso di tempo degli adattamenti muscolari, fornendo così un efficace strumento per l'indagine sui vari eventi molecolari e segnalazione ad entrambi i punti tempo presto e tardi segue l'inizio dell'allenamento fisico.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles</td><td>River Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Unità di attività contrattile cronica</td> Scatola protettiva <td>per unità CCA n/a</td><td></td><td>fatta in casa</td></tr><tr><td>(3,5 x 3,5 x 2,5 cm)</td><td>Fatta in casa</td><td>n/a</td><td>La scatola deve essere realizzata in materiale opaco o coperta da un nastro opaco</td></tr><tr><td>Batterie agli ioni di litio a bottone (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>Leico Industries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>Pin a saldare (presa)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Nastro poroso</td><td>Zonas Johnson & Johnson</td><td>5104</td><td></td></tr><tr><td>Seta da sutura (Misura 5)</td><td>Ethicon</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>Seta da sutura (Misura 6)</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Forbice smussata curva (Lunghezza 11,5 cm)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbice smussata curva (lunghezza 15 cm)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche delicate (lunghezza 16 cm)</td><td>Lawton</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Asta in acciaio inox (30 cm; diametro 7 mm)</td><td>Fatta in casa</td><td>n/a</td><td>L'asta deve avere una fessura di 5 mm in un'estremità per trattenere il filo per il tunneling sotto la pelle Pinza per l'applicazione di</td></tr><tr><td>clip</td><td>KLS Martin</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>Graffe (clip)</td><td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>Ganci/divaricatore in metallo</td><td>Fatto in casa</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-iodio (500 mL)</td><td>Rougier</td><td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sodica</td><td>Novopharm</td><td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td><td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>Multimetro digitale (voltmetro)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LED stroboscopio digitale</td><td>Lutron Electronic Enterprise</td><td>DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente adattabile, poichè le proprietà biochimiche e fisiologiche sono notevolmente alterate in risposta all'esercizio cronico. Per studiare i meccanismi di fondo che portano a vari adattamenti muscolari, un numero di protocolli di esercizio come tapis roulant, ruota running e nuoto esercizio è stato utilizzato negli studi sugli animali. Tuttavia, questi modelli di esercitazione richiede un lungo periodo di tempo per raggiungere adattamenti muscolari, che possono anche essere regolamentati da fattori umorali o neurologici, limitando le loro applicazioni nello studiare gli adattamenti indotti da contrazione muscolo-specifico. La stimolazione indiretta bassa frequenza (10 Hz) per indurre l'attività contrattile cronica (CCA) è stata utilizzata come modello alternativo per l'allenamento, come correttamente può portare ad adattamenti mitocondriale muscolare entro 7 giorni, indipendente da fattori sistemici. Questa carta descrive in dettaglio le tecniche chirurgiche necessari per applicare il trattamento di CCA a muscolo scheletrico di ratti, per studi di applicazione diffusa in futuro.

Abbiamo dimostrato che l'attività contrattile cronica (CCA) è uno strumento efficace per indurre adattamenti favorevoli mitocondriali nel muscolo scheletrico. I ratti sottoposti a 7 giorni di CCA (6 h al giorno) visualizzare rafforzata la biogenesi mitocondriale nel muscolo stimolato rispetto l'arto posteriore non stimolate controlaterale (controllo). Questo aumento della biogenesi mitocondriale è indicato dall'espressione aumentata della proteina di PGC-1 α (Figura 3...

Questo protocollo descrive l'uso del modello di attività contrattile cronica di esercizio per osservare gli adattamenti indotti da stimolazione del muscolo scheletrico nell'arto posteriore del ratto.

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Il modello di attività contrattile cronica dell'esercizio è utile per studiare gli adattamenti del muscolo scheletrico agli stimoli dell'allenamento fisico in vivo. In particolare, questo modello suscita gli adattamenti fenotipici di un protocollo di allenamento di sei settimane entro sette giorni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia muscolare come la biogenesi mitocondriale, l'autofagia e molti altri adattamenti cellulari associati all'esercizio.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione degli adattamenti muscolari specifici in un breve periodo di sette giorni rispetto ad altri protocolli di allenamento che richiedono diversi mesi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'atrofia muscolare perché è stato dimostrato che la stimolazione muscolare cronica ha un effetto sul miglioramento della debolezza muscolare correlata all'invecchiamento. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di marcare il nervo peroneo comune e di attaccare bobine elettriche a entrambe le estremità poiché queste richiedono pratica e precisione.Iniziare anestetizzando il ratto con inalazione di isoflurano dall'uno al 3% con ossigeno e confermare la sedazione completa controllando la risposta a un pizzicamento del dito del piede dell'arto posteriore e osservando la profondità e la frequenza respiratoria. Applicare lubrificante oculare sugli occhi per evitare secchezza e posizionare il ratto su un termoforo a un'impostazione medio-bassa. Radere delicatamente l'arto posteriore sinistro e una striscia intorno al busto dalla parte posteriore del collo, dietro gli arti anteriori e attraverso il torace anteriore.Pulire delicatamente le aree rasate con iodio e alcol etilico per disinfettare. Con l'animale sdraiato a pancia in giù, utilizzare un bisturi sterile con una lama numero 10 per praticare una piccola incisione di circa 0,5 centimetri sulla parte posteriore del collo al centro della regione rasata. Quindi fai rotolare l'animale sul lato destro e fai un taglio di due o tre centimetri nella pelle dell'arto posteriore sinistro tra la fossetta dell'articolazione del ginocchio e vicino all'origine della coda.Usando le forbici chirurgiche curve a punta smussata, sezionare l'area sottocutanea a circa 3,5-4 centimetri, separando la pelle dal muscolo sottostante per creare una tasca tra la pelle aperta e il muscolo sottostante. Successivamente, usa le forbici chirurgiche per praticare una piccola incisione di meno di 0,5 centimetri sul muscolo bicipite femorale assicurandoti che le punte delle forbici stiano tagliando direttamente attraverso il muscolo. Quindi aprire delicatamente l'area tagliata fino a quando i gruppi muscolari interni e il nervo peroneo comune sono visibili.Prestare la massima attenzione per evitare di tagliare o danneggiare il nervo. Quindi preparare da 50 a 60 centimetri di filo di acciaio inossidabile sottile rivestito in PTFE e piegarlo a metà. Agganciare la parte piegata del filo alla fessura di un'asta di acciaio inossidabile di 30 centimetri.Usa l'asta per far passare il filo attraverso la tasca aperta dell'arto posteriore su per la gamba e lungo il centro della schiena a forma di L per raggiungere la piccola area di incisione nella parte posteriore del collo. Fissare la finestra aprendola con divaricatori metallici fino a quando la dimensione della finestra è di circa 1,5 centimetri quadrati con il nervo peroneo che si trova al centro della finestra. Usando un bisturi, spella con cura le estremità del filo di 1,5 centimetri.Avvolgi le estremità del filo spelato attorno a un ago smussato calibro 21 cinque volte per formare una bobina. Una volta che le bobine sono fatte correttamente, rilasciare l'ago da esse. Fai un nodo all'estremità della bobina e suturalo sul lato sinistro del nervo assicurandoti che la bobina sia a una distanza compresa tra 1,5 e 2,5 millimetri dal nervo.Per fissare la bobina, applicare due o tre suture aggiuntive lungo la bobina. Questo passaggio richiede notevole pratica e pazienza per evitare di danneggiare il nervo e il muscolo sottostante e per raggiungere tutte le condizioni di stimolazione coerenti in tutti gli animali. È meglio avere un ricercatore qualificato per completare tutte le procedure chirurgiche durante uno studio.Applicare due o tre gocce di soluzione antibiotica e poi suturare accuratamente la finestra utilizzando seta misura 5-0. Avvolgere senza stringere il filo rimanente e spingerlo nella tasca sottocutanea sopra l'incisione suturata del muscolo bicipite femorale sopra l'anca. Applicare due o tre gocce di soluzione antibiotica e chiudere la pelle aperta pinzando.Quindi, sposta l'animale in posizione sternale e taglia l'anello di filo che esce dall'incisione nella parte superiore del collo per creare due estremità di filo. Usando un bisturi, spellare le estremità dei fili di 0,5 centimetri. Taglia i fili sfilacciati.Spingere lentamente le parti spellate dei fili nel foro delle prese dei pin e, utilizzando un saldatore, saldare i fili sulle prese dei pin. Far passare le estremità del filo collegate a pin attraverso una garza sterile da 4,4 centimetri. Quindi far passare i fili attraverso il foro alla base della scatola dello stimolatore.Inserire i pin nelle prese di collegamento sull'unità CCA. Inserire delicatamente l'unità CCA nella camera utilizzando una puntina adesiva per fissare l'unità CCA sul fondo della camera. Utilizzare nastro sportivo o nastro chirurgico poroso per fissare la camera attorno al busto rasato.Chiudere la parte superiore della camera con tre strati di nastro adesivo. E finisci avvolgendo del nastro adesivo attorno ai lati della scatola dello stimolatore per fissare la scatola. Controllare se il CCA funziona esponendo l'unità a un singolo impulso di luce infrarossa emessa da una luce stroboscopica a infrarossi portatile.Se il CCA funziona correttamente, i muscoli degli arti posteriori si contrarranno in risposta alla luce infrarossa. Pesare gli animali poco prima di iniziare la procedura CCA per registrare una misurazione di base che aiuti a identificare eventuali stress gravi o effetti avversi dovuti alla variazione del peso corporeo dopo la procedura CCA. Il giorno della stimolazione CCA, accendere il CCA esponendo l'unità stimolatrice a un singolo impulso di luce infrarossa da una luce stroboscopica a infrarossi portatile e applicare tre o sei ore di stimolazione CCA a 10 hertz.Controllare la stimolazione e l'animale ogni 30-60 minuti. Dopo il periodo CCA desiderato, spegnere l'unità CCA tramite l'esposizione alla luce infrarossa. I ratti sottoposti a sette giorni di CCA per sei ore al giorno mostrano una maggiore biogenesi mitocondriale nel muscolo stimolato rispetto all'arto posteriore controlaterale non stimolato.Questo aumento della biogenesi mitocondriale è indicato da un aumento dell'espressione proteica di PGC-1 alfa. L'esame delle fibre muscolari permeabilizzate per misurare la capacità respiratoria mitocondriale rivela che la CCA ha provocato un aumento della capacità respiratoria massima del muscolo rispetto al muscolo di controllo. Sia le popolazioni mitocondriali subsarcolemmali che intermiofibrillari sono aumentate dopo sette giorni di CCA rispetto al muscolo non stimolato di controllo.Anche gli adattamenti al sistema autofagico e lisosomiale possono essere apportati dalla CCA. Un aumento dell'abbondanza proteica del fattore di trascrizione EB, il principale regolatore della biogenesi lisosomiale, si osserva dopo CCA in tutti i punti temporali. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le iniezioni generali sottocutanee o intraperitoneali, al fine di rispondere a ulteriori domande, come la stima del flusso autofagico con il trattamento con colchicina.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come applicare l'attuale modello di attività contrattile cronica al fine di esaminare i cambiamenti fenotipici muscolari dopo l'allenamento di resistenza.

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