Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Il modello di attività contrattile cronica dell'esercizio è utile per studiare gli adattamenti del muscolo scheletrico agli stimoli dell'allenamento fisico in vivo. In particolare, questo modello suscita gli adattamenti fenotipici di un protocollo di allenamento di sei settimane entro sette giorni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia muscolare come la biogenesi mitocondriale, l'autofagia e molti altri adattamenti cellulari associati all'esercizio.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'osservazione degli adattamenti muscolari specifici in un breve periodo di sette giorni rispetto ad altri protocolli di allenamento che richiedono diversi mesi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'atrofia muscolare perché è stato dimostrato che la stimolazione muscolare cronica ha un effetto sul miglioramento della debolezza muscolare correlata all'invecchiamento. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di marcare il nervo peroneo comune e di attaccare bobine elettriche a entrambe le estremità poiché queste richiedono pratica e precisione.

Iniziare anestetizzando il ratto con inalazione di isoflurano dall'uno al 3% con ossigeno e confermare la sedazione completa controllando la risposta a un pizzicamento del dito del piede dell'arto posteriore e osservando la profondità e la frequenza respiratoria. Applicare lubrificante oculare sugli occhi per evitare secchezza e posizionare il ratto su un termoforo a un'impostazione medio-bassa. Radere delicatamente l'arto posteriore sinistro e una striscia intorno al busto dalla parte posteriore del collo, dietro gli arti anteriori e attraverso il torace anteriore.

Pulire delicatamente le aree rasate con iodio e alcol etilico per disinfettare. Con l'animale sdraiato a pancia in giù, utilizzare un bisturi sterile con una lama numero 10 per praticare una piccola incisione di circa 0,5 centimetri sulla parte posteriore del collo al centro della regione rasata. Quindi fai rotolare l'animale sul lato destro e fai un taglio di due o tre centimetri nella pelle dell'arto posteriore sinistro tra la fossetta dell'articolazione del ginocchio e vicino all'origine della coda.

Usando le forbici chirurgiche curve a punta smussata, sezionare l'area sottocutanea a circa 3,5-4 centimetri, separando la pelle dal muscolo sottostante per creare una tasca tra la pelle aperta e il muscolo sottostante. Successivamente, usa le forbici chirurgiche per praticare una piccola incisione di meno di 0,5 centimetri sul muscolo bicipite femorale assicurandoti che le punte delle forbici stiano tagliando direttamente attraverso il muscolo. Quindi aprire delicatamente l'area tagliata fino a quando i gruppi muscolari interni e il nervo peroneo comune sono visibili.

Prestare la massima attenzione per evitare di tagliare o danneggiare il nervo. Quindi preparare da 50 a 60 centimetri di filo di acciaio inossidabile sottile rivestito in PTFE e piegarlo a metà. Agganciare la parte piegata del filo alla fessura di un'asta di acciaio inossidabile di 30 centimetri.

Usa l'asta per far passare il filo attraverso la tasca aperta dell'arto posteriore su per la gamba e lungo il centro della schiena a forma di L per raggiungere la piccola area di incisione nella parte posteriore del collo. Fissare la finestra aprendola con divaricatori metallici fino a quando la dimensione della finestra è di circa 1,5 centimetri quadrati con il nervo peroneo che si trova al centro della finestra. Usando un bisturi, spella con cura le estremità del filo di 1,5 centimetri.

Avvolgi le estremità del filo spelato attorno a un ago smussato calibro 21 cinque volte per formare una bobina. Una volta che le bobine sono fatte correttamente, rilasciare l'ago da esse. Fai un nodo all'estremità della bobina e suturalo sul lato sinistro del nervo assicurandoti che la bobina sia a una distanza compresa tra 1,5 e 2,5 millimetri dal nervo.

Per fissare la bobina, applicare due o tre suture aggiuntive lungo la bobina. Questo passaggio richiede notevole pratica e pazienza per evitare di danneggiare il nervo e il muscolo sottostante e per raggiungere tutte le condizioni di stimolazione coerenti in tutti gli animali. È meglio avere un ricercatore qualificato per completare tutte le procedure chirurgiche durante uno studio.

Applicare due o tre gocce di soluzione antibiotica e poi suturare accuratamente la finestra utilizzando seta misura 5-0. Avvolgere senza stringere il filo rimanente e spingerlo nella tasca sottocutanea sopra l'incisione suturata del muscolo bicipite femorale sopra l'anca. Applicare due o tre gocce di soluzione antibiotica e chiudere la pelle aperta pinzando.

Quindi, sposta l'animale in posizione sternale e taglia l'anello di filo che esce dall'incisione nella parte superiore del collo per creare due estremità di filo. Usando un bisturi, spellare le estremità dei fili di 0,5 centimetri. Taglia i fili sfilacciati.

Spingere lentamente le parti spellate dei fili nel foro delle prese dei pin e, utilizzando un saldatore, saldare i fili sulle prese dei pin. Far passare le estremità del filo collegate a pin attraverso una garza sterile da 4,4 centimetri. Quindi far passare i fili attraverso il foro alla base della scatola dello stimolatore.

Inserire i pin nelle prese di collegamento sull'unità CCA. Inserire delicatamente l'unità CCA nella camera utilizzando una puntina adesiva per fissare l'unità CCA sul fondo della camera. Utilizzare nastro sportivo o nastro chirurgico poroso per fissare la camera attorno al busto rasato.

Chiudere la parte superiore della camera con tre strati di nastro adesivo. E finisci avvolgendo del nastro adesivo attorno ai lati della scatola dello stimolatore per fissare la scatola. Controllare se il CCA funziona esponendo l'unità a un singolo impulso di luce infrarossa emessa da una luce stroboscopica a infrarossi portatile.

Se il CCA funziona correttamente, i muscoli degli arti posteriori si contrarranno in risposta alla luce infrarossa. Pesare gli animali poco prima di iniziare la procedura CCA per registrare una misurazione di base che aiuti a identificare eventuali stress gravi o effetti avversi dovuti alla variazione del peso corporeo dopo la procedura CCA. Il giorno della stimolazione CCA, accendere il CCA esponendo l'unità stimolatrice a un singolo impulso di luce infrarossa da una luce stroboscopica a infrarossi portatile e applicare tre o sei ore di stimolazione CCA a 10 hertz.

Controllare la stimolazione e l'animale ogni 30-60 minuti. Dopo il periodo CCA desiderato, spegnere l'unità CCA tramite l'esposizione alla luce infrarossa. I ratti sottoposti a sette giorni di CCA per sei ore al giorno mostrano una maggiore biogenesi mitocondriale nel muscolo stimolato rispetto all'arto posteriore controlaterale non stimolato.

Questo aumento della biogenesi mitocondriale è indicato da un aumento dell'espressione proteica di PGC-1 alfa. L'esame delle fibre muscolari permeabilizzate per misurare la capacità respiratoria mitocondriale rivela che la CCA ha provocato un aumento della capacità respiratoria massima del muscolo rispetto al muscolo di controllo. Sia le popolazioni mitocondriali subsarcolemmali che intermiofibrillari sono aumentate dopo sette giorni di CCA rispetto al muscolo non stimolato di controllo.

Anche gli adattamenti al sistema autofagico e lisosomiale possono essere apportati dalla CCA. Un aumento dell'abbondanza proteica del fattore di trascrizione EB, il principale regolatore della biogenesi lisosomiale, si osserva dopo CCA in tutti i punti temporali. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le iniezioni generali sottocutanee o intraperitoneali, al fine di rispondere a ulteriori domande, come la stima del flusso autofagico con il trattamento con colchicina.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come applicare l'attuale modello di attività contrattile cronica al fine di esaminare i cambiamenti fenotipici muscolari dopo l'allenamento di resistenza.