Il modello di pilocarpina di epilessia del lobo temporale e monitoraggio EEG utilizzando il sistema di radiotelemetria in topi

Questo manoscritto descrive un metodo di indurre il epilepticus di condizione di iniezione sistemica pilocarpina e di monitoraggio spontanei sequestri ricorrenti in animali vivi, utilizzando un sistema di elettroencefalogramma e telemetria wireless video. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici di epilessia cronica, nella epilettogenesi e grippaggi acuti.

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre lo stato epilettico utilizzando pilocarpina e monitorare le crisi epilettiche ricorrenti spontanee utilizzando un sistema di radiotelemetria nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiopatologici delle convulsioni acute, dell'epilettogenesi e dell'epilessia cronica. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di fornire un modello murino di epilessia cronica che mostra crisi epilettiche ricorrenti spontanee con un alto tasso di sopravvivenza dopo crisi acute.

A dimostrare la procedura sarà il Dr.Ji-Eun Kim, un postdoc nel mio laboratorio. Inizia pesando ogni topo maschio di otto settimane. Prepara due milligrammi per chilogrammo di scopolamina e terbutalina, nonché 280 milligrammi per chilogrammo di soluzione di pilocarpina.

Quindi, iniettare la soluzione per via intraperitoneale in ciascun topo e riportare i topi nelle loro gabbie. 30 minuti dopo la somministrazione di scopolamina e terbutalina, iniettare la soluzione di pilocarpina in ciascun topo. Immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina, mettere i topi in un'incubatrice a 28-30 gradi Celsius per l'osservazione.

Successivamente, monitorare il comportamento dei topi fino a quando non viene indotto lo stato epilettico, o SE. Se vengono rilevate crisi motorie limbiche che corrispondono allo stadio tre o superiore secondo la scala di Racine, registrare l'ora e monitorare i topi. Una volta che le crisi motorie continue durano più di due minuti, posizionare il topo in una nuova gabbia a temperatura ambiente e continuare a monitorare per tre ore per determinare se le convulsioni continuano e se la SE è indotta.

Quindi, terminare le crisi acute comportamentali tre ore dopo l'insorgenza di SE iniettando 10 milligrammi per chilogrammo di soluzione di diazepam. Dopo l'iniezione di diazepam, somministrare un millilitro di destrosio al 5% per singolo topo per favorire il recupero. Il primo giorno dopo l'induzione SE, pesare i topi e tenerli nell'incubatrice per un giorno in più.

Al secondo giorno dopo l'induzione SE, pesare i topi e rimetterli nella loro gabbia di casa. Fornire cibo umido per facilitare il recupero. Infine, misurare il peso corporeo giornaliero degli animali fino a sette giorni dopo la pilocarpina.

E se il peso corporeo non è aumentato, iniettare nei topi il 5% di destrosio. Preparare topi di 12 settimane, quattro settimane dopo l'induzione SE, per eseguire l'impianto di telemetria per il monitoraggio EEG. Posiziona il mouse in una cornice stereotassica con barre auricolari e una placca per morsi e applica un unguento veterinario su entrambi gli occhi per evitare la cecità.

Quindi, per mantenere le condizioni sterili durante l'intervento chirurgico, radere i siti chirurgici utilizzando una lama di rasoio e fare attenzione a prevenire la contaminazione del pelo del campo chirurgico. Dopo la rasatura, disinfettare la pelle con una soluzione di etanolo e iodio al 70%. Quindi, pulisci la pelle con tamponi di cotone imbevuti di PBS, seguiti da una soluzione di etanolo e iodio al 70%.

Fai un'incisione longitudinale al centro della testa con le forbici per esporre la lambda, il bregma e la posizione del bersaglio. Quindi, posizionare la punta del trapano su bregma e annotare le coordinate X, Y per questo punto per calcolare le coordinate per le viti. Quindi, abbassare lentamente la punta del trapano per praticare un foro di bava, facendo attenzione a evitare di inserire la punta del trapano troppo lontano nel punto in cui il cranio si assottiglia.

Inserire il corpo del trasmettitore EEG wireless a canale singolo dietro la nuca per via sottocutanea e posizionare gli elettrocateteri flessibili vicino al cranio. Quindi, posizionare una vite in acciaio inossidabile in ciascun foro di fresatura con una pinzetta e serrarla con un cacciavite ruotandola in senso orario. Assicurarsi che la vite non sia inserita troppo in profondità per evitare danni alla dura madre o ai tessuti cerebrali.

Spelare il rivestimento isolante di due millimetri dalla punta dei cavi e allungare il filo abbastanza a lungo da arrotondare l'albero della vite per un buon collegamento tra il filo e la vite. Collegare il cavo di riferimento alla vite anteriore e il cavo di registrazione alla vite nella corteccia parietale. Quindi, applicare il cemento dentale per fissare l'intero gruppo in posizione senza esporre le parti metalliche.

Infine, dopo che il cemento dentale si è asciugato, sutura la pelle e applica l'unguento topico alla mupirocina. Metti il topo in un'incubatrice a 30 gradi Celsius da solo fino a quando non si riprende dall'intervento chirurgico. Quindi, riporta il mouse nella gabbia di casa.

Inizia posizionando un mouse in una gabbia individuale e posizionando la gabbia sopra le piastre del ricevitore wireless dove è installata la gabbia di Faraday, per evitare l'interruzione dei segnali elettrici da qualsiasi fonte, inclusi un computer, linee CA e ricevitori adiacenti. Quindi, registrare l'attività elettrica utilizzando il sistema di telemetria video-EEG wireless. Determinare la frequenza delle crisi dividendo il numero totale di casi di SRS rilevati durante le due settimane per il numero totale di giorni di registrazione per ogni singolo animale.

Quindi, per analizzare la durata delle crisi, misurare il tempo dall'inizio alla fine delle attività di spiking epilettiforme. Dopo il completamento della registrazione video-EEG e la fissazione del cervello, recuperare il trasmettitore dal mouse per riutilizzarlo dopo la pulizia. Per fare ciò, rimuovere il cemento dentale attorno agli elettrocateteri usando una pinza.

Quindi, immergere la punta degli elettrocateteri con cemento dentale in acetone al 100% fino a quando il cemento dentale non si è sciolto. Quindi, rimuovere i contaminanti tissutali attorno al trasmettitore sciacquandolo con acqua distillata. Infine, sciacquare il trasmettitore con etanolo al 70% per tre ore e asciugarlo all'aria per riporlo.

A sette giorni dopo SE, le cellule picnotiche sono state rilevate nelle regioni ilari del giro dentato e nello strato cellulare piramidale del sottocampo CA3 dell'ippocampo. A sei settimane dopo SE, è stata osservata una marcata riduzione del numero di cellule ilari. Inoltre, è stata osservata una perdita neuronale nelle regioni CA1 e CA3.

Inoltre, rispetto al gruppo fittizio che mostrava attività elettrica fisiologica, il gruppo SE mostrava occasionalmente scariche epilettiformi accompagnate da comportamenti convulsivi. Un posizionamento eccessivamente profondo delle viti epidurali durante l'intervento chirurgico di impianto può indurre lesioni corticali, che possono provocare convulsioni spontanee anche negli animali manipolati in modo simulato. Una volta padroneggiato, l'induzione dello stato epilettico e l'impianto di viti possono essere eseguiti in un'ora se eseguiti correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la manifestazione comportamentale dopo l'iniezione di pilocarpina e non danneggiare i tessuti cerebrali durante l'intervento di impianto. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il test comportamentale per la memoria e i problemi motori nell'epilessia cronica, al fine di rispondere a ulteriori domande, come i problemi dei circuiti associati all'epilessia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre lo stato epilettico e monitorare le convulsioni croniche nei topi.