Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

L'obiettivo generale della combinazione di RNA-FISH nascente con la colorazione amminica di proteine latenti virali è quello di visualizzare la trascrizione attiva accoppiata alla formazione di una fabbrica di trascrizione virale. Questo metodo può essere utilizzato per aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della genetica, della biologia cellulare, della virologia e della virologia della biologia cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un modello di mini-cromosoma virale inducibile per studiare i dettagli molecolari alla base delle alterazioni architettoniche genomiche.

Raccogliere le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare le celle per due minuti a gravità di 200 Volt. Lavare le cellule tre volte con un millilitro di DEPC PBS sterile.

Quindi, risospendere le cellule in 1,2 millilitri di DEPC PBS. Posizionare i vetrini del coperchio sul fondo di una piastra a sei pozzetti. Pipettare 200 microlitri della miscela di cellule DEPC PBS su ciascun vetrino coprioggetto.

Dopo che le cellule si sono depositate per due minuti, aspirare il DEPC PBS in eccesso, lasciando solo un sottile strato di cellule. Aggiungere con cautela un millilitro di soluzione fissante a ciascun vetrino coprioggetto. Lasciare che le celle si fissino per 10 minuti.

Lavare i vetrini coprioggetto tre volte con DEPC PBS. Dopo il lavaggio, aggiungere con cura un millilitro di glicina DEPC PBS a una concentrazione finale di glicina di 100 millimolari su ciascun vetrino coprioggetti. Lasciare che le cellule si estinguano per cinque minuti.

Aggiungere 1,5 millilitri di DEPC PBS e porre su uno shaker per cinque minuti, quindi agitare con decisione ma delicatamente con la mano per un minuto. Aspirare il DEPC PBS in eccesso e fare attenzione a non distruggere le cellule. Aggiungere con cautela un millilitro di soluzione permeabilizzante a ciascun vetrino coprioggetti.

Lasciare permeabilizzare le cellule per 15 minuti. Aggiungere 1,5 millilitri di DEPC PBS. Mettere le cellule su uno shaker per cinque minuti e agitare con decisione ma delicatamente con la mano per un minuto.

Aspirare il DEPC PBS in eccesso e fare attenzione a non distruggere le cellule. Etichettare i vetrini del microscopio e inumidire un tovagliolo di carta, quindi foderare il fondo di un contenitore di plastica sigillabile con l'asciugamano. Successivamente, preparare la soluzione di anticorpi primari e moltiplicare la ricetta per ogni vetrino coprioggetto presente.

Posizionare 30 microlitri di soluzione di anticorpi primari su ciascun vetrino da microscopio marcato. Assicurarsi che la concentrazione di anticorpi primari sia corretta tenendo premuto l'angolo del vetrino coprioggetti e muovendolo delicatamente. Inoltre, l'angolo di un fazzoletto può essere utilizzato per assorbire l'umidità in eccesso.

Quindi posizionare il vetrino coprioggetto sui vetrini del microscopio etichettati, facendo attenzione a non introdurre bolle. Copri l'esterno del contenitore con pellicola trasparente. Spostare il contenitore in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per un'ora.

Durante l'incubazione, preparare i reagenti necessari. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con DEPC PBS in una piastra a sei pozzetti per cinque minuti ciascuna. Quindi, lavare le celle con il tampone di lavaggio FISH tre volte per cinque minuti ciascuna.

E conservare il vetrino coprioggetto nel tampone di lavaggio FISH fino a quando non è stata preparata l'anticorpo secondario, una miscela di sonda intronica. Quindi, pulire i vetrini per l'incubazione degli anticorpi primari per l'ibridazione con acqua saponata. Dopo che sono asciutti, puliscili con etanolo e un fazzoletto di laboratorio.

Posizionare 40 microlitri dell'anticorpo secondario e della sonda intronica FISH con la soluzione su ciascun vetrino. Posizionare i vetrini coprioggetto con le celle sui vetrini con il lato delle celle rivolto verso il basso sopra il tampone. E fai attenzione a non introdurre bolle.

Metti i vetrini in un contenitore di plastica con un tovagliolo di carta umido sul fondo. Avvolgere il contenitore di plastica prima nella pellicola trasparente, quindi in un foglio di alluminio. E incubare il contenitore con i vetrini.

Dopo l'incubazione, far scorrere con cautela il vetrino coprioggetto dal bordo del vetrino e riposizionarlo in piastre a sei pozzetti, rivolte verso l'alto. Lavare le celle con il tampone di lavaggio FISH tre volte in una piastra a sei pozzetti per cinque minuti ciascuna. Quindi, lavare le celle due volte con SSC a due pieghe.

Aggiungere DAPI a una concentrazione da uno a 1000 nel doppio SSC e lasciare riposare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle due volte con SSC a due pieghe. Pulire i vetrini utilizzati per l'ibridazione e aggiungere 10 microlitri di soluzione di montaggio sui vetrini.

Posizionare i vetrini copricoperchio a faccia in giù sulla soluzione di montaggio. Con un fazzoletto di laboratorio, rimuovere delicatamente la soluzione di montaggio in eccesso, facendo attenzione a non schiacciare le cellule. Usando lo smalto per unghie, applicare un ampio strato attorno al bordo dei vetrini coprioggetti e lasciare asciugare lo smalto.

Il campione è ora pronto per la microscopia a fluorescenza. Le cellule BCBL-1 sono state colorate per l'RNA LANA e K-Rta per esaminare dove si trovano gli episomi virali che trascrivono attivamente e l'eterogeneità della risposta all'Herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi, o agli stimoli di riattivazione KSHV. La distinta fluorescenza K-Rta nelle regioni che corrispondono strettamente alla distribuzione degli episomi virali è la prova che la trascrizione attiva avviene vicino ai genomi KSHV.

Nello stesso campione, si possono osservare cellule che mostrano una fluorescenza K-Rta molto più debole e diffusa che non si sovrappone significativamente a LANA, illustrando la notevole variazione e il grado di risposta agli stimoli di riattivazione all'interno di una popolazione di cellule. Successivamente, è stata esaminata l'efficacia della sincronizzazione della timidina visualizzando l'espressione della proteina virale che ha dimostrato chiaramente che le cellule sincronizzate rispondevano maggiormente agli stimoli di riattivazione rispetto alla popolazione non sincronizzata. La colorazione DAPI può svolgere diverse funzioni, questo esempio mostra chiaramente che ci sono tre celle separate invece di una.

La microscopia 3D insieme a questa tecnica ha rivelato strutture RNA PII ad anello osservate con genomi KSHV punteggiati alla periferia. Con il suo sviluppo, il mini cromosoma virale fornirebbe strumenti unici ai ricercatori per esplorare la speciale organizzazione temporale dell'espressione genica e la regressione del nucleo cellulare.