Sviluppo di un test In Vitro per quantificare progenitrici e staminali ematopoietiche cellule (HSPCs) nello sviluppo di embrioni di Zebrafish

L'obiettivo generale di questo test è quello di enumerare ed esaminare la differenziazione delle cellule progenitrici ematopoietiche nell'embrione di zebrafish in via di sviluppo. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande davvero importanti nel campo ematopoietico, come ad esempio, quante cellule staminali e progenitrici ci sono effettivamente in un embrione di zebrafish in via di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, è relativamente economica ed è facile da eseguire.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul numero di progenitori presenti nel pesce zebra in via di sviluppo, consente anche ai ricercatori di misurare l'effetto funzionale che un farmaco o una mutazione genetica ha sulla formazione dei progenitori del sangue. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo, quando stavamo abbattendo i geni che ipotizzavamo fossero cruciali per lo sviluppo del sangue. Abbiamo previsto che saremmo stati in grado di misurare la differenza tra gli embrioni in via di sviluppo normale e quelli che erano mormoranti con questo test.

Per sbiancare gli embrioni di zebrafish, utilizzare contenitori di plastica per creare tre stazioni di lavaggio, di cui una contenente un millilitro di candeggina al cinque percento per un litro di E3 e due stazioni contenenti E3 sterile. Con una pipetta di trasferimento, mettere gli embrioni in un colino da tè e immergerli nella stazione di lavaggio numero uno per cinque minuti. Quindi trasferisci il colino da tè con gli embrioni nella stazione di lavaggio numero due per cinque minuti. Ripetere per la stazione di lavaggio numero tre per gli ultimi cinque minuti.

Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovi gli embrioni dal colino da tè capovolgendolo su una capsula di Petri pulita di 10 centimetri e usa una pipetta di trasferimento e un E3 sterile per sciacquare delicatamente gli embrioni dal colino. Per deteroionare gli embrioni, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere e scartare la quantità di E3 possibile dalla capsula di Petri. Quindi aggiungere 500 microlitri di prodea di decorionazione agli embrioni e incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi, picchiettare delicatamente il lato della capsula di Petri per rimuovere completamente i corioni. Quindi, con una pipetta sierologica, aggiungere 20 millilitri di E3 sterile per diluire i prodei. Lasciare che gli embrioni si depositino e utilizzare una pipetta per rimuovere l'E3. Ripetere questa fase di lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce dei prodei di decorionazione.

Per preparare i campioni di embrioni, utilizzare una pipetta per inserire 10 embrioni in un'unica provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, pipettare con cura l'E3 e gettarlo. Trasferire i campioni in una cappa a flusso laminare e lavare gli embrioni aggiungendo un millilitro di E3 sterile, consentendo agli embrioni di depositarsi sul fondo della provetta.

Quindi, utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di tre lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere l'E3 e gettarlo.

Quindi aggiungere un millilitro di DTT da 10 millimolari in E3 per rimuovere il rivestimento del muco e qualsiasi spora, lievito o batterio che potrebbe essere intrappolato in esso che circonda gli embrioni. A questo punto, adagiare la provetta per microcentrifuga orizzontalmente e incubarla a temperatura ambiente per 25 minuti. Per dissociare gli embrioni, utilizzare un millilitro di DPBS sterile per lavare il campione tre volte.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di DPBS con calcio e magnesio e cinque microlitri di prodeas di dissociazione da cinque milligrammi per millilitro. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius su un agitatore orbitale orizzontale a 180 giri/min per 60 minuti. Quindi, posizionare i campioni e la cappa a flusso laminare e utilizzare un P1000 per triturare gli embrioni fino a quando i campioni non sono completamente dissociati.

Prestare attenzione e controllare periodicamente gli embrioni per determinare quando sono dissociati. Vuoi che sia presente del tessuto. È possibile digerire eccessivamente gli embrioni, il che distruggerà le cellule progenitrici.

Pipettare i 10 embrioni dissociati sul serbatoio superiore di una provetta inferiore rotonda in polistirene da cinque millilitri con un tappo filtrante da 35 micrometri. Con una pipetta e un PBS sterile, sciacquare la provetta per embrioni e trasferire la soluzione nella provetta da cinque millilitri di polistirene contenente cellule filtrate. Ripetere il risciacquo fino a quando non sono presenti quattro millilitri di liquido nel tubo.

Centrifugare le provette a 300 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti per pallettizzare il campione di cellule omogeneizzato. Con una pipetta, rimuovere ed eliminare il surnatante dal tubo inferiore rotondo, facendo attenzione a non distruggere le cellule pellettate sul fondo. Quindi utilizzare 100 microlitri di PBS per risospendere le cellule.

Preparare una soluzione madre completa di metilcellulosa e utilizzare siringhe da tre millilitri e aghi da 16 calibri per aggiungere 2,5 millilitri di provette sterili da 14 millilitri a fondo tondo. Utilizzare una provetta per ogni condizione testata. Per la differenziazione mieloide, aggiungere l'uno per cento di siero di carpa e 0,3 milligrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di granulociti di pesce zebra ricombinante o GCSF al terreno di metilcellulosa.

Per la differenziazione eritroide, aggiungere l'uno per cento di siero di carpa e 0,1 milligrammi per millilitro di eritropoietina o EPO ricombinante di zebrafish al terreno di metilcellulosa. Per esaminare i progenitori multi-lignaggio, aggiungere EPO e GCSF. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 microlitri dei 10 embrioni dissociati sulla superficie della metilcellulosa preparata con le citochine ricombinanti nel siero di carpa.

Tappare il coperchio e vorticare delicatamente per omogeneizzare completamente il campione. Ogni provetta dovrebbe ora contenere il tessuto dissociato di 10 embrioni. Utilizzando siringhe da tre millilitri e aghi da 16 calibri, aliquotare un millilitro di campione in due piastre di Petri separate da 35 millimetri.

Assicurarsi che il campione sia completamente disperso in tutta la capsula di Petri. Ripetere l'operazione per ogni campione. Posizionare le piastre di Petri da 35 millimetri con le cellule e la metilcellulosa in una capsula di Petri da 15 centimetri.

A ogni piastra grande, aggiungere una piastra da 35 millimetri con cinque millilitri di acqua sterile per umidificare i campioni. Incubare le piastre a 32 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per sette-10 giorni. Infine, visualizza le unità formanti la colonia secondo il protocollo di testo.

Dopo sette giorni di coltura con fattori di supporto ematopoietici, sono stati contati e analizzati i progenitori di 48 pesci zebra embrionali HPF. È importante sottolineare che la quantità di FC utilizzata è direttamente correlata al numero di embrioni placcati. La placcatura di quattro o otto embrioni per millilitro, che è correlata all'inizio con 10 o 20 embrioni, all'inizio dell'esperimento, produce rispettivamente circa 1200 o 2400 CFU.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non digerire eccessivamente gli embrioni in quanto ciò distruggerà le cellule progenitrici. Con questa procedura, è possibile confrontare il numero di progenitori presenti in diversi punti temporali.

È possibile confrontare gli animali mutanti con gli animali selvatici e testare l'effetto dei farmaci sullo sviluppo del sangue. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di metilcellulosa per enumerare i progenitori ematopoietici del pesce zebra. È possibile modificare questa procedura per adattarla alle proprie specifiche esigenze sperimentali, come il test di citochine specifiche.

Non dimenticare che lavorare con sangue e aghi di vertebrati può essere estremamente pericoloso e bisogna sempre prestare attenzione quando si esegue questo test.