Name: Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Scopri l'isolamento del DNA robusto e la costruzione della libreria per il sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario. Questo metodo consente di utilizzare campioni storici degradati per studi filogenomici senza campionamento distruttivo estensivo.

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Ringraziamo Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock per assistenza negli esemplari di erbario di campionamento e il giardino botanico del Missouri per l'accesso agli esemplari di erbario per campionamento distruttivo. Questo lavoro è stato supporto da una sovvenzione della National Science Foundation (DEB-1457748).

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</ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nessun interessi concorrenti.

Il protocollo presentato qui è un metodo completo e robusto per isolamento del DNA e sequenziamento preparazione libreria dagli esemplari di piante essiccate. La consistenza del metodo e minima necessità di modificarla basata su esemplare qualità rendono esso scalabile per progetti di grande erbario di sequenziamento. L'inclusione di un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento permette l'inclusione di bassa qualità, quantità di basso, rara o storicamente importanti campioni che altrimenti non sare...

Erbario collezioni sono una fonte potenzialmente importante di entrambe le specie e diversità genomica per studi compreso phylogenetics1,2,3, genetica delle popolazioni4,5, conservazione biologia6, specie invasive biologia7e tratto evolution8. La capacità di ottenere una ricca diversità di specie, popolazioni, luoghi geografici e punti di tempo mette in evidenza il "forziere"9 che è l'erbario. Storicamente, la natura degradata del DNA erbario-derivato ha ostacolato progetti basati su PCR, relegando spesso i ricercatori a usando solo gli indicatori trovati in alta copia, quali le regioni del genoma del cloroplasto o il distanziatore interno trascritto (ITS) della ribosomiale RNA. Qualità dei campioni e DNA variano ampiamente basata su metodi di conservazione9,10, con rotture a doppio filamento e la frammentazione da calore utilizzato nel processo di essiccazione, essendo le forme più comuni di danno, creando il cosiddetto 90% DNA di lock-up che ha gravato studi basati su PCR11. A parte la frammentazione, il problema secondo più prevalente in erbario genomica è contaminazione, come quello derivato da funghi endofiti13 o funghi acquisito post mortem dopo la raccolta, ma prima di montare nell'erbario12, però Questo problema può essere risolto bioinformatically dato il database proprio fungo (Vedi sotto). Un terzo problema, meno comune, è modifica di sequenza attraverso citosina deaminazione (C/G→T/A)14, anche se si stima essere bassa (~ 0,03%) in campioni di erbario11. Con l'avvento di sequenziatori di alto-rendimento (HTS), il problema di frammentazione può essere superato con brevi letture e sequenziamento profondità12,15, permettendo l'acquisizione di dati a livello genomico dalle numerosi esemplari con bassa qualità DNA e a volte anche permettendo di sequenziamento del genoma intero15.
I campioni di erbario stanno diventando sempre più frequentemente utilizzati e una maggiore componente di filogenetica progetti16. Una sfida attuale della utilizzando campioni di erbario per HTS è costantemente ottenere sufficiente DNA a doppia elica, un prerequisito indispensabile per protocolli di sequenziamento, da numerose specie in modo tempestivo, senza la necessità di ottimizzare i metodi per individuo esemplari. In questa carta, un protocollo per l'estrazione di DNA e preparazione di libreria di campioni di erbario è dimostrato che si avvale dei metodi esistenti e li modifica per consentire risultati veloci e replicabili. Questo metodo consente completo elaborazione da esemplare a una libreria di 24 campioni in 13 h, con tempo di preparazione manuale h 8, o 16 h, con hands-on tempo h 9, quando è richiesto il passaggio opzionale reamplification. Elaborazione simultanea di più campioni è realizzabile, anche se il fattore limitante è la capacità della centrifuga e abilità tecnica. Il protocollo è progettato per richiedere solo attrezzature tipici del laboratorio (termociclatore, centrifuga e supporti magnetici) invece di attrezzature specializzate, come un nebulizzatore o un sonicatore, per la tosatura del DNA.
Qualità del DNA, la dimensione del frammento e la quantità sono fattori per l'utilizzo di campioni di erbario a esperimenti di sequenziamento ad alta velocità limitanti. Altri metodi per isolare il DNA di erbario e creazione di librerie di sequenziamento ad alte prestazioni hanno dimostrato l'utilità dell'utilizzo di appena 10 ng di DNA16; Tuttavia hanno bisogno di determinare sperimentalmente il numero ottimale di PCR cicli necessari per la preparazione di biblioteca. Questo diventa impraticabile quando trattare con estremamente piccole quantità di vitali double stranded DNA (dsDNA), come alcuni esemplari di erbario producono solo abbastanza DNA per una preparazione unica libreria. Il metodo presentato qui utilizza un singolo numero di cicli indipendentemente dalla qualità del campione, quindi nessun DNA si perde nelle fasi di ottimizzazione biblioteca. Invece, un passo di reamplification viene richiamato quando le librerie non soddisfano gli importi minimi necessari per la sequenza. Molti campioni di erbario sono rari e possiedono poco materiale che lo rende difficile da giustificare campionamento distruttivo in molti casi. Per contrastare ciò, il protocollo presentato permette di dsDNA ingresso taglie meno di 1,25 ng nel processo di preparazione di biblioteca, ampliando l'ambito dei campioni praticabili per high throughput sequenziamento e riducendo al minimo la necessità di campionamento distruttivo degli esemplari.
Il seguente protocollo è stato ottimizzato per erbe e testato su centinaia di specie diverse dai campioni di erbario, anche se ci aspettiamo che il protocollo può essere applicato a molti altri gruppi di piante. Esso comprende un passaggio di ripristino opzionale che può essere utilizzato per salvare bassa qualità e/o rari esemplari. Questo protocollo basato su oltre duecento esemplari di erbario testati, funziona sugli esemplari con tessuto basso input e qualità, consentendo la conservazione di esemplari rari tramite campionamento distruttivo minimo. Qui è indicato che questo protocollo può fornire librerie di alta qualità che possono essere ordinati in sequenza per progetti basati su phylogenomics.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark digitale per bagno secco</td> Sistema <td>di</td><td></td> elettroforesi BSH1001 <td></td>scientifica</tr><tr><td></td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (acqua ultra pura)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Tubo DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porcellana</td></tr><tr><td>Pestello</td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td></td></tr><tr><td>porcellana Provette da centrifuga</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Provette per saggi Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a striscia da 0,2 ml e tappo per PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido Conservazione</td> <td>a breve termineNalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Supporto ad anello magnetico&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Agitatori a piastra calda</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x tampone TE</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml soluzione</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamilico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarosio</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit di test DSDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>colorante di caricamento in gel ultra puro viola (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit per Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos per Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fenolica</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Sabbia silicea</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Primer di riamplificazione</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>vedi testo</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>Codici Genetici</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento del dna robusto e costruzione della libreria high-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Gli erbari sono una preziosa fonte di materiale vegetale che può essere utilizzato in una varietà di studi biologici. L'uso di campioni di erbario è associato con una serie di sfide tra cui qualità di conservazione del campione, DNA degradato e campionamento distruttivo di rari esemplari. Per poter utilizzare in modo più efficace materiale di erbario in progetti di sequenziamento di grandi dimensioni, è necessario un metodo affidabile e scalabile di preparazione di isolamento e libreria di DNA. Questa carta dimostra un protocollo robusto, inizio-to-end per DNA alto-rendimento e isolamento costruzione della libreria da esemplari che non richiedono la modifica di singoli campioni. Questo protocollo è su misura per la bassa qualità secchi pianta materiale e approfitta dei metodi esistenti ottimizzando tessuto rettifica, modifica selezione dimensione biblioteca ed introducendo un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento. Reamplification di librerie di basso rendimento del DNA può salvare i campioni provenienti da campioni di erbario potenzialmente preziosi e insostituibili, negando la necessità per ulteriore campionamento distruttivo e senza introdurre bias di sequenziamento discernibile per comune applicazioni filogenetiche. Il protocollo è stato testato su centinaia di specie di erba, ma dovrebbe essere adatto per l'impiego in altri lignaggi pianta dopo la verifica. Questo protocollo può essere limitato dal DNA estremamente degradato, dove non esistono frammenti nel campo dimensione desiderata, e di metaboliti secondari presenti in alcuni materiale vegetale che inibiscono pulito isolamento del DNA. Nel complesso, questo protocollo introduce un metodo veloce e completo che permette di isolamento del DNA e preparazione della biblioteca di 24 campioni in meno di 13 ore, con solo 8 h di tempo attivo hands-on con modifiche minime.

Isolamento del DNA e la resa finale biblioteca In questo studio, l'efficacia del protocollo per l'isolamento del DNA di erbario e al recupero delle librerie di sequenziamento di alta qualità è stata dimostrata utilizzando cinquanta diversi campioni con la più antica dal 1920 e il più giovane dal 2012 (tabella 2). Per ogni campione, circa 10 mg di tessuto fogliare è stato usato per isolamento del DNA. Più verde tessuto fogliare è stato favorito se dispo...

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di aumentare la quantità di DNA isolato a doppio filamento e le successive librerie di sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario, massimizzando la loro utilità negli studi filogenomici. Questo metodo sblocca il potenziale dei campioni di erbario che altrimenti non sarebbero utili per i progetti di sequenziamento come sequenze genomiche a causa dell'estesa degradazione dei campioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è abbastanza robusta da consentire l'utilizzo di campioni di erbario rari e storicamente significativi senza la necessità di un ampio campionamento distruttivo.Questa tecnica estende la profondità del campionamento dei taxon in progetti sistematici distanziati. L'acquisizione delle specie è un passo limitante, ma con questo protocollo, le collezioni storiche possono essere facilmente utilizzate in questi studi. Aggiungere azoto liquido e da 30 a 50 milligrammi di sabbia sterilizzata per macinare un centimetro quadrato di tessuto erbario preselezionato in polvere fine in mortaio e pestello pre-raffreddati.Un'adeguata macinazione è essenziale per il successo dell'isolamento del DNA. E bisogna f

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L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Viene presentato il confronto e l'ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Gel-seq consente ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per entrambi DNA - e RNA-seq trascurabile costo aggiunto a partire da 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate.

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

Contaminazione durante il sequenziamento genomico di organismi microscopici rimane un grande problema. Qui, vi mostriamo un metodo per sequenziare il genoma di un Tardigrada da un singolo esemplare con appena 50 pg di DNA genomic senza amplificazione intero genoma per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Lungo-ha letto sequenze notevolmente facilitano l'assemblaggio di complessi genomi e caratterizzazione di variazione strutturale. Descriviamo un metodo per generare sequenze ultra-lunghi di piattaforme nanopore di sequenziamento. L'approccio adotta un'estrazione di DNA ottimizzata seguita da preparazioni di libreria modificata per generare centinaia di kilobase letture con moderata copertura da cellule umane.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Questo protocollo descrive un approccio completo per la coltura, il sequenziamento e l'assemblaggio del genoma ibrido de novo dei batteri urinari. Fornisce una procedura riproducibile per la generazione di sequenze genomiche circolari complete utili nello studio di elementi genetici sia cromosomici che extracromosomiali che contribuiscono alla colonizzazione urinaria, alla patogenesi e alla diffusione della resistenza antimicrobica.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

La fattibilità e l'efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un'era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.

Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Il presente protocollo descrive l'uso della tecnologia di codifica a barre del DNA per autenticare materiali medicinali di origine vegetale e la pianta medicinale Angelica sinensis (Oliv.) Diels è stato identificato come esempio.

Applicazione del DNA Barcoding per identificare le piante medicinali

Scopri l'isolamento del DNA robusto e la costruzione della libreria per il sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario. Questo metodo consente di utilizzare campioni storici degradati per studi filogenomici senza campionamento distruttivo estensivo.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

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