Name: Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Scopri l'isolamento del DNA robusto e la costruzione della libreria per il sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario. Questo metodo consente di utilizzare campioni storici degradati per studi filogenomici senza campionamento distruttivo estensivo.

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Ringraziamo Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock per assistenza negli esemplari di erbario di campionamento e il giardino botanico del Missouri per l'accesso agli esemplari di erbario per campionamento distruttivo. Questo lavoro è stato supporto da una sovvenzione della National Science Foundation (DEB-1457748).

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</ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nessun interessi concorrenti.

Il protocollo presentato qui è un metodo completo e robusto per isolamento del DNA e sequenziamento preparazione libreria dagli esemplari di piante essiccate. La consistenza del metodo e minima necessità di modificarla basata su esemplare qualità rendono esso scalabile per progetti di grande erbario di sequenziamento. L'inclusione di un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento permette l'inclusione di bassa qualità, quantità di basso, rara o storicamente importanti campioni che altrimenti non sare...

Erbario collezioni sono una fonte potenzialmente importante di entrambe le specie e diversità genomica per studi compreso phylogenetics1,2,3, genetica delle popolazioni4,5, conservazione biologia6, specie invasive biologia7e tratto evolution8. La capacità di ottenere una ricca diversità di specie, popolazioni, luoghi geografici e punti di tempo mette in evidenza il "forziere"9 che è l'erbario. Storicamente, la natura degradata del DNA erbario-derivato ha ostacolato progetti basati su PCR, relegando spesso i ricercatori a usando solo gli indicatori trovati in alta copia, quali le regioni del genoma del cloroplasto o il distanziatore interno trascritto (ITS) della ribosomiale RNA. Qualità dei campioni e DNA variano ampiamente basata su metodi di conservazione9,10, con rotture a doppio filamento e la frammentazione da calore utilizzato nel processo di essiccazione, essendo le forme più comuni di danno, creando il cosiddetto 90% DNA di lock-up che ha gravato studi basati su PCR11. A parte la frammentazione, il problema secondo più prevalente in erbario genomica è contaminazione, come quello derivato da funghi endofiti13 o funghi acquisito post mortem dopo la raccolta, ma prima di montare nell'erbario12, però Questo problema può essere risolto bioinformatically dato il database proprio fungo (Vedi sotto). Un terzo problema, meno comune, è modifica di sequenza attraverso citosina deaminazione (C/G→T/A)14, anche se si stima essere bassa (~ 0,03%) in campioni di erbario11. Con l'avvento di sequenziatori di alto-rendimento (HTS), il problema di frammentazione può essere superato con brevi letture e sequenziamento profondità12,15, permettendo l'acquisizione di dati a livello genomico dalle numerosi esemplari con bassa qualità DNA e a volte anche permettendo di sequenziamento del genoma intero15.
I campioni di erbario stanno diventando sempre più frequentemente utilizzati e una maggiore componente di filogenetica progetti16. Una sfida attuale della utilizzando campioni di erbario per HTS è costantemente ottenere sufficiente DNA a doppia elica, un prerequisito indispensabile per protocolli di sequenziamento, da numerose specie in modo tempestivo, senza la necessità di ottimizzare i metodi per individuo esemplari. In questa carta, un protocollo per l'estrazione di DNA e preparazione di libreria di campioni di erbario è dimostrato che si avvale dei metodi esistenti e li modifica per consentire risultati veloci e replicabili. Questo metodo consente completo elaborazione da esemplare a una libreria di 24 campioni in 13 h, con tempo di preparazione manuale h 8, o 16 h, con hands-on tempo h 9, quando è richiesto il passaggio opzionale reamplification. Elaborazione simultanea di più campioni è realizzabile, anche se il fattore limitante è la capacità della centrifuga e abilità tecnica. Il protocollo è progettato per richiedere solo attrezzature tipici del laboratorio (termociclatore, centrifuga e supporti magnetici) invece di attrezzature specializzate, come un nebulizzatore o un sonicatore, per la tosatura del DNA.
Qualità del DNA, la dimensione del frammento e la quantità sono fattori per l'utilizzo di campioni di erbario a esperimenti di sequenziamento ad alta velocità limitanti. Altri metodi per isolare il DNA di erbario e creazione di librerie di sequenziamento ad alte prestazioni hanno dimostrato l'utilità dell'utilizzo di appena 10 ng di DNA16; Tuttavia hanno bisogno di determinare sperimentalmente il numero ottimale di PCR cicli necessari per la preparazione di biblioteca. Questo diventa impraticabile quando trattare con estremamente piccole quantità di vitali double stranded DNA (dsDNA), come alcuni esemplari di erbario producono solo abbastanza DNA per una preparazione unica libreria. Il metodo presentato qui utilizza un singolo numero di cicli indipendentemente dalla qualità del campione, quindi nessun DNA si perde nelle fasi di ottimizzazione biblioteca. Invece, un passo di reamplification viene richiamato quando le librerie non soddisfano gli importi minimi necessari per la sequenza. Molti campioni di erbario sono rari e possiedono poco materiale che lo rende difficile da giustificare campionamento distruttivo in molti casi. Per contrastare ciò, il protocollo presentato permette di dsDNA ingresso taglie meno di 1,25 ng nel processo di preparazione di biblioteca, ampliando l'ambito dei campioni praticabili per high throughput sequenziamento e riducendo al minimo la necessità di campionamento distruttivo degli esemplari.
Il seguente protocollo è stato ottimizzato per erbe e testato su centinaia di specie diverse dai campioni di erbario, anche se ci aspettiamo che il protocollo può essere applicato a molti altri gruppi di piante. Esso comprende un passaggio di ripristino opzionale che può essere utilizzato per salvare bassa qualità e/o rari esemplari. Questo protocollo basato su oltre duecento esemplari di erbario testati, funziona sugli esemplari con tessuto basso input e qualità, consentendo la conservazione di esemplari rari tramite campionamento distruttivo minimo. Qui è indicato che questo protocollo può fornire librerie di alta qualità che possono essere ordinati in sequenza per progetti basati su phylogenomics.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark digitale per bagno secco</td> Sistema <td>di</td><td></td> elettroforesi BSH1001 <td></td>scientifica</tr><tr><td></td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (acqua ultra pura)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Tubo DNA LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porcellana</td></tr><tr><td>Pestello</td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td></td></tr><tr><td>porcellana Provette da centrifuga</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Provette per saggi Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a striscia da 0,2 ml e tappo per PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido Conservazione</td> <td>a breve termineNalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Supporto ad anello magnetico&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 pozzetti&nbsp;</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Agitatori a piastra calda</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x tampone TE</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml soluzione</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamilico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarosio</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sale disodico</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit di test DSDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>colorante di caricamento in gel ultra puro viola (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit per Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos per Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fenolica</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Sabbia silicea</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Primer di riamplificazione</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>vedi testo</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>Codici Genetici</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento del dna robusto e costruzione della libreria high-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Gli erbari sono una preziosa fonte di materiale vegetale che può essere utilizzato in una varietà di studi biologici. L'uso di campioni di erbario è associato con una serie di sfide tra cui qualità di conservazione del campione, DNA degradato e campionamento distruttivo di rari esemplari. Per poter utilizzare in modo più efficace materiale di erbario in progetti di sequenziamento di grandi dimensioni, è necessario un metodo affidabile e scalabile di preparazione di isolamento e libreria di DNA. Questa carta dimostra un protocollo robusto, inizio-to-end per DNA alto-rendimento e isolamento costruzione della libreria da esemplari che non richiedono la modifica di singoli campioni. Questo protocollo è su misura per la bassa qualità secchi pianta materiale e approfitta dei metodi esistenti ottimizzando tessuto rettifica, modifica selezione dimensione biblioteca ed introducendo un passo opzionale reamplification per librerie di basso rendimento. Reamplification di librerie di basso rendimento del DNA può salvare i campioni provenienti da campioni di erbario potenzialmente preziosi e insostituibili, negando la necessità per ulteriore campionamento distruttivo e senza introdurre bias di sequenziamento discernibile per comune applicazioni filogenetiche. Il protocollo è stato testato su centinaia di specie di erba, ma dovrebbe essere adatto per l'impiego in altri lignaggi pianta dopo la verifica. Questo protocollo può essere limitato dal DNA estremamente degradato, dove non esistono frammenti nel campo dimensione desiderata, e di metaboliti secondari presenti in alcuni materiale vegetale che inibiscono pulito isolamento del DNA. Nel complesso, questo protocollo introduce un metodo veloce e completo che permette di isolamento del DNA e preparazione della biblioteca di 24 campioni in meno di 13 ore, con solo 8 h di tempo attivo hands-on con modifiche minime.

Isolamento del DNA e la resa finale biblioteca In questo studio, l'efficacia del protocollo per l'isolamento del DNA di erbario e al recupero delle librerie di sequenziamento di alta qualità è stata dimostrata utilizzando cinquanta diversi campioni con la più antica dal 1920 e il più giovane dal 2012 (tabella 2). Per ogni campione, circa 10 mg di tessuto fogliare è stato usato per isolamento del DNA. Più verde tessuto fogliare è stato favorito se dispo...

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di aumentare la quantità di DNA isolato a doppio filamento e le successive librerie di sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario, massimizzando la loro utilità negli studi filogenomici. Questo metodo sblocca il potenziale dei campioni di erbario che altrimenti non sarebbero utili per i progetti di sequenziamento come sequenze genomiche a causa dell'estesa degradazione dei campioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è abbastanza robusta da consentire l'utilizzo di campioni di erbario rari e storicamente significativi senza la necessità di un ampio campionamento distruttivo.Questa tecnica estende la profondità del campionamento dei taxon in progetti sistematici distanziati. L'acquisizione delle specie è un passo limitante, ma con questo protocollo, le collezioni storiche possono essere facilmente utilizzate in questi studi. Aggiungere azoto liquido e da 30 a 50 milligrammi di sabbia sterilizzata per macinare un centimetro quadrato di tessuto erbario preselezionato in polvere fine in mortaio e pestello pre-raffreddati.Un'adeguata macinazione è essenziale per il successo dell'isolamento del DNA. E bisogna fare attenzione che il campione sia completamente polverizzato. Quindi, aggiungi la polvere congelata in due tubi da due millilitri, riempiendo non più della metà del volume del tubo.Quindi aggiungere 600 microlitri di soluzione CTAB calda in ogni provetta. Mescolare accuratamente la polvere invertendo e vorticando. Quindi incubare i campioni in un bagno d'acqua mantenuto a 65 gradi Celsius per una o 1,5 ore.Nel frattempo, vortice ogni 15 minuti. Quindi centrifugare i campioni a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, trasferire circa 500 microlitri di surnatante in un nuovo set di provette etichettate.Al surnatante, aggiungere quattro microlitri di 10 milligrammi per millilitro di RNasi A a ciascun brano. Quindi miscelare il contenuto della provetta capovolgendo o pipettando. Incubare i campioni in un blocco termico o in un bagno d'acqua mantenuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Una volta che le provette hanno raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere ai campioni circa 500 microlitri di miscela di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico 25:24:1. Quindi miscelare il contenuto delle provette invertendo o pipettando ripetutamente. Quindi centrifugare i campioni a 12.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.Trasferire lo strato acquoso superiore, che è di circa 400 microlitri, in un nuovo set di provette etichettate. Allo strato acquoso di ogni provetta, aggiungere circa 400 microlitri di cloroformio 24:1, miscela di alcol isoamilico. Miscelare accuratamente il campione mediante pipettaggio o inversione ripetuti.Quindi centrifugare le provette a 12.000 g per cinque minuti e trasferire circa 300 microlitri di strato acquoso superiore in provette pre-raffreddate ed etichettate. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di isopropanolo pre-raffreddato e 12 microlitri di acetato di sodio 2,5 molari. Quindi incubare le provette a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per 30-60 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni dal congelatore. Quindi, centrifugare i campioni a 12.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, lavare il pellet con circa 300-500 microlitri di etanolo al 70%.Anche in questo caso, centrifugare le provette a 12.000 g per 10 minuti. Quindi, senza disturbare il pellet, rimuovere con cura il surnatante. Successivamente, asciugare i pellet all'aria e sciogliere il DNA in 50 microlitri di tampone Tris-EDTA 1X.Aggiungere da uno a 16 microlitri di DNA isolato e due microlitri di tampone di reazione di frammentazione in una provetta di reazione a catena della polimerasi da 0,2 millilitri. Regolare il volume finale a 18 microlitri con acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungi due microlitri di enzima di frammentazione del DNA a doppio filamento e agita brevemente la miscela per tre secondi.Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 8,5 minuti nel termociclatore. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri di EDTA 0,5 molari alle provette. Aggiungere 25 microlitri di acqua priva di nucleasi per regolare il volume totale del DNA tranciato a 50 microlitri.Quindi aggiungere 45 microlitri di perle SPRI mantenute a temperatura ambiente a 50 microlitri di DNA tranciato e mescolare accuratamente i due pipettandoli su e giù. Lasciare il campione contenente le provette per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi su una piastra magnetica e attendere altri cinque minuti.Espellere con cautela il surnatante. Quindi, aggiungi 200 microlitri di etanolo fresco all'80% alle provette sul supporto magnetico e attendi altri 30 secondi a temperatura ambiente. Dopo 30 secondi, rimuovere con cautela il surnatante.Lasciare il coperchio del tubo aperto per asciugare le perline all'aria per cinque minuti sul supporto magnetico. Quindi rimuovere i tubi dal supporto magnetico ed eluire il DNA dalle perle in 55 microlitri di tampone Tris-EDTA 0,1X. Miscelare accuratamente il DNA mediante pipettaggio ripetuto.Quindi incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Ancora una volta, posiziona il tubo sul supporto magnetico e attendi che la soluzione si liberi in circa due minuti. Rimuovere 52 microlitri di surnatante e quindi eseguire l'analisi di quantificazione del DNA come indicato nel protocollo di testo.A 50 microlitri di DNA pulito e tranciato, aggiungere tre microlitri di endonucleasi, enzimi di coda del fosfato e sette microlitri di tampone di reazione. Mescolare accuratamente il DNA e gli altri componenti pipettando su e giù. Quindi girare i tubi per rimuovere le bolle.Dopo la centrifuga, trasferire i campioni su un termociclatore e impostare il programma. Diluire l'adattatore da 25 a 50 volte per ottenere una concentrazione di lavoro da 0,6 a 0,3 micromolari. Per il sequenziamento a lettura breve ad alto rendimento, aggiungere 30 microlitri di master mix di legatura, un microlitro di potenziatore di legatura e 2,5 microlitri di adattatore alle provette.Miscelare accuratamente il contenuto delle provette pipettando su e giù. Ancora una volta, fai girare i tubi per rimuovere eventuali bolle. Quindi incubare la provetta a 20 gradi Celsius per 15 minuti.Aggiungere tre microlitri di miscela commerciale di uracile-DNA glicosilasi e DNA glicosilasi liasi endonucleasi VIII alle provette. Regolare il volume totale a 96,5 microlitri. Mescolare accuratamente i componenti e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti nel termociclatore.Nella provetta, preparare la miscela di reazione a catena della polimerasi aggiungendo tutti i reagenti al DNA pulito e legato con l'adattatore. Quindi mescolare bene la reazione con il vortice. Una volta terminato il vortice, inserire i campioni nel termociclatore e avviare l'impostazione di amplificazione del termociclatore.Aggiungere circa 25 microlitri di microsfere magnetiche mantenute a temperatura ambiente al campione e mescolare mediante pipettaggio ripetuto. Incubare il campione per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi su un supporto magnetico e attendere altri cinque minuti.Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante in una nuova serie di provette etichettate. Successivamente, al surnatante, aggiungere sei microlitri di perle SPRI mantenute a temperatura ambiente e mescolare accuratamente. Dopo aver incubato i campioni per cinque minuti, trasferire le provette sulla piastra magnetica e attendere altri cinque minuti.Rimuovere ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo fresco all'80% ai tubi sul supporto magnetico. Quindi, incubare le provette a temperatura ambiente per 30 secondi.Dopo 30 secondi, rimuovere con cura il surnatante e asciugare le perle all'aria per cinque minuti con il coperchio del tubo aperto mentre si è ancora sul supporto magnetico. Ora rimuovi i tubi dal magnete. Eluire il DNA bersaglio dalle perle in 33 microlitri di tampone Tris-EDTA 0,1X e sottoporlo a miscelazione accurata.Dopo un'adeguata miscelazione, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi sul supporto magnetico e attendere circa due minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Pipettare 30 microlitri di surnatante in provette da due millilitri per la conservazione.Per mostrare l'isolamento del DNA dell'erbario, è stato eseguito un gel di agarosio con DNA a doppio filamento isolato da diversi campioni di erbario. Utilizzando 10 milligrammi di tessuto fogliare, quasi 3,56-2.610 nanogrammi di DNA a doppio filamento isolato sono stati caricati sul gel di agarosio. Il gel mostra il DNA dell'erbario degradato in forma di striscio in tutte le corsie.Successivamente, al fine di mostrare il recupero di una libreria di sequenziamento di alta qualità dal DNA isolato da 10 campioni di erbario, è stato eseguito un gel di agarosio. Prima del caricamento sul gel di agarosio, circa 1,26-464 nanogrammi di DNA dell'erbario isolato sono stati sottoposti a taglio enzimatico e pulizia con il 90% del volume delle perline. Il gel di agarosio mostra il recupero di una libreria di sequenziamento di alta qualità dal DNA di 10 campioni di erbario.Le librerie di sequenziamento finale mostrano una banda primaria compresa tra 300 e 500 coppie di basi. Quindi, per mostrare la sequenza shotgun del DNA derivato dall'erbario, è stato ottenuto un grafico circolare del genoma del cloroplasto TK 686. La sequenza mostra la lunghezza totale del DNA, la regione di ripetizione invertita e la presenza di regioni a copia singola grandi e piccole.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su 24 campioni in meno di 13 ore con solo circa otto ore di tempo pratico attivo. Dopo questa procedura, altri metodi, come la cattura della sequenza, possono essere eseguiti sulle librerie risultanti per generare dati nucleari per studi filogenetici.

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