Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di aumentare la quantità di DNA isolato a doppio filamento e le successive librerie di sequenziamento ad alto rendimento da campioni di erbario, massimizzando la loro utilità negli studi filogenomici. Questo metodo sblocca il potenziale dei campioni di erbario che altrimenti non sarebbero utili per i progetti di sequenziamento come sequenze genomiche a causa dell'estesa degradazione dei campioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è abbastanza robusta da consentire l'utilizzo di campioni di erbario rari e storicamente significativi senza la necessità di un ampio campionamento distruttivo.

Questa tecnica estende la profondità del campionamento dei taxon in progetti sistematici distanziati. L'acquisizione delle specie è un passo limitante, ma con questo protocollo, le collezioni storiche possono essere facilmente utilizzate in questi studi. Aggiungere azoto liquido e da 30 a 50 milligrammi di sabbia sterilizzata per macinare un centimetro quadrato di tessuto erbario preselezionato in polvere fine in mortaio e pestello pre-raffreddati.

Un'adeguata macinazione è essenziale per il successo dell'isolamento del DNA. E bisogna fare attenzione che il campione sia completamente polverizzato. Quindi, aggiungi la polvere congelata in due tubi da due millilitri, riempiendo non più della metà del volume del tubo.

Quindi aggiungere 600 microlitri di soluzione CTAB calda in ogni provetta. Mescolare accuratamente la polvere invertendo e vorticando. Quindi incubare i campioni in un bagno d'acqua mantenuto a 65 gradi Celsius per una o 1,5 ore.

Nel frattempo, vortice ogni 15 minuti. Quindi centrifugare i campioni a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, trasferire circa 500 microlitri di surnatante in un nuovo set di provette etichettate.

Al surnatante, aggiungere quattro microlitri di 10 milligrammi per millilitro di RNasi A a ciascun brano. Quindi miscelare il contenuto della provetta capovolgendo o pipettando. Incubare i campioni in un blocco termico o in un bagno d'acqua mantenuto a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Una volta che le provette hanno raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere ai campioni circa 500 microlitri di miscela di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico 25:24:1. Quindi miscelare il contenuto delle provette invertendo o pipettando ripetutamente. Quindi centrifugare i campioni a 12.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente.

Trasferire lo strato acquoso superiore, che è di circa 400 microlitri, in un nuovo set di provette etichettate. Allo strato acquoso di ogni provetta, aggiungere circa 400 microlitri di cloroformio 24:1, miscela di alcol isoamilico. Miscelare accuratamente il campione mediante pipettaggio o inversione ripetuti.

Quindi centrifugare le provette a 12.000 g per cinque minuti e trasferire circa 300 microlitri di strato acquoso superiore in provette pre-raffreddate ed etichettate. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di isopropanolo pre-raffreddato e 12 microlitri di acetato di sodio 2,5 molari. Quindi incubare le provette a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per 30-60 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere i campioni dal congelatore. Quindi, centrifugare i campioni a 12.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, lavare il pellet con circa 300-500 microlitri di etanolo al 70%.

Anche in questo caso, centrifugare le provette a 12.000 g per 10 minuti. Quindi, senza disturbare il pellet, rimuovere con cura il surnatante. Successivamente, asciugare i pellet all'aria e sciogliere il DNA in 50 microlitri di tampone Tris-EDTA 1X.

Aggiungere da uno a 16 microlitri di DNA isolato e due microlitri di tampone di reazione di frammentazione in una provetta di reazione a catena della polimerasi da 0,2 millilitri. Regolare il volume finale a 18 microlitri con acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungi due microlitri di enzima di frammentazione del DNA a doppio filamento e agita brevemente la miscela per tre secondi.

Quindi incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 8,5 minuti nel termociclatore. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque microlitri di EDTA 0,5 molari alle provette. Aggiungere 25 microlitri di acqua priva di nucleasi per regolare il volume totale del DNA tranciato a 50 microlitri.

Quindi aggiungere 45 microlitri di perle SPRI mantenute a temperatura ambiente a 50 microlitri di DNA tranciato e mescolare accuratamente i due pipettandoli su e giù. Lasciare il campione contenente le provette per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi su una piastra magnetica e attendere altri cinque minuti.

Espellere con cautela il surnatante. Quindi, aggiungi 200 microlitri di etanolo fresco all'80% alle provette sul supporto magnetico e attendi altri 30 secondi a temperatura ambiente. Dopo 30 secondi, rimuovere con cautela il surnatante.

Lasciare il coperchio del tubo aperto per asciugare le perline all'aria per cinque minuti sul supporto magnetico. Quindi rimuovere i tubi dal supporto magnetico ed eluire il DNA dalle perle in 55 microlitri di tampone Tris-EDTA 0,1X. Miscelare accuratamente il DNA mediante pipettaggio ripetuto.

Quindi incubare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Ancora una volta, posiziona il tubo sul supporto magnetico e attendi che la soluzione si liberi in circa due minuti. Rimuovere 52 microlitri di surnatante e quindi eseguire l'analisi di quantificazione del DNA come indicato nel protocollo di testo.

A 50 microlitri di DNA pulito e tranciato, aggiungere tre microlitri di endonucleasi, enzimi di coda del fosfato e sette microlitri di tampone di reazione. Mescolare accuratamente il DNA e gli altri componenti pipettando su e giù. Quindi girare i tubi per rimuovere le bolle.

Dopo la centrifuga, trasferire i campioni su un termociclatore e impostare il programma. Diluire l'adattatore da 25 a 50 volte per ottenere una concentrazione di lavoro da 0,6 a 0,3 micromolari. Per il sequenziamento a lettura breve ad alto rendimento, aggiungere 30 microlitri di master mix di legatura, un microlitro di potenziatore di legatura e 2,5 microlitri di adattatore alle provette.

Miscelare accuratamente il contenuto delle provette pipettando su e giù. Ancora una volta, fai girare i tubi per rimuovere eventuali bolle. Quindi incubare la provetta a 20 gradi Celsius per 15 minuti.

Aggiungere tre microlitri di miscela commerciale di uracile-DNA glicosilasi e DNA glicosilasi liasi endonucleasi VIII alle provette. Regolare il volume totale a 96,5 microlitri. Mescolare accuratamente i componenti e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti nel termociclatore.

Nella provetta, preparare la miscela di reazione a catena della polimerasi aggiungendo tutti i reagenti al DNA pulito e legato con l'adattatore. Quindi mescolare bene la reazione con il vortice. Una volta terminato il vortice, inserire i campioni nel termociclatore e avviare l'impostazione di amplificazione del termociclatore.

Aggiungere circa 25 microlitri di microsfere magnetiche mantenute a temperatura ambiente al campione e mescolare mediante pipettaggio ripetuto. Incubare il campione per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi su un supporto magnetico e attendere altri cinque minuti.

Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante in una nuova serie di provette etichettate. Successivamente, al surnatante, aggiungere sei microlitri di perle SPRI mantenute a temperatura ambiente e mescolare accuratamente. Dopo aver incubato i campioni per cinque minuti, trasferire le provette sulla piastra magnetica e attendere altri cinque minuti.

Rimuovere ed eliminare il surnatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo fresco all'80% ai tubi sul supporto magnetico. Quindi, incubare le provette a temperatura ambiente per 30 secondi.

Dopo 30 secondi, rimuovere con cura il surnatante e asciugare le perle all'aria per cinque minuti con il coperchio del tubo aperto mentre si è ancora sul supporto magnetico. Ora rimuovi i tubi dal magnete. Eluire il DNA bersaglio dalle perle in 33 microlitri di tampone Tris-EDTA 0,1X e sottoporlo a miscelazione accurata.

Dopo un'adeguata miscelazione, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi trasferire i tubi sul supporto magnetico e attendere circa due minuti fino a quando la soluzione diventa limpida. Pipettare 30 microlitri di surnatante in provette da due millilitri per la conservazione.

Per mostrare l'isolamento del DNA dell'erbario, è stato eseguito un gel di agarosio con DNA a doppio filamento isolato da diversi campioni di erbario. Utilizzando 10 milligrammi di tessuto fogliare, quasi 3,56-2.610 nanogrammi di DNA a doppio filamento isolato sono stati caricati sul gel di agarosio. Il gel mostra il DNA dell'erbario degradato in forma di striscio in tutte le corsie.

Successivamente, al fine di mostrare il recupero di una libreria di sequenziamento di alta qualità dal DNA isolato da 10 campioni di erbario, è stato eseguito un gel di agarosio. Prima del caricamento sul gel di agarosio, circa 1,26-464 nanogrammi di DNA dell'erbario isolato sono stati sottoposti a taglio enzimatico e pulizia con il 90% del volume delle perline. Il gel di agarosio mostra il recupero di una libreria di sequenziamento di alta qualità dal DNA di 10 campioni di erbario.

Le librerie di sequenziamento finale mostrano una banda primaria compresa tra 300 e 500 coppie di basi. Quindi, per mostrare la sequenza shotgun del DNA derivato dall'erbario, è stato ottenuto un grafico circolare del genoma del cloroplasto TK 686. La sequenza mostra la lunghezza totale del DNA, la regione di ripetizione invertita e la presenza di regioni a copia singola grandi e piccole.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su 24 campioni in meno di 13 ore con solo circa otto ore di tempo pratico attivo. Dopo questa procedura, altri metodi, come la cattura della sequenza, possono essere eseguiti sulle librerie risultanti per generare dati nucleari per studi filogenetici.