Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre lipoproteine da cellule batteriche per applicazioni dirette e di preparare ulteriormente i lipopeptidi N-terminali per l'analisi strutturale mediante spettrometria di massa MALDI-TOF. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, poiché la struttura N-terminale delle lipoproteine influenza il riconoscimento e la segnalazione del recettore Toll-like, influenzando la risposta immunitaria dell'ospite. Il vantaggio unico di questa tecnica è la formazione facoltativa ma intenzionale di addotti di sodio, che promuove la frammentazione verso lo ione deidroalanil diagnostico, aiutando nell'assegnazione strutturale dello stato di acilazione della lipoproteina.

Coltiva i batteri in 15 millilitri di brodo di soia triptico o terreni ricchi simili fino alla fase esponenziale tardiva. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione prima di lavarle una volta con soluzione salina tamponata con Tris EDTA o TBSE. risospendere le cellule in 800 microlitri di TBSE con un millimolare di PMSF e 0,5 milligrammi per millilitro di lisozima.

Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga filettata da 2,0 millilitri con tappo a vite e O-ring prima di incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere circa 800 microlitri di perle di silice di zirconia da 0,1 millimetri al tubo, quindi disgregare le cellule agitando alla massima velocità su un omogeneizzatore per cinque cicli di 30 secondi ciascuno con un riposo di due minuti sul ghiaccio tra ogni ciclo. Centrifugare il campione a 3.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere perle di pellet e celle integre.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 2,0 millilitri, quindi tenere in ghiaccio. Aggiungere 200 microlitri di TBSE al pellet rimanente e rimetterlo nell'omogeneizzatore per un ulteriore ciclo. Centrifugare come prima e combinare il surnatante con il surnatante precedente.

Integrare il surnatante con tensioattivo TX-114 a una concentrazione finale del 2% aggiungendo un volume uguale del 4% di tensioattivo in TBSE ghiacciato. Incubare il surnatante integrato su ghiaccio per un'ora, mescolando per inversione ogni 15 minuti. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase.

Centrifugare il campione a 10.000 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente per mantenere la separazione bifasica. Pipettare delicatamente la fase acquosa superiore e gettarla. Aggiungere il TBSE ghiacciato alla fase inferiore del tensioattivo per riempire il tubo al suo volume originale e capovolgerlo per mescolare.

Incubare su ghiaccio per 10 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase, quindi centrifugare a 10.000 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver ripetuto ancora una volta questi passaggi per un totale di tre separazioni, rimuovere la fase acquosa superiore e scartare.

Rimuovere il pellet di proteine precipitate che si è formato durante il corso delle estrazioni aggiungendo un volume di TBSE ghiacciato alla fase tensioattiva. Centrifugare a quattro gradi Celsius e 16.000 volte g per due minuti per pellettare la proteina insolubile. Trasferire immediatamente il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 2,0 millilitri contenente 1.250 microlitri di acetone al 100%.

Mescolare il campione per inversione e incubare per una notte a meno 20 gradi Celsius per far precipitare la proteina. Il giorno successivo, centrifugare il campione a 16.000 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente per pellettare le lipoproteine prestando attenzione all'orientamento della provetta. Lavare il pellet due volte con acetone al 100% prima di travasare l'acetone e lasciare asciugare il campione all'aria.

Quindi, aggiungere da 20 a 40 microlitri di Tris-HCL da 10 millimolari, pH 8,0, e risospendere accuratamente il pellet pipettandolo su e giù contro la parete con le lipoproteine precipitate. Separare le lipoproteine mediante SDS-PAGE utilizzando metodi standard. Trasferire le lipoproteine su una membrana di trasferimento in nitrocellulosa utilizzando una procedura standard di elettroblotting.

Trasferire la membrana di nitrocellulosa in un contenitore e coprire con la soluzione di Ponceau S. Oscilla delicatamente per cinque minuti o fino a quando non sono visibili bande rosso-rosa. Versare la soluzione di Ponceau S e sciacquare accuratamente la membrana di nitrocellulosa con acqua distillata per rimuovere la macchia in eccesso.

Con una lama di rasoio pulita, asportare la fascia desiderata e trasferirla in una provetta da microcentrifuga. Lavare la membrana tre volte con un millilitro di acqua distillata per decolorare completamente la fascia. Dopo aver trasferito la sezione su una superficie pulita, utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare la striscia di nitrocellulosa in piccoli pezzi di circa un millimetro per un millimetro.

Raccogli i pezzi in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 0,5 millilitri. Infine, lavare i pezzi due volte con 500 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari appena preparato, pH 7,8, in un'acqua di grado HPLC. Risospendere i pezzi di nitrocellulosa in 20 microlitri di una soluzione da 20 microgrammi per millilitro di tripsina in bicarbonato di ammonio da 50 millimolari.

Agitare i pezzi di nitrocellulosa risospesi per mescolare. Quindi girare brevemente il tubo per assicurarsi che tutti i pezzi siano completamente coperti dalla soluzione di tripsina. Coprire il coperchio della provetta con una pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione e incubare il digestato durante la notte a 37 gradi Celsius.

Centrifugare il campione a 16.000 volte g per 30 secondi e rimuovere il liquido mediante pipettaggio. Quindi, aggiungere 50 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,5% in acqua di grado HPLC. Dopo aver agitato il vortice per mescolare, ruotare brevemente il campione per assicurarsi che tutti i pezzi siano coperti dalla soluzione e incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la rimozione del liquido mediante pipettaggio, ripetere questo passaggio con 50 microlitri di acetonitrile al 10%, quindi ripetere nuovamente con 50 microlitri di acetonitrile al 20%. Per eluire i lipopeptidi strettamente legati, aggiungere 15 microlitri di matrice CHCA da 10 milligrammi per millilitro appena fatta disciolta in cloroformio-metanolo. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con vortice intermittente.

Per favorire la formazione di addotti di sodio, integrare la soluzione di CHCA in cloroformio-metanolo con bicarbonato acquoso di sodio fino a una concentrazione finale di un millimolare. Dopo aver fatto girare brevemente il campione, utilizzare una pipetta per trasferire con cura il liquido in una nuova provetta per microcentrifuga a basso legame proteico. Questa soluzione conterrà la maggior parte dei lipopeptidi N-terminali.

Depositare un microlitro dei lipopeptidi eluiti con CHCA su un bersaglio MALDI in acciaio lucidato. Procedere immediatamente alla spettrometria di massa. Esempi di spettri di massa delle soluzioni di lavaggio graduale di nitrocellulosa della lipoproteina PnrA dell'enterococcus faecalis sono mostrati qui.

Ad ogni lavaggio successivo, si osservano variazioni dell'intensità del segnale e una diminuzione dei singoli picchi, che culminano nello ione lipopeptide N-terminale altamente arricchito nella frazione di eluizione finale. Lo spettro MS/MS dello ione lipopeptide genitore rivela che si tratta del lisoformio, con frammenti di ioni corrispondenti al peptide triptico N-terminale PnrA caratterizzato da una catena acilica legata all'alfa-ammino e da una struttura monoacilglicerolo. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alla frazione lipopeptidica eluita della lipoproteina Lpp di Escherichia coli determina un aumento di 22 Dalton rispetto alla massa N-terminale calcolata.

L'analisi MS/MS dello ione genitore rispetto al suo addotto di sodio dimostra una frammentazione preferenziale verso lo ione deidroalanile del genitore sodicato attraverso l'eliminazione neutra della porzione diaco tioglicerilico. Questo aiuta nella determinazione strutturale dello stato di acilazione N-terminale. Durante l'esecuzione di questa procedura, vale la pena ricordare che ogni frazione di lavaggio della nitrocellulosa graduale può essere analizzata mediante spettrometria di massa, consentendo sia l'identificazione della proteina che la caratterizzazione N-terminale del lipopeptide in un singolo esperimento.

Dopo l'estrazione delle lipoproteine dai batteri, è possibile eseguire altri esperimenti, come i saggi cellulari che misurano la segnalazione del recettore Toll-like, per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui lo stato di acilazione delle lipoproteine influenza la risposta immunitaria dell'ospite.