Mappatura metabolica: Enzima quantitativa citochimica e istochimica per determinare l'attività della deidrogenasi in cellule e tessuti

Questo video mostra come eseguire la mappatura metabolica. Una procedura per quantificare l'attività di enzimi specifici chiamati deidrogenasi. Le cellule aderiscono a un vetrino per microscopia o a un tessuto congelato.

Decenni fa abbiamo sviluppato tutta una serie di tecniche di mappatura metabolica, allora chiamate enzimistochimica, per rilevare l'attività nei tessuti e nelle cellule al microscopio. Tuttavia, il metabolismo è diventato obsoleto durante la rivoluzione genetica alla fine del secolo scorso. Ma ora il metabolismo è di nuovo caldo.

Guardate, ad esempio, le cellule tumorali. Il metabolismo è ora considerato un bersaglio terapeutico e, pertanto, le determinazioni dell'attività nelle cellule e nei tessuti sono di nuovo calde. Un componente chiave del tampone di reazione è l'alcol polivinilico, o PVA.

Questo è disciolto in tampone fosfato a una concentrazione del 18%Il PVA è polveroso e tossico se inalato, quindi assicurati di pesare il PVA sotto una cappa aspirante. A causa dell'elevata concentrazione di PVA nel tampone fosfato, riscaldare la bottiglia del tampone di reazione a bagnomaria mescolando. Assicurati di avvitare il tappo senza stringere la bottiglia o la bottiglia potrebbe esplodere.

Potrebbero essere necessari fino a 15 minuti prima che il PVA sia completamente disciolto nel tampone fosfato. In tal caso, la soluzione dovrebbe essere trasparente con piccole bolle d'aria causate dall'agitazione. La soluzione viscosa di PVA può essere pipettata in provette tampone di reazione utilizzando una pipetta larga.

Tenere i tubi ad almeno 40 gradi centigradi o superiori per evitare che il PVA si solidifichi. Un millilitro di soluzione di PVA è buono per circa quattro citospin o due preparazioni tissutali. Per gli altri componenti del tampone di reazione, il cloruro giallo nitroblu tetrazolio, chiamato anche nitroBT, viene disciolto in una miscela di etanolo e dimetilformammide, mentre lo riscalda in una fiala di vetro nel bruciatore Bunsen.

La soluzione non deve arrivare a ebollizione o il volume diminuirà troppo. Quindi non lasciare la fiala troppo a lungo nella fiamma e agitare regolarmente. Tienilo in ghiaccio dopo essere stato sciolto e procedi rapidamente al passaggio successivo poiché il nitroBT disciolto muore rapidamente.

NitroBT è una polvere gialla che si deposita sul fondo del flaconcino di vetro contenente etanolo e DMF quando non viene tenuta disciolta. È possibile controllare ogni poche volte se il nitroBT è disciolto. La soluzione sarà quindi di colore giallo trasparente.

Una volta disciolto, il nitroBT può essere pipettato nelle fiale contenenti la soluzione PVA. Mescolare delicatamente con un cucchiaio sottile o una spatola sottile per mescolare il nitroBT e il tampone. Eseguire questa operazione per tutti i componenti del tampone di reazione passo dopo passo elencati nella prima tabella del testo completo.

Cerca di non creare troppe bolle d'aria mentre mescoli i componenti di reazione nella soluzione PVA. Il trucco è mescolare continuamente senza togliere il cucchiaio o la spatola dalla soluzione. Il trasportatore di elettroni, il metossifenazinio metil solfato, deve essere protetto dalla luce e disciolto nel tampone di reazione per ultimo.

Il colore rosso dell'MPMS è comodo per ricontrollare se tutti i componenti sono disciolti correttamente. Durante la preparazione del tampone di reazione e l'agitazione dei componenti, preriscaldare i vetrini per 50 minuti in un incubatore contenente acqua calda. Mantenere un livello dell'acqua basso all'interno della camera di incubazione.

Con il coperchio chiuso, questo manterrà umido l'ambiente di reazione. Con il coperchio aperto, l'acqua manterrà i vetrini a una temperatura calda. Applicare il tampone di reazione sulle preparazioni cellulari o tissutali utilizzando una pipetta di vetro.

Non preoccuparti delle piccole bolle d'aria perché queste fluiranno verso la superficie e non interferiranno con la reazione nelle cellule o nei tessuti. Tenere chiuso il coperchio della camera di incubazione durante il tempo di incubazione. In questo modo si assicurerà che la reazione avvenga in un ambiente umido per evitare che il tampone PVA si secchi.

La maggior parte delle reazioni della deidrogenasi negli esperimenti di mappatura metabolica si verificano a 37 gradi centigradi. Incubare i vetrini nel tampone di reazione per un periodo di tempo prespecificato, che può essere trovato nella prima tabella dell'articolo di testo completo. Si può facilmente vedere se la reazione ha funzionato o meno quando le cellule, o il tessuto, diventeranno blu scuro o viola, a causa dell'attività delle deidrogenasi.

Che alla fine si trasforma in nitroBT insolubile incolore nel formazolo blu scuro, che precipita nel sito di attività della deidrogenasi. La reazione enzimatica viene interrotta in tre fasi. In primo luogo, il terreno di incubazione in eccesso deve essere picchiettato su un fazzoletto.

In secondo luogo, il terreno di incubazione deve essere lavato via dai vetrini al microscopio utilizzando il lavaggio meccanico in un tampone fosfato di PH di 5,3 a 60 gradi centigradi. In terzo luogo, i vetrini per microscopia devono essere lasciati in tampone fosfato fresco di PH 5,3 a 60 gradi centigradi per 20 minuti. In quarto luogo, il tampone fosfato può essere risciacquato con acqua di rubinetto e poi distillata.

Si può facilmente vedere il tampone di reazione che si stacca. Il basso PH del tampone di arresto aiuta a fermare la reazione della deidrogenasi all'interno delle cellule. Posizionare i vetrini nel buffer di arresto fresco una o due volte, a seconda della quantità di vetrini che si stanno elaborando contemporaneamente.

Sciacquare anche gli scivoli con acqua di rubinetto e finire con acqua distillata. Ora, i vetrini possono essere asciugati su uno scaldavetrini e racchiusi. Asciugare accuratamente il lato posteriore del vetrino strofinandolo e posizionarlo su uno scaldavetrini preriscaldato a 50-60 gradi centigradi.

Quando i vetrini sono asciutti, è possibile utilizzare una soluzione di glicerolo glicerina e vetrini coprioggetti per racchiudere e conservare i vetrini. Conservare i vetrini in frigorifero fino a procedere con l'acquisizione dell'immagine. Questa è una micrografia fotografica a colori di una sezione rappresentativa di tessuto su un vetrino che è stata elaborata nell'esperimento mostrato in questo video.

Questa è una sezione di glioblastoma e la lepto deidrogenasi è l'enzima che è stato studiato. Ogni deidrogenasi produce un'entità PH e ogni molecola di entità PH converte una molecola di nitroBT, il sale giallo del tetrazolio, in una molecola di formazolo, il precipitato viola mostrato in questa immagine. Si può vedere un'elevata attività della lattato deidrogenasi a livello intracellulare nelle cellule tumorali mostrate come viola scuro.

I vasi sanguigni hanno un'attività inferiore e sono bianchi. Si tratta di un'immagine monocromatica della stessa regione della diapositiva. Che può essere utilizzato per quantificare l'attività enzimatica come descritto nel protocollo.

Più formazan viene prodotto, più scuro è il pixel e maggiore è l'assorbanza. L'assorbanza può quindi essere convertita in picomoli di entità ph che sono stati generati. Quindi la mappatura metabolica è facile da fare.

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