Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata
March 12th, 2018
Il cluster regolarmente intervallate proteine brevi ripetizioni/CRISPR palindromi associato 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornisce uno strumento promettente per l'ingegneria genetica e apre la possibilità di integrazione mirata dei transgeni. Descriviamo un fine omologia-mediata entrare (HMEJ)-base di strategia per DNA efficiente mirata integrazione in vivo e mirate terapie geniche utilizzando CRISPR/Cas9.
L'obiettivo generale di questa strategia HMEJ è quello di fornire uno strumento genetico promettente per una varietà di applicazioni, tra cui la generazione di modelli animali geneticamente modificati e terapie geniche mirate. Questo HMEJ ha approvato la misura. Può avere anche domande chiave in campo genetico e neurologico.
Ad esempio, come migliorare l'efficienza dell'integrazione mirata precisa dei transgeni in vivo. Il vantaggio principale di questa strategia basata su HMEJ è la capacità di correggere le mutazioni genetiche con elevata efficienza in vivo. Che ne è seguito è potenzialmente terapeutico.
A dimostrare la procedura sarà Xing Wang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, raccogliere 5000 cellule N2a, precedentemente trasfettate con vettori di espressione EGFP sgRNA Cas9 mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza o FACS, utilizzando cellule non trasfettate come controllo. Digerire le cellule raccolte in 2-5 microlitri di tampone di lisi a 56 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi riscaldare e attivare la proteinasi K a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Amplificare il campione mediante PCR nidificata utilizzando il protocollo del produttore. Mescolare un microlitro del prodotto di lisi con la DNA polimerasi e un paio di primer esterni riconoscendo la sequenza attorno al sito bersaglio dell'sgRNA ed eseguire la PCR primaria in un volume totale di 20 microlitri.
Successivamente, attivare la DNA polimerasi a 95 gradi Celsius per 5 minuti, quindi eseguire la PCR primaria con un'estensione finale a 72 gradi Celsius per 5 minuti. Eseguire la PCR secondaria utilizzando un microlitro di prodotto PCR primario e un paio di primer interni annidati. Denaturare e ri-ricuocere 300-600 nanogrammi di prodotto PCR purificato in 20 microlitri di 1x tampone di reazione TC7EI.
Aggiungere un microlitro di enzima T7EI ai prodotti PCR ricotti e digerirli a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi far scorrere il prodotto della digestione su gel di agarosio al 2% e 1x tampone TAE a 120 volt per 40 minuti, fino a quando i frammenti non si sono separati. Utilizzare ImageJ per determinare le intensità di banda del DNA tagliato e non tagliato e calcolare la frequenza indel.
Per la preparazione dell'mRNA di Cas9, aggiungere la sequenza del promotore T7 alla regione codificante Cas9 mediante amplificazione PCR. Successivamente, aggiungere il primer Cas9 FR a una concentrazione finale di 0,1 micromolari e 20 nanogrammi di vettore che esprime Cas9 alla miscela di DNA polimerasi ad alta fedeltà 1x. Regolare il volume finale a 50 microlitri con acqua priva di nucleasi.
Attivare la DNA polimerasi a 95 gradi Celsius per 5 minuti ed eseguire la PCR. Purificare il prodotto T7 Cas9 e PCR per la trascrizione in vitro o IVT. Quindi trascrivere da 0,5 a 1 microgrammo di DNA, utilizzando un kit di trascrizione mRNA a 37 gradi Celsius per 8 ore in un volume totale di 20 microlitri.
Aggiungere 1 microlitro di DNasi alla miscela per rimuovere il modello di DNA a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver aggiunto una coda di poli(A) per 45 minuti a 37 gradi Celsius, recuperare l'mRNA Cas9 con un kit di purificazione dell'RNA. Generare il modello di sgRNA guidato da un promotore T7 con DNA polimerasi ad alta fedeltà come eseguito nella sezione precedente e scegliere uno scaffold di sgRNA contenente un vettore come modello.
Dopo aver purificato il prodotto T7 sgRNA PCR, utilizzare da 0,5 a 1 microgrammo di DNA come modello per la trascrizione in vitro di sgRNA utilizzando un kit di trascrizione di RNA corto a 37 gradi Celsius per 6 ore, in un volume totale di 20 microlitri. Dopo 6 ore di incubazione, aggiungere 1 microlitro di DNasi alla miscela e continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere il DNA stampo. Purificare nuovamente gli sgRNA utilizzando il kit di purificazione dell'RNA.
Diluire l'sgRNA a 500 nanogrammi per microlitro in acqua priva di RNasi e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per un massimo di tre mesi. L'alta qualità dell'mRNA Cas9 e dell'sgRNA senza degenerazione e la corretta linea dei parametri del donatore HMEJ sono i passaggi più critici nella generazione di topi knock-in. Posizionare gli embrioni fecondati in terreno KSOM a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con il 5% di anidride carbonica.
Mescolare 100 nanogrammi per microlitro di mRNA Cas9, 50 nanogrammi per microlitro di sgRNA e 100 nanogrammi per microlitro di vettore donatore HMEJ e aggiungere acqua per regolare il volume finale a 10 microlitri. Pipettare il composto su e giù e metterlo sul ghiaccio. Quindi, estrarre gli aghi capillari utilizzando un estrattore per micropipette.
Iniettare un volume probabile della miscela nel citoplasma di zigoti con pronuclei ben definiti in una gocciolina di terreno HEPES-CZB contenente 5 microgrammi per millilitro di citocalasina B utilizzando un microiniettore con impostazioni di flusso costanti. Infine, coltivare gli zigoti iniettati in terreno KSOM a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica fino allo stadio di blastocisti dopo 3 giorni e mezzo per l'osservazione della fluorescenza. Dopo 3 giorni di iniezioni, il 12,9% delle blastocisti che hanno ricevuto donatori di HMEJ era positivo per mCherry, che era strettamente espresso nel trofoectoderma.
Sequenziando i topi positivi alla PCR, tutti gli eventi di integrazione esaminati erano integrazioni in-frame precise sia a 5 giunzioni prime che a 3 giunzioni prime. Dopo 7 giorni di iniezioni, le immagini immunofluorescenti hanno rivelato che quasi la metà degli epatociti trasfettati esprimeva mCherry come colorato sulle sezioni del fegato. Dopo la sospensione di NTBC, la colorazione epatica immunoistochimica degli epatociti corretti per Fah di topi Fah negativi che ricevevano costrutti Fah HMEJ e Cas9 ha mostrato una proliferazione più efficace rispetto al metodo basato su MMEJ.
La strategia basata su HMEJ potrebbe essere una piattaforma ideale per sostituire la sequenza mutata, come parte della mutazione, con quella corretta. Che non è applicabile per un metodo basato su HHEJ. Dopo questo esperimento, questa terapia apre la strada ai ricercatori in un campo in cui l'integrazione precisa del bersaglio esplora ampie applicazioni terapeutiche.
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Panoramica
La strategia HMEJ offre un promettente strumento genetico per generare modelli animali geneticamente modificati e terapie geniche mirate. Mira a migliorare l'efficienza dell'integrazione mirata precisa dei transgeni in vivo, fornendo un potenziale terapeutico per correggere le mutazioni genetiche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Ingegneria genetica
- Terapia genica
- Applicazioni nelle neuroscienze
Contesto
- Il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento potente per le modifiche genetiche.
- L'unione mediata dall'omologia (HMEJ) migliora l'integrazione mirata.
- Migliorare l'efficienza dell'integrazione del transgene è cruciale per le applicazioni terapeutiche.
- Potenziale di correzione delle mutazioni genetiche in vivo.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una strategia efficiente per l'integrazione mirata del DNA.
- Esplorare le applicazioni nella generazione di modelli geneticamente modificati.
- Valutare il potenziale terapeutico della correzione delle mutazioni genetiche.
Metodi utilizzati
- Utilizzo del sistema CRISPR/Cas9.
- Implementazione di tecniche di unione mediata dall'omologia.
- Test in vivo per l'efficienza dell'integrazione mirata.
- Valutazione delle applicazioni di terapia genica.
Risultati principali
- Ha dimostrato un'elevata efficienza nell'integrazione mirata dei transgeni.
- Ha mostrato il potenziale di correzione delle mutazioni genetiche in vivo.
- Ha convalidato l'efficacia della strategia HMEJ.
- Ha evidenziato le implicazioni per la terapia genica nelle neuroscienze.
Conclusioni
- La strategia HMEJ è uno strumento promettente per l'ingegneria genetica.
- Fornisce un approccio valido per le terapie geniche mirate.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzare l'efficienza dell'integrazione.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient in vivo targeted integration remains a critical bottleneck for translational gene editing and the generation of disease-relevant animal models. The HMEJ-based CRISPR/Cas9 strategy directly addresses the challenge of precise transgene insertion in non-dividing cells, enabling higher predictive confidence for functional genomics and therapeutic hypothesis testing. This approach supports risk-adjusted portfolio advancement by improving the reliability of genetic model creation and mutation correction workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of gene function through targeted integration in animal models.
- Supports functional target validation by facilitating correction of disease-causing mutations in vivo.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated genetic systems for robust assay development and compound screening.
- Enhances reproducibility and standardization by enabling precise genomic modifications.
- Facilitates scalable generation of models for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling correction of clinically relevant mutations in animal models.
- Supports translational biomarker development through precise genetic manipulation.
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by reducing mechanistic ambiguity.
Pipeline & Workflow Integration
This HMEJ-based integration method fits at the interface of early discovery and preclinical model generation, bridging functional genomics with translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise gene editing in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined models for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as indel frequency and integration efficiency for robust comparison of editing outcomes.
- Translational Research: Enables correction of disease mutations, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating diverse genetically modified models across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic model development.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene editing programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design, mRNA/sgRNA preparation, and microinjection techniques.
- Demands access to cell sorting, PCR, and sequencing infrastructure for validation.
- Necessitates cross-team standardization of donor vector design and quality control.
- Adaptation across species or cell types may require optimization of homology arm length and delivery conditions.
- Efficiency and precision are dependent on high-quality reagents and careful protocol execution.
