Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

L'obiettivo generale di questo sequenziamento ad alto rendimento di 16S rRNA-Amplicon è quello di caratterizzare la composizione globale del microbioma a partire da campioni fecali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione microbica globale associate a molti campi di interesse come il metabolismo, la digestione, l'intestino e l'infiammazione sistemica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un censimento delle comunità microbiche aerobiche e anaerobiche presenti nel campione fecale, compresi quei batteri difficili da coltivare.

Questo metodo è in grado di gestire simultaneamente un gran numero di campioni fecali grazie alla linea di pompa di elaborazione rapida senza colon e ha portato a un sequenziamento robusto e riproducibile dell'rRNA-amplicone 16S. Per questo protocollo, avere campioni di feci congelate che hanno all'incirca le dimensioni di una gomma da matita. I campioni devono essere conservati in provette da due millilitri con la punta tagliata del tampone di raccolta.

Includere controlli negativi costituiti da tamponi senza feci e controlli duplicati interni e avere duplicati del campione dalle feci originali del campione per fungere da controllo interno. Iniziare con lo scongelamento delle soluzioni di estrazione e diluizione a temperatura ambiente insieme ai campioni fecali e ai campioni di controllo. Una volta scongelata, aggiungere 250 microlitri di soluzione di estrazione a ciascuna provetta del campione e mescolare le feci in soluzione utilizzando un vortice.

A questo punto introdurre i controlli negativi solo buffer. Quindi, riscaldare i campioni per 10 minuti a bagnomaria bollente. Dopo l'incubazione in acqua bollente, aggiungere 250 microlitri di soluzione di diluizione a ciascun campione e agitare i campioni per mescolarli.

Quindi conservare le provette del campione a quattro gradi Celsius fino a quando non è possibile eseguire la PCR. Imposta le PCR su una workstation pre-PCR che è stata ripulita da potenziali contaminanti del DNA come modelli e ampliconi. Etichettare i primer in base al loro codice a barre e diluirli in acqua distillata doppia a una concentrazione di 50 micromolari.

Conservare le scorte di primer diluito a meno 20 gradi Celsius e scongelarle completamente prima dell'uso. Per ogni campione, preparare una piastra a 96 pozzetti per 32 reazioni in triplicato. Dopo il riscaldamento a temperatura ambiente, diluire le aliquote del primer diretto e dei 32 primer inversi a cinque micromolari per la PCR.

Quindi preparare una miscela di base per PCR sufficiente per 100 reazioni. Combinare 100 microlitri di primer in avanti a cinque micromolari con un millilitro di master mix 2X PCR e 400 microlitri di acqua distillata doppia. Agitare questa miscela e poi caricare 15 microlitri di questa miscela in ciascuno dei 96 pozzetti.

Quindi, caricare i set di tre pozzetti, ciascuno con un microlitro di primer inverso a cinque micromolari. Pertanto, caricare tutti i 32 diversi indici inversi nella piastra. Quindi, in ogni pozzetto della piastra, aggiungere quattro microlitri del campione di DNA estratto.

Questo viene fatto su una panchina pulita. Ora esegui la PCR con una denaturazione iniziale di tre minuti seguita da 35 cicli con un minuto di denaturazione e inginocchiamento a 55 gradi Celsius e un minuto di estensione. Termina con un'estensione finale di 10 minuti.

Al termine della reazione, lavorare in un banco di lavoro dedicato post-PCR. Lì, combina ogni set di prodotti PCR triplicati in un'unica provetta per 60 microlitri per campione. Quindi eseguire quattro microlitri di ciascun campione su un gel di agarosio all'1% colorato con bromuro di etidio.

Gli ampliconi positivi appariranno tra 375 e 425 coppie di basi. I controlli negativi vengono mostrati e vengono elaborati insieme agli Amplicon positivi allo studio. Quantificare le concentrazioni di DNA dei prodotti di reazione positiva secondo le istruzioni del produttore.

Quindi combina 500 nanogrammi di DNA da ciascuno dei prodotti in un unico tubo. Agitare questa miscela e poi esaurire 200 microlitri su un gel all'1% come prima. Ora estrai le bande dal gel tra 375 e 425 paia di basi.

Quindi, prepara la libreria per la sequenziazione. Misurare la concentrazione utilizzando un kit di rilevamento del DNA a doppio filamento altamente sensibile secondo le istruzioni del produttore, seguito dall'uso di un kit di separazione e analisi altamente sensibile. Quindi diluire la libreria a sette picomolari e combinarla quattro a uno con una libreria di controllo.

Ora che il campione è pronto per il sequenziamento, trasferirlo alla macchina di sequenziamento. Il metodo descritto per la preparazione di una libreria da campioni di feci è stato utilizzato per analizzare il microbioma di pazienti ospedalizzati con sospetta diarrea infettiva. Parallelamente, i campioni di feci sono stati sottoposti a coltura tradizionale in un laboratorio di microbiologia.

Sono stati sequenziati campioni di feci di adulti sani per il confronto. Sono stati inclusi diversi campioni di controllo negativi, PCR senza modello, PCR su tamponi puliti e sterili in soluzione di estrazione e diluizione e PCR su soluzioni miste di estrazione e diluizione. Ognuno di questi ha avuto meno di 118 letture totali che erano principalmente taxa di micoplasmi.

I campioni standard hanno avuto una media di oltre 10.000 letture senza identificazione del Mycoplasma dopo il controllo di qualità. La consistenza e la variabilità dei campioni sono state misurate utilizzando 16 campioni di feci preparati con due diversi primer con codice a barre per costruire quindi due diverse librerie da ciascun campione. La metà dei campioni era positiva per Campylobacter salmonella o Shigella nella tecnica di coltura tradizionale.

Utilizzando i risultati del sequenziamento 16S, un grafico dell'area a livello di phylo mostra la coerenza tra librerie realizzate dagli stessi campioni, indipendentemente dai risultati della coltura tradizionale. Da questo pool di 16 campioni accoppiati, l'analisi delle coordinate principali ha rivelato che le coppie di campioni sono strettamente allineate e che i campioni di coltura positivi avevano un valore PC1 significativamente diverso dai campioni di coltura negativi. Ulteriori analisi dei campioni hanno rivelato che alti livelli di proteobatteri sono stati trovati solo nei pazienti ospedalizzati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare contemporaneamente un gran numero di campioni fecali utilizzando un'estrazione di DNA senza due punti e la PCR per generare librerie di sequenziamento con codice a barre della regione V4 della variabile microbica. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare in un ambiente organizzato e pulito, soprattutto durante la preparazione delle librerie. Non dimenticare che lavorare con campioni di feci umane è pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre dispositivi di protezione personale.