Name: Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara la caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento dell'amplicone 16S rRNA. Questo protocollo standardizzato consente l'analisi ad alto throughput del microbioma intestinale con risultati robusti e riproducibili.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal programma-CORE (concede n. 41/11), la Israel Science Foundation (concessione n. 908/15) e l'europeo di Crohn e colite organizzazione (ECCO).

Approvazione etica per lo studio è stato concesso dal comitato di etica Sheba locale ricerca e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. Il protocollo ha ricevuto un'eccezione di consenso del paziente dal locale comitato di revisione etica, poiché il materiale fecale che sono stati utilizzati sono stati già presentati al nucleo di microbiologia come parte del workup clinico e senza informazioni identificabili paziente diverso da età, genere e microbiche risultati. Scritto, il consenso informato è stato ottenuto da volontari sani e Institutional Review Board ha approvato lo studio. Alcuni di quei campioni sono già stati inclusi in una precedente analisi1.
1. trattamento del campione
<ol><li>Raccogliere una sbavatura di2 mm di circa 5 (circa le dimensioni di una gomma da matita) da un campione fecale fresco con un tampone sterile in un test tube (Vedi Tabella materiali). Memorizzare tutti i tamponi contenenti i campioni fecali a-80 ° C entro 24h. I tamponi fecali possono rimanere là fino al procedimento successivo.</li>
</ol>2. DNA estrazione
<ol><li>Scongelare le soluzioni di estrazione e diluizione a temperatura ambiente (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Trasferimento il tampone fecale in un insieme vuoto 2 mL tubo (vedere Tabella materiali). Regolare le dimensioni di bastone di tampone di taglio utilizzando un paio di forbici pulita per consentire la chiusura del tubo con minima contaminazione incrociata. Aggiungere 250 μL di soluzione di estrazione per ogni provetta contenente il tampone fecale e vortexare per mescolare.</li>
	<li>Riscaldare i campioni per 10 min in un bagno di acqua bollente (95 – 100° C). Aggiungere 250 μL di soluzione di diluizione per ogni campione e vortexare per mescolare.</li>
	<li>Conservare i capillari di 2 mL contenente il DNA estratto e il tampone a 4 ° C.</li>
</ol>3. PCR e preparazione di biblioteca
Ai punti 3.1 e 3.2, lavorare in una workstation PCR che fornisce pulito, ambiente privo di modello e amplicon.
<ol><li>Etichettare i primer (tabella 1) secondo il loro codice a barre. Diluire ciascun primer in doppia acqua distillata (DDW) per un 50 μM concentrazione e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Utilizzare una piastra a 96 pozzetti per reazioni di PCR. Ogni piatto può contenere 32 campioni differenti, che sono contrassegnati da 32 primer indice diverso. Scongelare il primer forward e i 32 iniettori d'inversione a temperatura ambiente e diluirli a 5 μM.</li>
	<li>Preparare miscele di reazione di PCR per 100 reazioni (volume finale in ciascun pozzetto sarà 20 μl) con 100 µ l di primer in avanti di 5 μM, 1 mL 2 X PCR Master mix e 400 μL DDW. Mettere 15 μL di questo mix PCR in ciascun pozzetto (totale di 96 pozzetti). Aggiungere 1 μL di ogni primer indicizzata inverso 5 μM a 3 diversi pozzi (32 diversi primer in triplici copie dà un totale di 96 pozzetti).</li>
	<li>In una zona dedicata per pre-PCR, significato un banco pulito che è modello e amplicon gratis, aggiungere 4 μL di ciascun campione di DNA estratto a miscele di reazione (ogni campione di DNA estratto è amplificato in triplice copia — 32 campioni per piastra a 96 pozzetti).</li>
	<li>Eseguire PCR con le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale di 94 ° C per 3 min; seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 ° C per 1 min, ricottura a 55 ° C per 1 min e l'estensione a 72 ° C per 1 min; e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min.</li>
	<li>Su un banco diverso, che viene definito come una zona dedicata per il post-PCR, combinare ogni reazione di PCR triplicate in un tubo singolo volume (60 µ l per campione).</li>
	<li>Per valutare la qualità degli ampliconi PCR, eseguire 4 μL di ogni reazione combinato-PCR su un gel di agarosio all'1% macchiato di bromuro di etidio. Sotto UV lunghezza d'onda di 260 nm, gli ampliconi positivi apparirà in una dimensione di banda prevista di 375 – 425 bp. Solo questi ampliconi saranno inclusi nei passaggi successivi. Nota: Ciascun campione viene amplificato in triplice copia, significato che ogni campione è amplificato in 3 differenti reazioni di PCR. Non scalabilità.</li>
</ol>4. Biblioteca quantificazione e pulizia
<ol><li>Al fine di ottenere una piscina di concentrazione equimolare di tutti i campioni PCR, quantificare ciascun amplicon di un DNA a doppio filamento (dsDNA quantificare reagente) fluorescente dell'acido nucleico macchia (Vedi Tabella materiali), adatto per la quantificazione simultanea di un grande quantità di campioni. Nota: Poiché la gamma di dimensioni del amplicon è equivoca, l'importo effettivo nei nanograms viene utilizzato per caricare una concentrazione equimolare.</li>
	<li>Combinare 500 ng di ciascun campione in un singolo tubo sterile. Vortice di mescolare.</li>
	<li>Eseguire 200 μL della biblioteca riunita su un gel di agarosio all'1% il bromuro di etidio-macchiato. Estrarre le bande di bp di 375 – 425 dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali) ed eluire la libreria riunita in 80 μL DDW. Nota: La libreria pool deve essere formato selezionato per ridurre i prodotti di amplificazione aspecifica da DNA ospite.</li>
	<li>Misurare la concentrazione finale libreria utilizzando un dsDNA altamente sensibile rilevare kit secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali). Misurare la dimensione di biblioteca accurato utilizzando un kit di separazione e analisi altamente sensibile per le librerie di DNA secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>5. sequenziamento
<ol><li>Diluire la libreria riunita a 19 con aggiunta di libreria di controlli del 20% (Vedi Tabella materiali), secondo il protocollo di macchina di sequenziamento.</li>
	<li>Per il sequenziamento, progettato su misura uso leggere gli iniettori che sono gratuiti per i primer di amplificazione V4 (Vedi tabella 1).</li>
	<li>Primer di sequenziamento progettato personalizzato uso un terzo che legge il codice a barre in un ulteriore ciclo (Vedi tabella 1) e genera fine accoppiato letture di 175 basi di lunghezza in ogni direzione, secondo le specifiche del produttore.</li>
	<li>Eseguire la macchina di sequenziamento e ottenere file FASTQ secondo il protocollo del produttore.</li>
</ol>6. elaborazione dei dati
<ol><li>Cucire insieme ed elaborare i file FASTQ accoppiato-fine sovrapposti in una pipeline di curatela di dati implementato in QIIME 2 versione 2017.7.017. Demultiplex letture secondo campione specifici codici a barre.</li>
	<li>Utilizzare DADA218 per il rilevamento di variante (SVs) di controllo di qualità e sequenza. Troncare letture alle 13 basi dall'estremità 3' e 15 dall'estremità 5', scartare legge con più di 2 errori previsti. Identificare e rimuovere le chimere utilizzando il metodo del consenso — chimere vengono rilevate in campioni singolarmente e sequenze individuate chimerici in una frazione sufficiente di campioni vengono rimossi.</li>
	<li>Eseguire SVs classificazione tassonomica usando un classificatore Naive Bayes montato, addestrati su agosto 2013 99% identità Greengenes database6, per 175 lunghe letture e il set di primer Forward/Reverse.</li>
	<li>Rarefarsi tutti i campioni a profondità di 2.146 sequenze.</li>
	<li>Utilizzare UniFrac non ponderata per la misurazione della β-diversità (tra campione diversità19,20) sui campioni rarefatti, per evitare un effetto di dimensione del campione.</li>
	<li>Utilizzare la matrice delle distanze risultante per eseguire un'analisi di coordinate principali (PCoA). Nota: I file di script e mappatura di elaborazione dati vengono forniti come materiale supplementare (complementare materiale 1 e 2).</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun metagenomica hanno guadagnato popolarità in microbiologia clinica applicazioni21,22,23. Queste tecniche sono vantaggiose in loro una maggiore capacità di catturare taxa coltivabili e non coltivabili, fornendo dati relativi l'abbondanza relativa dell'inoculo di patogeno e la loro capacità di identificare più precisamente un polimicrobica infettiva 24di impronte digitali. I progressi nel campo dell...

Sono concentrato sforzi per comprendere meglio microbiome diversità e abbondanza, come un altro aspetto di catturare la differenza e le somiglianze tra individui in condizioni sane e patologiche. Età2,3, Geografia4, lifestyle5,6e malattia5 sono stati indicati per essere associati con la composizione del microbioma intestinale, ma molte condizioni e popolazioni non sono ancora state completamente caratterizzata. Recentemente è stato segnalato che il microbioma può essere modificato per applicazioni terapeutiche7,8,9. Di conseguenza, ulteriori approfondimenti sul rapporto tra varie condizioni fisiologiche e la composizione microbica sono il primo passo verso l'ottimizzazione di potenziali future modifiche.
I metodi tradizionali di coltura microbica sono limitati da basse rese10,11e sono concettualizzati come uno stato binario dove è un batterio presente nell'intestino o non. Alto-rendimento di sequenziamento del DNA ha rivoluzionato l'ecologia microbica, consentendo la cattura di tutti i membri della comunità microbica. Tuttavia, la sequenza legge lunghezza e qualità rimangono significativi ostacoli alla tassonomia accurata assegnazione12. Inoltre, esperimenti di basati ad alta velocità possono soffrire di effetti di batch, dove misure sono influenzate da variabili non biologico o non-scientifica13. Negli ultimi anni, diversi programmi sono stati istituiti per studiare il microbioma umano, compreso il progetto americano Gut, il progetto microbioma umano di Stati Uniti (US) e il progetto MetaHIT Regno Unito (UK). Queste iniziative hanno generato grandi quantità di dati che non sono facilmente paragonabili a causa di una mancanza di coerenza nei loro approcci. Una varietà di progetti internazionali come International Human Microbiome Consortium, il progetto di International Human Microbiome standard e il National Institute of Standards e tecnologia (NIST) ha tentato di risolvere alcuni di questi problemi14 e sviluppato standard per misure di microbiome che dovrebbero consentire il raggiungimento di risultati riproduttivi affidabile. È descritto qui un protocollo integrato di diversi metodi ampiamente usati15,16 per 16S rRNA high throughput sequenziamento (16S-seq) a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Il protocollo descrive un approccio privo di colonna PCR, originariamente progettato per estrazione diretta della pianta del DNA16, per abilitare la gestione simultanea di un numero elevato di fecale campioni in un tempo relativamente breve di alta qualità ha amplificato il DNA per mirati sequenziamento della regione V4 variabile microbica su una comune piattaforma di sequenziamento. Questo protocollo mira a guidare gli scienziati interessati a iniziare l'uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare, dettagliato, utilizzando controlli importanti. Avendo un protocollo guidate e dettagliate passo a passo può minimizzare l'effetto di batch e così vi permetterà risultati di sequenziamento più comparabili tra i laboratori.

<table><tbody><tr><td>Primer</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di estrazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di diluizione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Master mix</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsKit di reagenti DNA</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA quantificare il reagente</td></tr><tr><td>MinElute Kit di estrazione su gel</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultra pura Senza Dnasi e Rnasi</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test Qubit dsDNA HS</td><td>Sonde molecolari</td> Kit di <td>rilevamento del dsDNA</td><td>Q32854</td></tr><tr><td>Alta sensibilità D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Screen Tape 5067-5582</td><td>separazione e analisi</td></tr><tr><td>Screen Tape Assay</td><td>Agilent Technologies</td><td>Reagenti 5067-5583</td><td>per librerie</td></tr><tr><td>di DNA PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>libreria di controllo</td></tr><tr><td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cicli)</td>Illumina <td>MS-102-2003</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Collezione Etidio Bromuro</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tubi</td><td>SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Provette di raccolta Safe Seal</td></tr><tr><td>Tampone in plastica in provetta in PP</td><td>INTERNO STERILE</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina</td><td>PCR Applied Biosystems</td><td>2720 Termociclatore</td><td></td></tr><tr><td>Macchina di sequenziamento</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>PCR workstation</td><td>Biosan</td><td>UV-cleaner</td><td></td></tr><tr><td>forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16s rrna-amplicone

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Il microbioma intestinale umano svolge un ruolo centrale nella protezione delle cellule dall'infortunio, nella trasformazione di energia e nutrienti e nel promuovere l'immunità. Deviazioni da quello che è considerato una composizione del microbiota sano (disbiosi) possono compromettere le funzioni vitali, portando a condizioni patologiche. Gli sforzi recenti e continue ricerche che sono state rivolte verso la caratterizzazione delle associazioni fra composizione microbica e la salute umana e la malattia.
Advances in tecnologie di sequenziamento ad alta velocità consente la caratterizzazione della composizione microbica dell'intestino. Questi metodi includono sequenziamento del 16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun. Sequenziamento del 16S rRNA-amplicon viene utilizzata per analizzare la composizione tassonomica, mentre sequenziamento shotgun fornisce ulteriori informazioni su previsioni di gene e annotazione funzionale. Un vantaggio nell'utilizzo di un metodo di sequenziamento mirato della regione variabile del 16S rRNA gene è il suo costo notevolmente inferiore rispetto al sequenziamento shotgun. Differenze di sequenza nel gene del rRNA 16S vengono utilizzate come un'impronta digitale microbica per identificare e quantificare i diversi taxa all'interno di un singolo campione.
Principali iniziative internazionali hanno arruolato standard per sequenziamento del 16S rRNA-amplicon. Tuttavia, parecchi studi segnalano una fonte comune di variazione causato dall'effetto di batch. Per minimizzare questo effetto, in uniforme protocolli per la raccolta del campione, l'elaborazione e l'ordinamento deve essere implementato. Questo protocollo propone l'integrazione dei protocolli ampiamente utilizzati a partire dalla raccolta dei campioni fecali per analisi dei dati. Questo protocollo include un approccio diretto-PCR privo di colonna, che consente la gestione simultanea ed estrazione di DNA di un gran numero di campioni di feci, insieme con l'amplificazione di PCR della regione V4. Inoltre, il protocollo descrive la pipeline di analisi e fornisce uno script utilizzando l'ultima versione di QIIME (QIIME 2 versione 2017.7.0 e DADA2). Questo protocollo passo dopo passo si rivolge a chi è interessato a iniziare l'uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare e dettagliato guida.

Un'illustrazione schematica del protocollo è illustrato nella Figura 1.
Prospetticamente abbiamo raccolto campioni di feci da pazienti ospedalizzati con sospetta diarrea infettiva. Tali campioni sono stati presentati al laboratorio di microbiologia clinica presso il centro medico di Sheba tra febbraio e maggio 2015, come è stato descritto in precedenza1. Campioni di feci sono...

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

L'obiettivo generale di questo sequenziamento ad alto rendimento di 16S rRNA-Amplicon è quello di caratterizzare la composizione globale del microbioma a partire da campioni fecali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione microbica globale associate a molti campi di interesse come il metabolismo, la digestione, l'intestino e l'infiammazione sistemica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un censimento delle comunità microbiche aerobiche e anaerobiche presenti nel campione fecale, compresi quei batteri difficili da coltivare.Questo metodo è in grado di gestire simultaneamente un gran numero di campioni fecali grazie alla linea di pompa di elaborazione rapida senza colon e ha portato a un sequenziamento robusto e riproducibile dell'rRNA-amplicone 16S. Per questo protocollo, avere campioni di feci congelate che hanno all'incirca le dimensioni di una gomma da matita. I campioni devono essere conservati in provette da due millilitri con la punta tagliata del tampone di raccolta.Includere controlli negativi costituiti da tamponi senza feci e controlli duplicati interni e avere duplicati del campione dalle feci originali del campione

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Questo video descrive il protocollo di isolamento del DNA da campioni di feci di topi portatori di tumore al colon. Il DNA estratto viene amplificato mediante PCR e il prodotto viene ulteriormente pulito utilizzando un approccio basato su microsfere magnetiche. Questo metodo può essere utilizzato per determinare l'effetto dell'arricchimento ambientale sul microbiota del colon e sulla mortalità animale.

Isolamento del DNA microbico delle feci: studio dell'effetto dell'arricchimento ambientale sulla diversità del microbioma nel modello di tumore murino

Caratterizzare la comunità microbica è stato un obiettivo di lunga data nella microbiologia ambientale. I metodi di sequenziamento di nuova generazione consentono ora la caratterizzazione delle comunità microbiche a una profondità senza precedenti, con costi e manodopera minimi. Descriviamo qui il nostro approccio al sequenziamento dei geni dell'RNA ribosomiale batterico 16S utilizzando un sequenziatore da banco.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Qui presentiamo un protocollo di sequenziamento di nuova generazione per rRNA 16S che consente l'identificazione e la caratterizzazione delle comunità microbiche all'interno di vettori. Questo metodo prevede l'estrazione di DNA, amplificazione e codici a barre dei campioni mediante PCR, sequenziamento su una cella di flusso e la bioinformatica per abbinare i dati di sequenza filogenetica informazioni.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura del microbiota dell'intestino, del colon in vitro, , utilizzando una serie di bioreattori che simulano le condizioni fisiologiche del tratto gastro intestinale.

L'applicazione di avanzate In Vitro coltura tecnologia per studiare il Microbiota dell'intestino umano

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l'isolamento batterico, l'identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

Pyrosequencing è una tecnica versatile che facilita microbica sequenziamento del genoma che può essere utilizzato per identificare le specie batteriche, discriminare ceppi batterici, e rilevare mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli agenti antimicrobici. In questo video, verrà dimostrata la procedura per la generazione microbica amplicone, amplicone pyrosequencing, e l'analisi di sequenza del DNA.

Pyrosequencing per identificazione microbica e caratterizzazione

Impara la caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento dell'amplicone 16S rRNA. Questo protocollo standardizzato consente l'analisi ad alto throughput del microbioma intestinale con risultati robusti e riproducibili.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

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