Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i livelli assoluti di microRNA plasmatici utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale. Questo metodo può aiutare a valutare la quantità di microRNA plasmatici, anche se il loro livello di espressione è basso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i dati misurati possono essere confrontati con altri provenienti da diversi studi o laboratori.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai campioni di altre specie perché una curva standard può essere generata utilizzando l'RNA sintetico o il nucleotide. Questo metodo può fornire informazioni sulla ricerca traslazionale per studiare promettenti biomarcatori di sicurezza. Innanzitutto, scongelare i campioni di plasma congelati ottenuti dalla vena femorale delle scimmie Cynomolgus su ghiaccio.

Trasferire il reagente di lisi in cloroformio su ghiaccio per il raffreddamento prima dell'estrazione dell'RNA. Quindi, aggiungere 1.000 microlitri di reagente Lisi a 200 microlitri di campione. E agitare per un minuto per garantire una corretta miscelazione.

Quindi aggiungere al campione cinque microlitri di microRNA sintetico di cinque nanomolari di Caenorhabditis elegans e 200 microlitri di cloroformio. Agitare il campione per un minuto per mescolarlo correttamente. Quindi, posizionare il campione sul ghiaccio per due o tre minuti.

Quindi, centrifugare il campione a 12.000 G, per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire con cura 650 microlitri di fase acquosa in una nuova microprovetta. Quindi, aggiungere 975 microlitri di etanolo alla fase acquosa e pipettare più volte per garantire una miscelazione completa.

Trasferire il campione nella colonna e nell'adattatore corrispondenti, quindi asciugare sottovuoto per tre minuti utilizzando i collettori per vuoto. Quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo alla colonna e asciugare sottovuoto per un minuto. Dopo l'essiccazione sottovuoto, aggiungere 800 microlitri di RWT Buffer alla colonna e, di nuovo, asciugare sottovuoto per due minuti.

Quindi aggiungere 800 microlitri di RPE Buffer alla colonna e asciugare sottovuoto per due minuti. Aggiungere due volte il tampone RPE, seguito dall'essiccazione sottovuoto. Quindi, aggiungere 300 microlitri di etanolo alla colonna.

Dopo aver aggiunto l'etanolo, asciugare sottovuoto per un minuto. Quindi, trasferire la colonna in una nuova microprovetta e centrifugare la stessa a 12.000 G a temperatura ambiente per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire la colonna in una nuova microprovetta e aggiungere 50 microlitri di acqua priva di nucleasi.

Lasciare riposare la colonna a temperatura ambiente per tre minuti e poi centrifugare a 8.000 G a temperatura ambiente per un minuto. Infine, conservare l'eluato a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per preparare una concentrazione di oligonucleotidi di RNA sintetico che corrisponda al microRNA target, diluire la soluzione madre di 10 volte per ottenere una soluzione funzionante con la concentrazione più alta per tracciare le curve standard.

Successivamente, per costituire un pool multiplex di primer a trascrizione inversa, mescolare volumi uguali dei primer a 20 punti per i microRNA bersaglio. Quindi, preparare la miscela di reazione di trascrizione inversa. Quindi aggiungere 10 microlitri di miscela di reazione di trascrizione inversa a cinque microlitri di campione di RNA.

Mescolare i due pipettandoli più volte. Quindi, incubare la miscela con ghiaccio per cinque minuti. Dopo aver posizionato il campione nel termociclatore, avviare il ciclo.

Una volta terminato il programma, conservare il campione trascritto al contrario a meno 80 gradi Celsius. Per costituire il pool di primer per saggi multiplex, aggiungere volumi uguali di cinque microlitri di primer per saggi corrispondenti a microRNA bersaglio nella provetta contenente tampone Tris-EDTA nel volume finale di 1.000 microlitri. Successivamente, costituire la miscela di reazione di preamplificazione.

Una volta terminata la miscela di reazione, trasferire 22,5 microlitri di miscela di reazione di pre-amplificazione a due virgola cinque microlitri di campione trascritto inverso. Quindi, pipettare per miscelare accuratamente il campione e la miscela master di preamplificazione e incubare su ghiaccio per cinque minuti, quindi lasciare le provette PCR nel termociclatore e iniziare la corsa. Una volta terminato il programma, trasferire tutti i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Dopo aver scongelato i campioni pre-amplificati o non pre-amplificati, diluirli cinque volte con acqua sterile. Per generare la curva standard, eseguire una diluizione seriale di 10 volte dei campioni derivati da oligonucleotidi di RNA sintetici. Quindi, costituire la miscela quantitativa di reazione PCR in una provetta tenuta in ghiaccio.

Quindi aggiungere 18 microlitri dalla miscela di reazione PCR quantitativa alle piastre di reazione ottiche veloci a 96 pozzetti. Quindi aggiungere due microlitri dei campioni diluiti nei pozzetti. Dopo aver sigillato la piastra con pellicola adesiva, centrifugare brevemente il campione a 500 G per 15 secondi.

Quindi avviare il programma Thermocycler in tempo reale. Utilizzare un software SDS versione 2.4 che funziona con il corrispondente termociclatore in tempo reale per calcolare il numero di copie grezze di ciascun campione. Quindi calcola il numero di copie assoluto dal numero di copie non elaborate utilizzando il software Excel.

L'efficienza di amplificazione di miR-122, miR-192 e miR-133a è stata analizzata tracciando curve standard, il che spiega la relazione tra la concentrazione logaritmica e il ciclo di quantificazione per i campioni non preamplificati. Le curve standard per miR-122, miR-192 e miR-133a mostrano una relazione lineare tra i cicli di quantificazione e la concentrazione logaritmica dei campioni. Successivamente, l'efficienza di amplificazione di miR-1, miR-499a e miR-206 è stata analizzata tracciando curve standard per campioni preamplificati.

Per analizzare l'efficienza di amplificazione, la pendenza è stata calcolata utilizzando la regressione lineare. La pendenza nella curva standard A mostra l'assenza di ampliconi specifici a 1.000 copie per concentrazione di microlitro per miR-499a e miR-206. Tuttavia, gli ampliconi non specifici sono stati ottenuti a 1.000 copie per microlitro per il miR-1.

Qui, campioni di miR-206 non pre-amplificati e pre-amplificati sono stati utilizzati in duplicati per derivare i grafici di amplificazione. I valori del ciclo di quantificazione per il miR-206 non pre-amplificato e pre-amplificato sono stati stimati in 39,9, più o meno un virgola nove e 27,0, più o meno due virgola due, rispettivamente, che rappresentano valori quasi simili tra i duplicati come mostrato nei grafici. Successivamente, i microRNA plasmatici ottenuti dalle scimmie Cynomolgus sono stati sottoposti a profilazione per calcolare i loro valori assoluti.

I dot plot, ottenuti dal profilo dei microRNA che rappresentano i loro livelli di espressione, mostrano che miR-122, miR-133a e miR-192 sono rilevabili senza pre-amplificazione. Considerando che, miR-1, miR-206 e miR-499a richiederanno una pre-amplificazione a causa dei bassi livelli di espressione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i livelli assoluti di microRNA plasmatico, utilizzando la RT-qPCR.

E pre-amplificazione; è utile per migliorare la rilevazione con piccole quantità di microRNA.