Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche
22 agosto 2018
Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.
L'obiettivo principale di questo protocollo di western blotting è quello di eseguire western blot su un piccolo numero di cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali ematopoietiche, come la presenza o l'abbondanza di proteine specifiche o l'attivazione di vie di segnalazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede meno di 20.000 cellule, quindi sono necessari meno animali per analizzare popolazioni rare di cellule primarie.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di trovare modi per ridurre il numero di topi che dovevamo utilizzare per le analisi delle cellule staminali ematopoietiche. A dimostrare la procedura sarà Xiongwei Cai, un post-doc del mio laboratorio. Utilizzare un rotore a secchiello oscillante per centrifugare provette da 1,5 millilitri contenenti cellule staminali ematopoietiche e progenitrici selezionate a 500 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Una volta terminata la centrifugazione, scartare tutto tranne 100 microlitri di surnatante, senza disturbare il pellet cellulare. Se le cellule sono inferiori a 5.000 e il volume del campione selezionato è inferiore a 0,2 millilitri, prima di centrifugare, trasferire le cellule in provette PCR da 0,2 millilitri a basso legame prima della centrifugazione. Tuttavia, se ci sono meno di 5.000 celle, ma il volume del campione selezionato è superiore a 0,2 millilitri, centrifugare le celle a 500 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, scartare tutto tranne 200 microlitri di surnatante. Quindi risospendere il pellet e i restanti 200 microlitri di surnatante. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in provette PCR da 0,2 millilitri e centrifugare.
Quindi sospendi nuovamente il pellet in 20-30 microlitri di surnatante e getta il resto. Se necessario, aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato nel siero fetale bovino al 2% o albumina sierica bovina al 2% alle cellule sospese. Quindi utilizzare un contatore di cellule automatizzato per determinare la concentrazione cellulare utilizzando da due a cinque microlitri di cellule in sospensione.
Successivamente, utilizzare un puntale per pipetta da 20 o 100 microlitri per trasferire un volume di 500, 1.000 e 2.000 cellule staminali ematopoietiche e progenitrici in nuove provette da 1,5 millilitri. Utilizzare un rotore a secchiello oscillante per centrifugare le celle a quattro gradi Celsius a 500 volte la gravità per cinque minuti. Quindi seguire le istruzioni del produttore per sciogliere l'inibitore della fosfatasi e del proteasoma e il DMSO per preparare una soluzione madre 100 volte.
Quindi diluire il tampone campione Laemmli quattro volte con volumi equivalenti di acqua distillata per ottenere un tampone campione Laemmli due volte. Quindi aggiungere quantità appropriate della soluzione madre 100 volte di fosfatasi e inibitore del proteasoma per regolare la concentrazione finale a due inibitori e due volte il tampone del campione di Laemmli. Regolare il volume del surnatante residuo nella provetta in modo tale che l'aggiunta di volumi uguali di tampone Laemmli due volte insieme all'inibitore della fosfatasi e del proteasoma raggiunga una concentrazione finale di 500 cellule per microlitro e di un tampone Laemmli volta.
E poi risospendere per formare il lisato. Prima di caricare il gel, riscaldare il campione di lisati a 95 gradi Celsius in un blocco termico per cinque minuti. Utilizzando protocolli standard l'elettroforesi da uno a 40 microlitri di lisato equivalenti a 500-20.000 celle tramite pagina SDS a 100 volt.
Dopo aver trattato la membrana in polivinilidene con metanolo per pochi secondi, lavare brevemente la membrana con acqua distillata. Quindi trasferire la proteina dal gel alla membrana secondo le istruzioni fornite dal produttore dell'apparato di trasferimento. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con due millilitri di albumina sierica bovina al 2% e soluzione salina tamponata con fosfato con 0,1% Tween durante la notte a quattro gradi Celsius secondo i protocolli standard.
Dopo aver bloccato la membrana, incubarla con anticorpi diluiti per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare la membrana tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato allo 0,1%Tween 20 per cinque minuti ciascuno a temperatura ambiente. Successivamente, incubare la membrana con due millilitri di tampone chemiluminescente potenziato per un minuto a temperatura ambiente.
Rileva i segnali utilizzando un sistema di imaging. Per confrontare i segnali della beta actina, i lisati sono stati preparati da cellule staminali ematopoietiche e progenitrici urinarie e sottoposti ad analisi western plot. E' chiaro dall'amino blot che c'è una diminuzione del segnale della beta actina dai lisati preparati da 2.000 a 500 progenitori ematopoietici e cellule staminali caricate in pozzetti da 1,5 millimetri su un gel di pagina SDS al 12%.
Inoltre, per confrontare i segnali di beta actina ottenuti da diverse dimensioni di pozzetti gettati sul gel. I lisati sono stati caricati in pozzetti da 1,5 e tre millimetri sul gel e poi sottoposti ad analisi western blot. Il blot mostra che il segnale della beta actina ottenuto dal lisato preparato da 500 progenitori ematopoietici caricati in un pozzetto da 1,5 millimetri è molto più forte di quando caricato in un pozzetto da tre millimetri.
Successivamente, per confrontare i segnali per il fattore di iniziazione eucariotico 4G, l'actina e la fosforilazione della proteina ribosomiale S6 in risposta alla stimolazione del fattore delle cellule staminali delle citochine, i lisati ottenuti sono stati analizzati mediante amino blot. Il blot mostra la presenza di intensità di segnale più elevate per tutte e tre le proteine nei genitori ematopoietici con stimolazione del fattore delle cellule staminali delle citochine. Rispetto al controllo in vitro è anche chiaro che c'è un aumento dell'intensità del segnale per tutte e tre le proteine da diversi volumi di cellule staminali ematopoietiche.
Una volta padroneggiato, tecnicamente questo può essere fatto in 48 ore. Se viene affrontato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di contare accuratamente le cellule e di dirigere le cellule del lisato con un tampone di caricamento.
Dopo questo sviluppo, è tecnicamente possibile consentire ai ricercatori nel campo della ricerca sulle cellule staminali di esplorare le vie di segnale in un piccolo numero di cellule. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la trama occidentale con un piccolo numero di pezzi di indirizzo. Prestare attenzione alle aree usate per la pagina SDS.
Grazie per aver guardato. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo ottimizzato di Western blotting progettato per analizzare anche soli 500 cellule staminali o progenitrici ematopoietiche. Il metodo sottolinea una manipolazione accurata dei campioni e una lisi diretta nel buffer campione di Laemmli.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Cellule staminali ematopoietiche
- Tecniche di Western blotting
- Analisi delle proteine cellulari
Sfondo
- Il blotting Western è una tecnica ampiamente utilizzata per l'analisi delle proteine.
- L'analisi di piccole popolazioni cellulari può ridurre la necessità di modelli animali.
- L'ottimizzazione dei protocolli può migliorare l'efficienza della rilevazione delle proteine.
- Questo metodo affronta le difficoltà nello studio di popolazioni cellulari rare.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per il Western blot con un numero minimo di cellule.
- Facilitare l'analisi di proteine specifiche nelle cellule staminali ematopoietiche.
- Ridurre il numero di animali necessari per la ricerca.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un rotore a cestelli oscillanti per la centrifugazione.
- Centrifugazione di cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici ordinate.
- Lisi diretta delle cellule nel buffer campione di Laemmli.
- Ottimizzazione della manipolazione dei campioni per ridurre al minimo le perdite.
Risultati principali
- Il protocollo consente l'analisi di meno di 20.000 cellule.
- Fornisce un rilevamento affidabile di proteine specifiche.
- Riduce la necessità di popolazioni animali più numerose negli esperimenti.
- Efficacia dimostrata nello studio delle vie di segnalazione.
Conclusioni
- Questo protocollo ottimizzato di Western blotting è efficace per popolazioni cellulari ridotte.
- Contribuisce a pratiche di ricerca più etiche riducendo l'uso di animali.
- Il metodo può favorire la comprensione nel campo delle cellule staminali ematopoietiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'analisi delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) rare rappresenta un collo di bottiglia significativo nella validazione degli obiettivi a causa della disponibilità limitata di campioni, spesso richiedente ampie coorti di animali. Questo protocollo consente l'analisi diretta delle proteine a partire da soli 500 HSC, riducendo in modo significativo la variabilità biologica e l'uso di animali, mantenendo al contempo l'affidabilità del rilevamento. Riducendo la soglia minima di cellule necessarie, il metodo supporta la riduzione precoce dei rischi meccanicistici nei flussi di scoperta, in cui l'abbondanza dell'obiettivo e l'attivazione della via devono essere confermate in popolazioni fisiologicamente rilevanti ma a basso rendimento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in cellule staminali ematopoietiche (HSC) fenotipicamente definite con input minimo, supportando la valutazione della presenza del bersaglio e dell'attivazione delle vie di segnalazione.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da artefatti di espansione analizzando direttamente cellule primarie appena ordinate, lisate nel tampone campione.
- Valore predittivo: Facilita la validazione funzionale di nodi di segnalazione (ad esempio, fosforilazione di S6, eIF4G) in condizioni stimolate da citochine, migliorando la fiducia nella modulazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera lisati standardizzati compatibili con SDS-PAGE e immunoblotting, consentendo una rilevazione proteica riproducibile indipendentemente dal numero di cellule utilizzate.
- Output quantitativo: Permette la normalizzazione rispetto al numero di cellule (500–15.000 cellule), supportando confronti di risposta a dose e stimolazione in campioni limitati.
- Adattabilità della piattaforma: Utilizza reagenti e attrezzature standard, facilitando il trasferimento tra laboratori senza necessità di infrastrutture specializzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta letture di tipo biomarcatore (ad esempio, β-actina, fosfo-S6) in modelli ematopoietici rilevanti per la malattia, collegando risultati ottenuti ex vivo a segnalazioni in vivo.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi dei percorsi in cellule primarie, riducendo i falsi positivi derivanti da linee trasformate e migliorando la valutazione della specificità del bersaglio.
- Allineamento preclinico: Dati ottenuti da piccoli numeri di cellule staminali ematopoietiche possono guidare studi sull'interazione con il bersaglio prima di passare a modelli preclinici di maggiori dimensioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase di scoperta iniziale fino alla transizione preclinica, in particolare nei casi in cui la validazione dell'obiettivo dipende da letture del segnale cellulare primario che non possono essere modellate in popolazioni bulk o espanse.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi nei compartimenti rari di cellule staminali/progenitrici consentendo la lisi diretta e l'immunoblotting senza artefatti indotti dalla coltura.
- Screening: Permette saggi riproducibili basati su Western blot per lo stato di fosforilazione o l'espressione proteica in HSC ordinate, adatti per la validazione a bassa capacità.
- Analisi: Fornisce output quantitativi, suscettibili di normalizzazione (ad esempio, intensità del segnale ogni 500 cellule), che consentono il confronto tra diverse condizioni di stimolazione o genotipi.
- Ricerca traslazionale: Collega gli eventi di segnalazione ex vivo alla funzione ematopoietica, supportando la valutazione di bersagli allineata ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo utilizza flussi di lavoro standard per il Western blot, rendendolo una capacità riutilizzabile tra gruppi di immunologia, oncologia e medicina rigenerativa che studiano popolazioni ematopoietiche rare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo consentendo l'analisi di cellule ematopoietiche native a bassa abbondanza senza distorsioni dovute all'amplificazione.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione per la Western blot con quantità ridotte di materiale, migliorando la riproducibilità tra diversi laboratori e riducendo la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Riduce i rischi nella selezione dell'obiettivo confermando la modulazione del percorso in cellule primarie, diminuendo i fallimenti tardivi dovuti a un allineamento errato dell'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate su dati meccanicistici ottenuti da cellule fisiologicamente rilevanti, migliorando l'efficienza nell'allocazione del capitale durante la priorizzazione degli obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel sorting delle cellule ematopoietiche, nel conteggio accurato e nella lisi delicata per prevenire la perdita del campione.
- Necessita dell'accesso a centrifughe con rotori a cestello oscillante, provette per PCR e apparecchiature standard per Western blot (cubetti elettroforetici, sistemi di trasferimento, sistemi di acquisizione immagini).
- Richiede protocolli standardizzati di manipolazione per garantire volumi costanti di rimozione del sopranatante e di risospensione tra diversi utilizzatori.
- Deve tenere conto della variabilità nella vitalità cellulare e nel rendimento quando si adatta ad altri tipi cellulari rari ematopoietici o non ematopoietici.
- Limite pratico: il rilevamento del segnale dipende dalla sensibilità degli anticorpi e dall'abbondanza della proteina bersaglio; per proteine con espressione molto bassa potrebbe essere necessaria un'amplificazione del segnale o la combinazione di campioni.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Sample Preparation
4:20
Electrophoresis, Transfer, and Block
5:30
Antibody Labeling and Detection
6:09
Results: Use of Optimized Western Blotting Technique to Analyze Small Numbers of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
7:56
Conclusion
