Name: Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri il metodo CiDER per l'idrossimetilazione inducibile del DNA e il rimodellamento epigenetico nelle cellule mammifero. Questa tecnica offre controllo temporale preciso delle modifiche epigenetiche con induttori chimici.

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Ringraziamo la finanziaria concedono supporti dai National Institutes of Health (R01GM112003 a YZ), la Fondazione di Welch (BE-1913-YZ), l'American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE per YZ), la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (RR140053 a YH, RP170660 a YZ), associazione americana del cuore (16IRG27250155 a YH) e il programma di premio di ricerca collaborativa Fondazione John S. Dunn.

1. cultura, plasmide transfezione e induzione chimica delle cellule
<ol>
	<li>Cultura una linea cellulare aderente (ad es., il rene embrionale umano delle cellule HEK293T) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM), completata con 10% inattivati siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Transfect cellule con il plasmide di sidro.
	<ol>
		<li>Almeno 18 h prima di transfezione, seme 0,3 x 106 cellule in 2,5 mL di DMEM appropriato per bene in una piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C durante la notte per raggiungere confluency di 60-80%.</li>
		<li>Pre-riscaldare il reagente di transfezione a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
		<li>Posto 250 µ l di medium senza siero in una provetta sterile. Nota: Tale importo è su misura per una piastra a 6 pozzetti con confluency di 80%. Se necessario, regolare proporzionalmente gli importi medi secondo le dimensioni delle piastre o numeri di cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 µ g del plasmide codifica sidro18 o il dominio catalitico di TET2 (TET2CD come controllo positivo)12,13 nel medium privo di siero e delicatamente mescolare pipettando.</li>
		<li>Aggiungere 7,5 µ l di reagente di transfezione per la miscela di DNA diluita e mescolare delicatamente pipettando.</li>
		<li>Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min.</li>
		<li>Cambiare supporto pre-riscaldato e aggiungere la miscela drop-wise pozzetti e scuotere delicatamente la piastra di coltura cellulare per distribuire uniformemente il reagente di transfezione e la miscela di DNA.</li>
		<li>Incubare le cellule e miscela per una notte e quindi sostituire il reagente di transfezione contenente media con 2ml di DMEM completo fresco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Induzione chimica
	<ol>
		<li>Diluire 2 mM di rapamicina stock (dissolto in DMSO) a una concentrazione di 20 µM su mezzo completo adeguato.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l di rapamicina diluito a transfected le cellule mantenute in 2 mL medium per raggiungere una concentrazione finale di 200 nM. Nota: Dopo incubazione per 48 h, le cellule sono pronte per la quantificazione della generazione di 5hmC o qualsiasi altre applicazioni a valle. Se necessario, l'efficienza di induzione può essere monitorato tenendo fuori cellule ogni 3 h per ulteriori 5hmC quantificazione come descritto di seguito e illustrato nella Figura 1.</li>
		<li>Per migliore quantificazione dell'efficienza di induzione di 5hmC, seme separare pozzi per monitorare le cellule ogni 3 ore.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. quantificazione della produzione indotta da rapamicina 5hmC immunostaining
<ol>
	<li>5hmC colorazione di immunofluorescenza Nota: Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di fissazione, composto di paraformaldeide al 4%, 0,2% tensioattivo (ad esempio Triton X-100) in PBS con 3 N HCl, per coprire tutte le celle nella piastra. Ad esempio, 500 µ l di soluzione sarebbe sufficiente per un pozzo in una piastra a 6 pozzetti. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente.<ol>
		<li>Per correggere le celle, aggiungere paraformaldeide al 4% in PBS cellule trattate con rapamicina per 15 min a temperatura ambiente. Per il gruppo di controllo, utilizzare le cellule che esprimono mCherry-sidro senza trattamento rapamicina. Non agitare. Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare una protezione appropriata.</li>
		<li>Scartare la soluzione fissante. Incubare le cellule fisse con tensioattivo 0,2% in PBS per 30 min per permeabilize della membrana cellulare.</li>
		<li>Eliminare la soluzione di permeabilizzazione. Aggiungere 3 N HCl a celle permeabilized e incubare per 15 minuti per denaturare il DNA.</li>
		<li>Scartare HCl. Add 100 mM Tris-HCl tampone (pH 8.0 alle cellule per 10 min per neutralizzazione del pH).</li>
		<li>Smaltire tutta la soluzione. Lavare le cellule accuratamente con PBS per 3 - 5 volte. Rimuovere accuratamente la PBS. Nota: Aggiungere una quantità sufficiente di PBS per ogni passaggio di lavaggio. Per esempio, 1 mL di PBS è sufficiente per una piastra a 6 pozzetti.</li>
		<li>Bloccare le cellule aggiungendo il tampone di bloccaggio composto da BSA 1% e lo 0,05% di tensioattivo (ad esempio di Tween 20) in PBS per 1 h con agitazione delicata.</li>
		<li>Scartare la soluzione bloccante. Aggiungere l'anticorpo 5hmC diluito (1: 200) per le cellule e incubare per 2 ore a temperatura ambiente o tutta la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS tre volte per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere un fluoroforo diluito (FITC)-coniugato anticorpo secondario (1: 200) per le cellule e incubare per 1 h.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS tre volte estesamente per rimuovere anticorpi residui.</li>
		<li>Aggiungere 250 ng/mL di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per macchiare il nucleo per 5 min, rimuovere la soluzione colorante.</li>
		<li>Montare la piastra di coltura diapositiva o con fondo di vetro con celle immunostained per imaging confocale. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Citometria a flusso Nota: Utilizzare una piastra di fondo tondo 96 pozzetti per la seguente procedura di colorazione. Di solito, 150 µ l di reagenti è sufficiente per ciascun pozzetto.<ol>
		<li>Risospendere le cellule trasfettate e indotta da rapamicina nel buffer di FACS (PBS con BSA 1%, 2 mM EDTA). Per il gruppo di controllo, utilizzare sidro-esprimendo le cellule senza trattamento rapamicina.</li>
		<li>Difficoltà e permeabilize le celle come descritto nel punto 2.1.</li>
		<li>Aggiungere 2 N HCl alle celle per denaturare il DNA per 10 min.</li>
		<li>Scartare HCl. neutralizzare e bloccare le celle come descritto nel punto 2.1.</li>
		<li>Aggiungere un anticorpo anti-5hmC diluito (1: 200) per le cellule e incubare per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare le cellule con buffer di FACS tre volte. Rimuovere accuratamente il buffer di FACS.</li>
		<li>Aggiungere un fluoroforo diluito (FITC)-coniugato anticorpo secondario (1: 400) per fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) e incubare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare le cellule con buffer di FACS tre volte.</li>
		<li>I campioni sono pronti per l'analisi di FACS. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-blot Assay quantificare 5hmC e la 5-metilcitosina (5mC) ammonta
<ol>
	<li>Isolare il DNA di genomic dalle cellule trasfettate e indotta da rapamicina, utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale. Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule trasfettate con sidro senza trattamento rapamicina.</li>
	<li>Riscaldare il forno vuoto a membrana di nitrocellulosa 80 ° C e pre-immersione in bidistillata H2O e poi in 6 x tampone salino-sodio citrato (SSC) per 10 min.</li>
	<li>Caricare 60 µ l di uguali quantità di DNA (totale 2 µ g in buffer di TE) per una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 30 µ l di tampone di TE (Tris-HCl 10 mM, 1 mM EDTA, pH 8.0) il resto nei pozzetti.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali verticalmente sulla piastra 96 pozzetti trasferendo 30 µ l di soluzione sulla riga 1 nella stessa posizione della colonna nella riga 2. Mescolare nuovamente e 30 µ l di soluzione di trasferimento per i pozzi nella riga successiva fino a raggiungere il confine.</li></ol>Rimuovere le ultime 30 µ l.
	<li>Aggiungere 20 µ l di 1 M NaOH e 10 mM EDTA in ciascun pozzetto, sigillare la piastra e riscaldare la miscela per 10 min a 95 ° C per denaturare completamente il duplex di DNA.</li>
	<li>Immediatamente raffreddare i campioni su ghiaccio e aggiungere 50 µ l di acetato di ammonio ghiacciata 2 M (pH 7.0) e incubare in ghiaccio per 10 min. Nota: Passaggi 3,7-3.10 coinvolge l'uso del vuoto.</li>
	<li>Montare l'apparecchiatura di macchia del puntino con membrana pre-impregnata e rimuovere residui buffer utilizzando il vuoto completo.</li>
	<li>Lavare la membrana con l'aggiunta di 200 µ l di buffer di TE ad ogni pozzetto dell'apparato di dot blot. Girare a vuoto per rimuovere il buffer di TE.</li>
	<li>Caricare il DNA denaturato (preparato nei passaggi precedenti 3.1-3.6) in ciascun pozzetto dell'apparato di dot blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere la soluzione.</li>
	<li>Lavare la membrana con l'aggiunta di 200 µ l di 2X SSC e Rimuovi soluzioni residuale utilizzando completamente vuoto.</li>
	<li>Smontare l'apparato di dot blot, togliere la membrana e sciacquare l'intera membrana con 20 mL di 2 x SSC.</li>
	<li>Asciugare la membrana per 20 min.</li>
	<li>Cuocere in forno la membrana a 80 ° C sotto vuoto per 2 h.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione bloccante (5% latte scremato in TBST) alla membrana e incubare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare la soluzione bloccante. Aggiungere un 5hmC diluito (1:5, 000) o 5mC (1:1, 000) anticorpi alla membrana e incubare per una notte a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 min per rimuovere anticorpi residui. Rimuovere accuratamente TBST.</li>
	<li>Aggiungere un anticorpo secondario coniugato HRP (01:10, 000 per anti-coniglio HRP(5hmC) o 1:3,000 per anti-mouse HRP(5mC)) alla membrana e incubare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere ECL western blotting substrato alla membrana per visualizzazione di segnali 5hmC utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1E.</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui abbiamo illustrato l'uso di un enzima di Spalato-TET2 derivati dal raggiungere il controllo temporale del DNA hydroxymethylation. Dopo la scoperta della famiglia di TET di 5-methycytosine diossigenasi, molti studi sono stati effettuati per decifrare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro principali prodotto catalitica 5hmC1,2,3, 4,5,<...

Metilazione del DNA, per lo più l'aggiunta di un gruppo metile in posizione del carbonio 5 della citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC) si riferisce, è catalizzata dalla DNA metil-transferasi (DNMTs). 5mc agisce come un segno importante epigenetico nel genoma dei mammiferi che spesso i segnali per la repressione trascrizionale, inattivazione del cromosoma x e trasposoni silenziamento1. L'inversione di metilazione del DNA è mediata dalla famiglia delle proteine di traslocazione (TET) Ten-elfico. Gli enzimi TET appartengono al ferro (II) e 2-ossoglutarato dipendenti diossigenasi che catalizzano l'ossidazione successivo di 5mC 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediata 5mC ossidazione impone un ulteriore livello di controllo epigenetico sopra il genoma dei mammiferi. La scoperta del TET ha suscitato interesse intenso nel campo epigenetico di svelare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro 5hmC catalitica dei principali prodotti. 5hmC non è solo un intermedio durante il TET-mediata attivo DNA demetilazione2,3,4, ma anche atti come stalla epigenetica mark5,6,7,8 . Anche se hydroxymethylation del DNA è altamente correlato con l'espressione genica e aberrante cambiamenti nel DNA hydroxymethylation sono associati con alcuni disordini umani9,10,11, i rapporti di causalità tra le modifiche epigenetiche sul DNA e i fenotipi rimangono spesso difficile da stabilire, che può essere parzialmente attribuita alla mancanza di strumento affidabile con precisione aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma presso definito temporale e spaziale ad alta risoluzione.
Qui segnaliamo l'uso di una prodotto chimico-inducible epigenome rimodellamento strumento (sidro) per superare l'ostacolo di fronte gli studi delle relazioni causali tra trascrizione del DNA hydroxymethylation e gene. Il design è basato sul presupposto che il dominio catalitico di TET2 (TET2CD) può essere diviso in due frammenti inattivi quando espresso in cellule di mammifero e sua funzione enzimatica può essere ripristinato attraverso un approccio di dimerizzazione chimicamente inducibile ( Figura 1A). Per stabilire un sistema di Spalato-TET2CD, abbiamo selezionato sei siti in TET2CD, composto di una regione ricca di Cys e una piega doppia elica β-elica (DSBH), sulla base di una struttura di cristallo segnalati di TET2-DNA complesso che manca di una regione di bassa complessità12. Un gene sintetico che codifica la proteina rapamicina-inducible dimerizzazione modulo FK506 12 (FKBP12) e dominio di legame di rapamicina FKBP (FRB) dell'obiettivo mammifero della rapamicina14,15, insieme a un peptide self-che fende T2A polipeptide sequenza16,17, singolarmente è stato inserito nei siti selezionati di Spalato all'interno di TET2CD. La selezione di TET2 come nostro obiettivo engineering si basa sulle seguenti considerazioni. Mutazioni somatiche, prime TET2 con concomitante riduzione del DNA hydroxymethylation sono osservate frequentemente in disordini umani tra cui disordini mieloidi e cancro10, che fornisce informazioni utili su siti sensibili deve essere evitato per inserimento. In secondo luogo, non una grande frazione di TET2 dominio catalitico, specialmente la regione di bassa complessità, è indispensabile per la funzione enzimatica12, consentendoci così di una split-TET2 minimizzato per modificazioni epigenetiche viscoelastiche del mestiere. Dopo lo screening oltre 15 costrutti, un costrutto che ha esibito più alto rapamicina-inducible restauro della sua attività enzimatica nel sistema mammifero è stato scelto e designato come sidro18. Qui descriviamo l'uso di sidro mCherry-etichetta per raggiungere viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico con rapamicina e presentiamo tre metodi per la convalida di produzione 5hmC sidro-mediata in un sistema cellulare modello HEK293T.

<table><tbody><tr><td>Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, soluzione al 16%</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, Bovino</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-Idrossimetilcitosina (5-hmC) anticorpo (pAb)</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LAB Forno sottovuoto economico, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-5-metilcitosina (5mC), clone 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, Tecnologia</td><td>di segnalazione cellulare</td> anticorpale legata a HRP <td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG, </td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td> anticorpale legata a HRP <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

un enzima split-tet2 ingegnerizzati per chimica-inducible dna hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica stabile ed ereditabile nel genoma dei mammiferi ed è coinvolta nella regolazione dell'espressione genica per controllare funzioni cellulari. L'inversione di metilazione del DNA, o demetilazione del DNA, è mediato dalla famiglia dieci-undici traslocazione (TET) proteina di diossigenasi. Anche se ampiamente è stato segnalato che aberrante metilazione del DNA e demetilazione sono associati con il cancro e difetti inerenti allo sviluppo, come questi cambiamenti epigenetici direttamente contribuiscano a successive modifiche in progressione di malattia o di espressione di gene rimane poco chiaro, in gran parte a causa della mancanza di strumenti affidabili accuratamente aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma a risoluzione temporale e spaziale definita. Per superare questo ostacolo, abbiamo progettato un enzima di Spalato-TET2 per abilitare il controllo temporale della 5-metilcitosina (5mC) ossidazione e successivo rimodellamento degli Stati epigenetici in cellule di mammifero semplicemente aggiungendo sostanze chimiche. Qui, descriviamo i metodi per l'introduzione di uno strumento di ritocco epigenome chimico-inducibile (sidro), basato su un enzima derivati dal Spalato-TET2, in cellule di mammifero e quantificare la produzione chimica inducibile di 5-idrossimetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometria a flusso o un'analisi della macchia del puntino. Questo strumento di ritocco del chimico-inducible epigenome troveranno ampio uso in sistemi cellulari di interrogare senza alterare il codice genetico, così come nel sondaggio i rapporti di epigenotype−phenotype in vari sistemi biologici.

Conversione di 5mC-a-5hmC inducibile chimica può essere convalidato da immunostaining a livello di singola cellula, analisi di citometria a flusso su popolazioni cellulari trasfettate (mCherry-positivo) o un'analisi più quantitativa di macchia del puntino come illustrato nella Figura 1. Il dominio catalitico di TET2, o TET2CD, sono stati utilizzati in tutto lo studio come controllo positivo. Vedere riferimenti 18-20 per maggiori dettagli riguardo la mappatura...

Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

L'obiettivo generale di questa serie di esperimenti è quello di introdurre un enzima split-TET2 ingegnerizzato chiamato CiDER nelle cellule di mammifero per la modifica inducibile del DNA come l'idrossimetilazione e il rimodellamento epigenetico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'enzima split-TET2 ingegnerizzato consente il controllo temporale dell'ossidazione della 5-metilcitosina e il successivo rimodellamento degli stati epigenetici nelle cellule di mammifero con additivi chimici. Per iniziare questa procedura, coltivare una linea cellulare aderente in DMEM integrata con FBS inattivato al calore al 10% e 100 unità per millilitro di penicillina e streptomicina.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Trasfettare le cellule con il plasmide CiDER come descritto nel protocollo di testo. Quindi incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius.Il giorno seguente, sostituire il terreno contenente il reagente di trasfezione con un DMEM completo fresco. Per indurre chimicamente le cellule, aggiungere 20 microlitri di rapamicina diluita alle cellule trasfettate mantenute in due millilitri di terreno per raggiungere una concentrazione finale di 200 nanomolari. Per eseguire la citometria a flusso, risospendere le cellule trasfettate e indotte dalla rapamicina nel tampone FACS.Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule che esprimono CiDER senza trattamento con rapamicina. Fissare e permeabilizzare le celle come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere due normali acidi cloridrici alle cellule per denaturare il DNA per 10 minuti.Dopo aver neutralizzato e bloccato le cellule come descritto nel protocollo di testo, aggiungere l'anticorpo anti-5hmC diluito alle cellule. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente o per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le celle con tampone FACS tre volte.Rimuovere completamente il buffer FACS. Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo diluito per l'analisi FACS e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare le celle con tampone FACS tre volte.Dopo il lavaggio, i campioni sono pronti per l'analisi FACS. Isolare il DNA genomico da cellule trasfettate e indotte da rapamicina utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale. Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule trasfettate CiDER senza trattamento con rapamicina.Riscaldate il forno sottovuoto a 80 gradi Celsius. Pre-immergere la membrana di nitrocellulosa in acqua distillata doppia e poi in tampone SSC 6X per 10 minuti. Quindi, caricare 60 microlitri di uguali quantità di DNA su una piastra PCR a 96 pozzetti.Aggiungere 30 microlitri di tampone TE ai pozzetti di riposo. Effettuare due diluizioni seriali verticalmente sulla piastra a 96 pozzetti trasferendo 30 microlitri di soluzione nella prima riga nella stessa posizione della colonna nella seconda riga. Mescolare nuovamente e trasferire 30 microlitri di soluzione nei pozzetti della fila successiva fino al raggiungimento del limite.Quindi rimuovere gli ultimi 30 microlitri dal pozzo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di idrossido di sodio molare e 10 millimolari di EDTA in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e scaldare la miscela per 10 minuti a 95 gradi Celsius per denaturare completamente il DNA duplex.Raffreddare immediatamente i campioni con ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri di acetato di ammonio a due molari ghiacciato in ciascun pozzetto e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Nel frattempo, assemblare l'apparato dot-blot con la membrana pre-imbevuta.Rimuovere il tampone residuo utilizzando un vuoto completo. Lavare la membrana aggiungendo 200 microlitri di tampone TE a ciascun pozzetto dell'apparato dot-blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere il tampone TE.Quindi, caricare il DNA denaturato in ciascun pozzetto dell'apparato dot-blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere la soluzione. Lavare la membrana aggiungendo 200 microlitri di 2X SSC e rimuovere completamente le soluzioni residue utilizzando un aspirapolvere.Smontare l'apparecchio a punti. Quindi estrarre la membrana e sciacquare l'intera membrana con 20 millilitri di 2X SSC. Asciugare la membrana all'aria per 20 minuti.Per asciugare ulteriormente la membrana, cuocetela a 80 gradi sottovuoto per due ore. Aggiungere la soluzione bloccante alla membrana e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver scartato la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi 5-hmC o 5-mC diluiti alla membrana e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti per rimuovere gli anticorpi residui. Dopo aver rimosso accuratamente il TBST, aggiungere un anticorpo secondario coniugato HRP alla membrana. Incubare la membrana per un'ora a temperatura ambiente.Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti. Infine, aggiungere il substrato di western blotting ECL alla membrana per la visualizzazione dei segnali 5-hmC utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo della quantificazione della produzione di 5-hmC mediata da CiDER mediante citometria a flusso.Solo le cellule che esprimono CiDER in condizioni trattate con rapamicina mostrano un aumento significativo dei livelli di 5-hmC. Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo della variazione globale del livello di 5-hmC nell'intera popolazione cellulare mediante saggio dot-blot. Il controllo del carico è visualizzato mediante colorazione con blu di etilene delle quantità totali di DNA in ingresso.I risultati dimostrano che il trattamento con rapamicina induce una robusta produzione di 5-hmC nelle cellule HEK293T che esprimono CiDER con attività di fondo trascurabile. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare la funzione cellulare senza alterare il codice genetico e per sondare le relazioni tra epigenotipo e fenotipo in vari sistemi biologici.

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Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

DNA e proteine ​​sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine ​​metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati ​​sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Le endonucleasi di restrizione con nuova specificità della sequenza possono essere sviluppate da enzimi che riconoscono una sequenza parzialmente degenerata. Qui forniamo un protocollo dettagliato che abbiamo usato con successo per alterare la specificità della sequenza dell'enzima NlaIV. Gli ingredienti chiave del protocollo sono la compartimentazione in vitro della reazione di trascrizione/traduzione e la selezione di varianti con nuove specificità di sequenza.

In Vitro Diretto Evoluzione di una restrizione Endonucleato con più stringente specificità

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un'efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un'ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Qui, presentiamo un protocollo per ridurre le modifiche del DNA nei batteriofagi utilizzando l'enzima NgTET, consentendo una mutagenesi CRISPR-Cas efficiente e senza cicatrici. Questo metodo facilita l'ingegneria genetica dei fagi per applicazioni in biotecnologia e terapia fagica.

Mutagenesi precisa dei fagi con i sistemi CRISPR-Cas assistiti da NgTET

Questo protocollo descrive un sistema non integrativo, basato su CRISPR/dCas9 episomiale per l'editing epigenetico mirato nelle cellule K562, che combina effettori dCas9-DNMT3A e dCas9-HDAC1 con sgRNA specifici per indurre la metilazione del DNA locus-specifica con precisione e riduzione degli effetti off-target.

Ingegneria epigenetica delle cellule K562: strategia episomiale a doppio vettore per la metilazione mirata stabile del DNA utilizzando le proteine di fusione dCas9-DNMT3A e -HDAC1

Scopri il metodo CiDER per l'idrossimetilazione inducibile del DNA e il rimodellamento epigenetico nelle cellule mammifero. Questa tecnica offre controllo temporale preciso delle modifiche epigenetiche con induttori chimici.

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

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