Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

L'obiettivo generale di questa serie di esperimenti è quello di introdurre un enzima split-TET2 ingegnerizzato chiamato CiDER nelle cellule di mammifero per la modifica inducibile del DNA come l'idrossimetilazione e il rimodellamento epigenetico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'enzima split-TET2 ingegnerizzato consente il controllo temporale dell'ossidazione della 5-metilcitosina e il successivo rimodellamento degli stati epigenetici nelle cellule di mammifero con additivi chimici. Per iniziare questa procedura, coltivare una linea cellulare aderente in DMEM integrata con FBS inattivato al calore al 10% e 100 unità per millilitro di penicillina e streptomicina.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Trasfettare le cellule con il plasmide CiDER come descritto nel protocollo di testo. Quindi incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno seguente, sostituire il terreno contenente il reagente di trasfezione con un DMEM completo fresco. Per indurre chimicamente le cellule, aggiungere 20 microlitri di rapamicina diluita alle cellule trasfettate mantenute in due millilitri di terreno per raggiungere una concentrazione finale di 200 nanomolari. Per eseguire la citometria a flusso, risospendere le cellule trasfettate e indotte dalla rapamicina nel tampone FACS.

Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule che esprimono CiDER senza trattamento con rapamicina. Fissare e permeabilizzare le celle come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere due normali acidi cloridrici alle cellule per denaturare il DNA per 10 minuti.

Dopo aver neutralizzato e bloccato le cellule come descritto nel protocollo di testo, aggiungere l'anticorpo anti-5hmC diluito alle cellule. Incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente o per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le celle con tampone FACS tre volte.

Rimuovere completamente il buffer FACS. Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo diluito per l'analisi FACS e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi lavare le celle con tampone FACS tre volte.

Dopo il lavaggio, i campioni sono pronti per l'analisi FACS. Isolare il DNA genomico da cellule trasfettate e indotte da rapamicina utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale. Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule trasfettate CiDER senza trattamento con rapamicina.

Riscaldate il forno sottovuoto a 80 gradi Celsius. Pre-immergere la membrana di nitrocellulosa in acqua distillata doppia e poi in tampone SSC 6X per 10 minuti. Quindi, caricare 60 microlitri di uguali quantità di DNA su una piastra PCR a 96 pozzetti.

Aggiungere 30 microlitri di tampone TE ai pozzetti di riposo. Effettuare due diluizioni seriali verticalmente sulla piastra a 96 pozzetti trasferendo 30 microlitri di soluzione nella prima riga nella stessa posizione della colonna nella seconda riga. Mescolare nuovamente e trasferire 30 microlitri di soluzione nei pozzetti della fila successiva fino al raggiungimento del limite.

Quindi rimuovere gli ultimi 30 microlitri dal pozzo. Quindi, aggiungere 20 microlitri di idrossido di sodio molare e 10 millimolari di EDTA in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e scaldare la miscela per 10 minuti a 95 gradi Celsius per denaturare completamente il DNA duplex.

Raffreddare immediatamente i campioni con ghiaccio. Aggiungere 50 microlitri di acetato di ammonio a due molari ghiacciato in ciascun pozzetto e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Nel frattempo, assemblare l'apparato dot-blot con la membrana pre-imbevuta.

Rimuovere il tampone residuo utilizzando un vuoto completo. Lavare la membrana aggiungendo 200 microlitri di tampone TE a ciascun pozzetto dell'apparato dot-blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere il tampone TE.

Quindi, caricare il DNA denaturato in ciascun pozzetto dell'apparato dot-blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere la soluzione. Lavare la membrana aggiungendo 200 microlitri di 2X SSC e rimuovere completamente le soluzioni residue utilizzando un aspirapolvere.

Smontare l'apparecchio a punti. Quindi estrarre la membrana e sciacquare l'intera membrana con 20 millilitri di 2X SSC. Asciugare la membrana all'aria per 20 minuti.

Per asciugare ulteriormente la membrana, cuocetela a 80 gradi sottovuoto per due ore. Aggiungere la soluzione bloccante alla membrana e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver scartato la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi 5-hmC o 5-mC diluiti alla membrana e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.

Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti per rimuovere gli anticorpi residui. Dopo aver rimosso accuratamente il TBST, aggiungere un anticorpo secondario coniugato HRP alla membrana. Incubare la membrana per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti. Infine, aggiungere il substrato di western blotting ECL alla membrana per la visualizzazione dei segnali 5-hmC utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo della quantificazione della produzione di 5-hmC mediata da CiDER mediante citometria a flusso.

Solo le cellule che esprimono CiDER in condizioni trattate con rapamicina mostrano un aumento significativo dei livelli di 5-hmC. Di seguito è mostrato un risultato rappresentativo della variazione globale del livello di 5-hmC nell'intera popolazione cellulare mediante saggio dot-blot. Il controllo del carico è visualizzato mediante colorazione con blu di etilene delle quantità totali di DNA in ingresso.

I risultati dimostrano che il trattamento con rapamicina induce una robusta produzione di 5-hmC nelle cellule HEK293T che esprimono CiDER con attività di fondo trascurabile. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare la funzione cellulare senza alterare il codice genetico e per sondare le relazioni tra epigenotipo e fenotipo in vari sistemi biologici.