Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cheratinociti umani primari che possono essere utilizzati come modello per studiare la biologia cutanea in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule epidermiche, come ad esempio come viene regolata la differenziazione dei cheratinociti umani o come modello per lo studio delle malattie infiammatorie della pelle. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i cheratinociti umani primari possono essere convenzionalmente isolati dalla pelle adulta di uomini e donne e possono includere la pelle di persone di qualsiasi età di età superiore ai 18 anni.

A dimostrare la procedura sarà Annette Blak Rasmussen, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione da 50 millilitri di tripsina allo 0,25% e glucosio allo 0,1% in DPBS. Quindi, mescolare e filtrare sterilizzare la soluzione.

Preparare 10 millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS, 50 millilitri di DPBS e terreno privo di siero di cheratinociti o KSFM. Aggiungi integratori KSFM e 250 microlitri di gentamicina a 500 millilitri di KSFM. Quindi, preriscaldare le soluzioni a 37 gradi Celsius prima dell'uso.

Raccogli campioni di pelle di 10 centimetri per 15 centimetri da volontari adulti sani sottoposti a chirurgia plastica. Mantieni la pelle fresca trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, conservare il campione di pelle a quattro gradi Celsius durante la notte.

Utilizzando forbici, bisturi e pinze sterilizzati, rimuovere il grasso da sotto la sezione della pelle. Quindi, usando gli aghi, allacciare la sezione cutanea su una copertura sterile sopra una piastra. Con una garza asciutta e sterilizzata, pulire la pelle.

Quindi, seguire con etanolo al 70% su una garza sterilizzata. Successivamente, utilizzando una pialla per piedi, tagliare lo strato epidermico superiore della sezione cutanea e trasferirlo in una capsula di Petri di nove centimetri. Quindi, aggiungere immediatamente 25 millilitri della soluzione di tripsina glucosio DPBS precedentemente preparata alla piastra di Petri.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione di tripsina glucosio DPBS dalla piastra di Petri e aggiungere 10 millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS per inattivare la tripsina. Ora, con due pinze, rilasciare le cellule epidermiche nel mezzo raschiando delicatamente e agitando sia il compartimento epidermico che quello dermico delle sezioni cutanee.

Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico e raccogliere il filtrato in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere le restanti sezioni di pelle in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di RPMI 1640 senza FBS e agitare per 10 secondi. Filtrare questa sospensione attraverso il filtro metallico in un tubo da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare epidermica.

Quindi, aggiungere DPBS a un volume totale di 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 450 volte G e temperatura ambiente, per 10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e, a seconda delle dimensioni del pellet cellulare, risospendere il pellet cellulare epidermico in circa 10 millilitri di 37 gradi Celsius KSFM.

Utilizzando il metodo di colorazione con blu di tripano, contare le cellule al microscopio. Quindi, in ogni pallone di coltura da 75 centimetri quadrati, trasferire otto volte 10 alla sesta cellula, insieme a 12 millilitri di KSMM a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente i palloni di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.

Incubare i cheratinociti in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 100% di umidità e il 5% di CO2. Cambiare il terreno dopo due giorni e poi tre volte alla settimana. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, mantenere la quantità appropriata di soluzione di tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius in un incubatore.

Rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere alle cellule 4,5 millilitri per pallone di coltura da 75 centimetri quadrati di soluzione preriscaldata di tripsina EDTA allo 0,05%. Dopo aver posizionato il pallone di coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato ad allentarsi. Quando circa il 50% delle cellule si è allentato, colpire delicatamente il pallone di coltura contro la mano per allentare le cellule rimanenti.

Quindi, per inattivare la tripsina, aggiungere sei millilitri di RPMI 1640 a 37 gradi Celsius più il 2% di FBS al pallone di coltura da 75 centimetri quadrati e trasferire la sospensione cellulare in provette da 50 millilitri. Sciacquare i matracci di coltura con tre millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS e aggiungere il terreno alle provette da 50 millilitri. Quindi, centrifugare le celle per 10 minuti a 450 volte G e temperatura ambiente.

Utilizzare 10 millilitri di KSFM a 37 gradi Celsius per risospendere le celle pellettate. Quindi, contare e trasferire tre volte 10 alla sesta cellula in un pallone di coltura da 150 centimetri quadrati, insieme a 20 millilitri di KSFM a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente il pallone di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, prima di rimetterle nell'incubatore.

Quando la coltura è confluente all'80-90%, dopo la tripsinizzazione e il trasferimento delle cellule in provette da 50 millilitri, come dimostrato in precedenza in questo video, sciacquare i flaconi di coltura con sei millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS e aggiungerlo alle provette da 50 millilitri. Centrifugare le provette per 10 minuti a 450 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi, preparare il mezzo di congelamento a celle ghiacciate.

Risospendere il pellet della cella in KSFM più il 10% di DMSO. Quindi, dopo aver contato le cellule, congelarle a una densità di sei volte 10 al sesto di cellule per millilitro, utilizzando metodi standard di crioconservazione a congelamento lento. Conservare i cheratinociti in azoto liquido fino al momento dell'uso.

Come si vede qui, i cheratinociti umani sono stati isolati e coltivati, come dimostrato in questo video e poi stimolati con calcio. Queste immagini mostrano i cambiamenti morfologici dovuti all'aggiunta di Calcio nei giorni uno e due, rispetto alle cellule trattate controllate. Oltre ai cambiamenti morfologici, l'aggiunta di Calcio ha comportato anche un aumento della trascrizione dell'mRNA per il marcatore di differenziazione Involucrina, 5,5 volte dopo 24 ore e 3,5 volte dopo 48 ore.

In questo esperimento, i cheratinociti in coltura sono stati stimolati con IL-1 beta per vari periodi di tempo. Come si è visto dal Western blotting, entro cinque minuti, la stimolazione con IL-1 beta ha portato a una rapida fosforilazione della p38 MAP chinasi poiché la stimolazione di IL-1 beta non ha avuto alcun effetto sui livelli proteici totali di p38 MAP chinasi. Dopo un'ora, la fosforilazione della p38 MAP chinasi indotta da IL-1 beta è tornata ai livelli basali.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule epidermiche umane per esplorare il ruolo dei cheratinociti nelle risposte immunitarie innate, nonché nello sviluppo della pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e coltivare cheratinociti primari dalla pelle umana adulta, che possono essere utilizzati come modello per studiare la biologia cutanea in vitro.