Name: Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Impara a isolare e coltivare cheratinociti umani primari da pelle adulta per studiare la biologia cutanea in vitro. Questo metodo consente di esplorare la differenziazione cellulare e le malattie infiammatorie della pelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L'autore desidera ringraziare Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller per il loro supporto tecnico

La raccolta di campioni di pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica richiede l'approvazione del comitato etico nelle istituzioni dell'host. Questo protocollo è stato approvato dal regionale Comitato etico della regione Midtjylland, Danimarca (M-20110027). Il metodo qui descritto è derivato dagli studi simili da Maciaq et al. 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento dei cheratinociti da pelle umana
<ol>
	<li>Iniziare facendo le seguenti soluzioni: 50 mL di soluzione di glucosio di tripsina e 0,1% 0,25% in DPBS. Mix e filtro sterilizzare (0,2 µm) la soluzione. Preparare 10 mL di RPMI-1640 + soluzione di 2% FBS, 50 mL di medium senza siero DPBS e cheratinociti (KSFM). Aggiungere 500 mL di KSFM KSFM integratori e 250 µ l di gentamicina. Pre-riscaldare le soluzioni a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Raccogliere pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica. I campioni di pelle utilizzati sono circa 10 cm x 15 cm, ma possono variare in dimensione. Mantenere la pelle fresca sotto trasporto trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, il campione di pelle possa essere conservato a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere il grasso da sotto la sezione di pelle utilizzando pinze, bisturi e forbici sterilizzate.</li>
	<li>Fibbia la sezione della pelle (circa 10 cm x 15 cm) su un telo sterile sopra una piastra usando gli aghi. In primo luogo, pulire la cute con un tampone di garza sterile asciutta. Quindi pulire la pelle usando un tampone di garza sterile con etanolo al 70%.</li>
	<li>Utilizzando una pialla di piede, taglio di livello superiore della sezione della pelle (epidermide) e metterlo in una capsula di Petri di 9 cm. Quindi, immediatamente aggiungere 25 mL della soluzione di glucosio/DPBS/tripsina (preparata al punto 1.1) per la capsula di Petri. Incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta rimuovere la soluzione DPBS/tripsina/glucosio da di Petri e aggiungere 10 mL di RPMI-1640 + 2% FBS per inattivare la tripsina.</li>
	<li>Utilizzando due pinze, ora rilasciare cellule epidermiche nel medium delicatamente raschiando e agitazione sia epidermico e dermico vano delle sezioni della pelle.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico (dimensione del foro di 1 mm) e raccogliere in un tubo da 50 mL. Aggiungere le restanti sezioni di pelle per un tubo da 50 mL contenente 10 mL di RPMI-1640 senza FBS e vortexare per 10 s. filtro filtrare la sospensione attraverso il metallo in una provetta da 50 mL contenente la sospensione delle cellule epidermiche. Aggiungere DPBS per un volume totale di 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 450 x g e a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare epidermico in circa 10 mL di 37 ° C KSFM a seconda della dimensione del pellet cellulare. Contare le celle utilizzando il blu di Trypan che macchia il metodo sotto il microscopio. Il numero di cellule ottenute da una sezione di pelle 10 cm x 15 cm è di circa 50-100 x 106 celle. A ciascun matraccio di cultura2 75cm, trasferimento 8 x 106 cellule insieme a 12 mL di 37 ° C KSFM. Agitare delicatamente i matracci di cultura per assicurare una uniforme distribuzione delle cellule.</li>
	<li>Incubare i cheratinociti in un incubatore a 37 ° C con 100% umidità e 5% CO2. Modificare il mezzo dopo 2 giorni e tre volte alla settimana. Cellule di passaggio quando la cultura è 70-80% confluenti, che prende circa 2 settimane a seconda del tasso di proliferazione dei keratinocytes.</li>
</ol>
2. passaggio dei cheratinociti
<ol>
	<li>Riscaldare la giusta quantità di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C in un incubatore. Utilizzare 4,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per un matraccio di cultura2 75 cm.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere matraccio di cultura di 4,5 mL/75 cm2 pre-riscaldati soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per le celle. Posizionare il matraccio di cultura nell'incubatore (37 ° C) e dopo circa 5 minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato allentamento.</li>
	<li>Quando circa il 50% delle cellule hanno allentato, delicatamente colpire il matraccio di cultura contro la mano per allentare le cellule rimanenti. Poi, per inattivare la tripsina, aggiungere 6 mL di RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) nel matraccio di cultura di 75 cm2 e trasferire la sospensione cellulare per provette da 50 mL.</li>
	<li>Sciacquare i matracci di cultura con 3 mL di RPMI 1640 + 2% FBS e aggiungere le provette da 50 mL. Centrifugare le cellule per 10 min a 450 x g e a temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Risospendere le cellule pellettate in 10 mL di KSFM (37 ° C). Contare le celle e trasferire 3 x 106 cellule in un pallone di cultura di2 cm 150 con 20 mL di KSFM (37 ° C). Agitare delicatamente il matraccio di cultura per assicurare una uniforme distribuzione delle cellule. Congelare le cellule quando la cultura è 80-90% confluenti, che prende circa 4-6 giorni a seconda del tasso di proliferazione dei keratinocytes (Vedi sezione 3, protocollo sottostante di congelamento). Espandere i cheratinociti per generare gli stock congelati appropriati.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. congelamento dei cheratinociti
<ol>
	<li>Riscaldare la giusta quantità di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C in un incubatore. Utilizzare 9 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per un matraccio di cultura2 150 cm.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dalle cellule e aggiungere matraccio di cultura di 9 mL/150 cm2 pre-riscaldati soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per le celle. Posizionare il matraccio di cultura nell'incubatore (37 ° C) e dopo circa 5 minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato allentamento.</li>
	<li>Quando circa il 50% delle cellule hanno allentato, colpire delicatamente il matraccio di cultura contro la mano al fine di allentare le cellule rimanenti. Quindi, per inattivare la tripsina, aggiungere 12 mL di RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) nel matraccio di cultura2 cm 150 e aspirare la sospensione cellulare per provette da 50 mL.</li>
	<li>Sciacquare i matracci di cultura con 6 mL di RPMI 1640 + 2% FBS e aggiungere le provette da 50 mL. Centrifugare le provette per 10 min a 450 x g a 4 ° C. Preparare il medium (KSFM + 10% DMSO) di congelamento delle cellule ghiacciata.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in KSFM + 10% DMSO, contare le celle e congelare le cellule ad una densità di 6 x 106 cellule/mL utilizzando metodi standard crioconservazione di congelamento lento12.</li>
	<li>Memorizzare i cheratinociti in azoto liquido (fase vapore) fino all'uso.</li>
</ol>
4. lo scongelamento e coltura di cheratinociti congelati
<ol>
	<li>Scongelare rapidamente i flaconcini congelati appropriati in bagnomaria a 37 ° C. Utilizzare etanolo al 70% per pulire l'esterno del cryovial. Trasferire il numero appropriato di cellule (circa 15.000 cellule/cm2) in un pallone di cultura e immediatamente aggiungere mezzo di crescita pre-riscaldato (KSFM) nel matraccio di cultura. Qualsiasi dimensione di matracci di cultura può essere utilizzato a seconda della configurazione dell'esperimento.</li>
	<li>Utilizzare 5 mL terreno di coltura per un matraccio di cultura 25 cm2 .</li></ol>Aggiunto il numero delle cellule, che il matraccio di cultura potrebbe variare perché la crescita delle cellule varia da donatore a donatore. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 100% umidità e 5% CO2.
	<li>Cambia il mezzo dopo 2 giorni e tre volte settimanalmente utilizzando freschi KSFM pre-riscaldato. Nota: I nostri dati hanno dimostrato che in media il 95% delle cellule isolate tramite il protocollo descritto qui sono positivo per il marcatore del keratinocyte citocheratine-1413.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. L'autore non ha alcun conflitto di interessi.

Qui, descriviamo come facilmente isolare keratinocytes umani primari da pelle adulta e come loro coltura in vitro. Questo modello può avere una vasta applicazione per indagini di biologia delle cellule epidermiche e può essere utile per i ricercatori interessati a studiare le malattie cutanee.
Alcuni dei vantaggi del protocollo descritto qui è che, contrariamente ai cheratinociti isolati da prepuzio neonatale ottenuto da neonati maschi sottoposti a circoncisione, keratinocytes umani p...

La pelle è l'organo più grande del corpo umano e serve come una barriera protettiva contro l'ambiente esterno. La pelle è composta di due strati principali: il derma e l'epidermide, dove l'epidermide costituisce lo strato più esterno della pelle. Il tipo più abbondante di cellule nell'epidermide è i keratinocytes che comprende oltre il 95% delle cellule massa1,2. I cheratinociti sono tenuti nelle varie fasi di differenziazione nell'epidermide e sono organizzati in livelli basali, spinosi, granulari e cornified che corrispondono a specifiche fasi di differenziazione3. La funzione primaria dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, producendo così una barriera intatta al mondo esterno.
I cheratinociti rappresentano anche la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni della pelle e quindi giocano un ruolo importante nella risposta immunitaria innata4,5. L'esposizione dei keratinocytes agli stimoli esterni conduce all'attivazione di vie di segnalazione intracellulare e, successivamente, produzione di un numero di vari mediatori infiammatori, tra cui citochine, chemochine e peptidi antimicrobici. Queste proteine derivate da cheratinociti partecipano nella risposta infiammatoria di reclutamento e l'attivazione di cellule immunitarie come specifico T cellule6,7, neutrofili e cellule dendritiche. Così, perché keratinocytes gioca una parte cruciale in numerosi processi biologici, la spiegazione razionale dietro la tecnica presentata qui era per generare un modello in vitro per studiare la biologia della pelle. Primario del keratinocyte colture ottenute da prepuzio neonatale sono spesso utilizzati per studiare biologia pelle8,9. Tuttavia, con la tecnica qui descritta, cheratinociti da entrambi i sessi sono ottenuti con conseguente una maggiore diversità biologica delle cellule.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la generazione di keratinocytes umani primari da pelle adulta, compresa la manutenzione e il congelamento dei keratinocytes. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare keratinocytes umani primari che può essere utilizzato come modello per studiare biologia cutanea in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Integratori KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Integratori per KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS senza Calcio e Magnesio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimetilsolfossido</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Additivo per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Filtro di sterilizzazione</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtro per siringa con una dimensione dei pori di 0,2 &; micro; m</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Utilizzato per tripsinizzare le cellule</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific 16000044</td><td></td><td>Utilizzato per inattivare la tripsina</td></tr><tr><td>Forcipe</td> <td>-</td><td></td> <td>È possibile utilizzare</td></tr> <tr>pinze di qualsiasi azienda<td>Forbici</td><td>-</td><td>-</td><td>È possibile utilizzare le forbici di qualsiasi azienda</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>I bisturi di qualsiasi azienda possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>al 70% di etanolo</td><td>-</td><td>-</td><td>-Tamponi</td></tr> di <tr><td>garza</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>È possibile utilizzare tamponi di garza di qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Pialla a pedale</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>È possibile utilizzare</td></tr> <tr>la pialla a pedale di qualsiasi fornitore<td>Piastre di Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td> È <td>possibile utilizzare piastre di Petri di qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Filtro metallico</td> <td>-</td><td></td> <td>Filtro metallico interno con foro da 1 mm</td></tr><tr><td>75 cm2 palloni di coltura</td><td>NUNC</td> <td>156499-150</td><td></td></tr> <tr><td>cm2</td><td>TTP</td><td>90151-0,05</td><td></td></tr><tr><td>% Soluzione di tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Utilizzato per tripsinizzare le cellule durante il passaggio</td></tr></tbody></table>

generazione e la coltura dei keratinocytes umani primari da pelle adulta

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

La funzione principale dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, mantenendo quindi una barriera meccanica al mondo esterno. Inoltre, cheratinociti svolgono un ruolo essenziale nell'iniziazione, la manutenzione e la regolazione delle risposte immunitarie epidermiche facendo parte del sistema immunitario innato risponde agli stimoli antigenici in modo veloce, non specifico. Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento dei keratinocytes umani primari da pelle adulta e dimostrare che queste cellule rispondono a differenziazione terminale calcio-indotta, come misurato da un'aumentata espressione del involucrin indicatore di differenziazione. Inoltre, ci mostra che i keratinocytes isolati sono reattivi al-1 β-induced attivazione delle vie di segnalazione intracellulare come misurato tramite l'attivazione del pathway MAPK p38. Presi insieme, descriviamo un metodo per l'isolamento e coltura dei keratinocytes umani primari da pelle adulta. Poiché i cheratinociti sono il tipo predominante delle cellule nell'epidermide, questo metodo è utile per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Calcio-indotto differenziazione terminale Cheratinociti umani subiscono differenziazione terminale previo trattamento con calcio14,15,16. Keratinocytes umani primari è stato isolato e coltivato come descritto nel protocollo di cui sopra. Quando circa 50-60% confluenti, le cellule sono state stimolate con calcio (1,2 mM) o veicolo e immagini delle cellule sono state scattate il giorno 0, 1 e 2. <strong class="...

La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cheratinociti umani primari che possono essere utilizzati come modello per studiare la biologia cutanea in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle cellule epidermiche, come ad esempio come viene regolata la differenziazione dei cheratinociti umani o come modello per lo studio delle malattie infiammatorie della pelle. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i cheratinociti umani primari possono essere convenzionalmente isolati dalla pelle adulta di uomini e donne e possono includere la pelle di persone di qualsiasi età di età superiore ai 18 anni.A dimostrare la procedura sarà Annette Blak Rasmussen, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione da 50 millilitri di tripsina allo 0,25% e glucosio allo 0,1% in DPBS. Quindi, mescolare e filtrare sterilizzare la soluzione.Preparare 10 millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS, 50 millilitri di DPBS e terreno privo di siero di cheratinociti o KSFM. Aggiungi integratori KSFM e 250 microlitri di gentamicina a 500 millilitri di KSFM. Quindi, preriscaldare le soluzioni a 37 gradi Celsius prima dell'uso.Raccogli campioni di pelle di 10 centimetri per 15 centimetri da volontari adulti sani sottoposti a chirurgia plastica. Mantieni la pelle fresca trasportando i campioni di pelle in una scatola di polistirolo contenente un elemento di raffreddamento. Se necessario, conservare il campione di pelle a quattro gradi Celsius durante la notte.Utilizzando forbici, bisturi e pinze sterilizzati, rimuovere il grasso da sotto la sezione della pelle. Quindi, usando gli aghi, allacciare la sezione cutanea su una copertura sterile sopra una piastra. Con una garza asciutta e sterilizzata, pulire la pelle.Quindi, seguire con etanolo al 70% su una garza sterilizzata. Successivamente, utilizzando una pialla per piedi, tagliare lo strato epidermico superiore della sezione cutanea e trasferirlo in una capsula di Petri di nove centimetri. Quindi, aggiungere immediatamente 25 millilitri della soluzione di tripsina glucosio DPBS precedentemente preparata alla piastra di Petri.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione di tripsina glucosio DPBS dalla piastra di Petri e aggiungere 10 millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS per inattivare la tripsina. Ora, con due pinze, rilasciare le cellule epidermiche nel mezzo raschiando delicatamente e agitando sia il compartimento epidermico che quello dermico delle sezioni cutanee.Filtrare la sospensione cellulare epidermica attraverso un filtro metallico e raccogliere il filtrato in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere le restanti sezioni di pelle in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di RPMI 1640 senza FBS e agitare per 10 secondi. Filtrare questa sospensione attraverso il filtro metallico in un tubo da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare epidermica.Quindi, aggiungere DPBS a un volume totale di 50 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 450 volte G e temperatura ambiente, per 10 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e, a seconda delle dimensioni del pellet cellulare, risospendere il pellet cellulare epidermico in circa 10 millilitri di 37 gradi Celsius KSFM.Utilizzando il metodo di colorazione con blu di tripano, contare le cellule al microscopio. Quindi, in ogni pallone di coltura da 75 centimetri quadrati, trasferire otto volte 10 alla sesta cellula, insieme a 12 millilitri di KSMM a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente i palloni di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.Incubare i cheratinociti in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 100% di umidità e il 5% di CO2. Cambiare il terreno dopo due giorni e poi tre volte alla settimana. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, mantenere la quantità appropriata di soluzione di tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius in un incubatore.Rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere alle cellule 4,5 millilitri per pallone di coltura da 75 centimetri quadrati di soluzione preriscaldata di tripsina EDTA allo 0,05%. Dopo aver posizionato il pallone di coltura nell'incubatore a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti, controllare al microscopio se le cellule hanno iniziato ad allentarsi. Quando circa il 50% delle cellule si è allentato, colpire delicatamente il pallone di coltura contro la mano per allentare le cellule rimanenti.Quindi, per inattivare la tripsina, aggiungere sei millilitri di RPMI 1640 a 37 gradi Celsius più il 2% di FBS al pallone di coltura da 75 centimetri quadrati e trasferire la sospensione cellulare in provette da 50 millilitri. Sciacquare i matracci di coltura con tre millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS e aggiungere il terreno alle provette da 50 millilitri. Quindi, centrifugare le celle per 10 minuti a 450 volte G e temperatura ambiente.Utilizzare 10 millilitri di KSFM a 37 gradi Celsius per risospendere le celle pellettate. Quindi, contare e trasferire tre volte 10 alla sesta cellula in un pallone di coltura da 150 centimetri quadrati, insieme a 20 millilitri di KSFM a 37 gradi Celsius. Agitare delicatamente il pallone di coltura per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, prima di rimetterle nell'incubatore.Quando la coltura è confluente all'80-90%, dopo la tripsinizzazione e il trasferimento delle cellule in provette da 50 millilitri, come dimostrato in precedenza in questo video, sciacquare i flaconi di coltura con sei millilitri di RPMI 1640 più il 2% di FBS e aggiungerlo alle provette da 50 millilitri. Centrifugare le provette per 10 minuti a 450 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi, preparare il mezzo di congelamento a celle ghiacciate.Risospendere il pellet della cella in KSFM più il 10% di DMSO. Quindi, dopo aver contato le cellule, congelarle a una densità di sei volte 10 al sesto di cellule per millilitro, utilizzando metodi standard di crioconservazione a congelamento lento. Conservare i cheratinociti in azoto liquido fino al momento dell'uso.Come si vede qui, i cheratinociti umani sono stati isolati e coltivati, come dimostrato in questo video e poi stimolati con calcio. Queste immagini mostrano i cambiamenti morfologici dovuti all'aggiunta di Calcio nei giorni uno e due, rispetto alle cellule trattate controllate. Oltre ai cambiamenti morfologici, l'aggiunta di Calcio ha comportato anche un aumento della trascrizione dell'mRNA per il marcatore di differenziazione Involucrina, 5,5 volte dopo 24 ore e 3,5 volte dopo 48 ore.In questo esperimento, i cheratinociti in coltura sono stati stimolati con IL-1 beta per vari periodi di tempo. Come si è visto dal Western blotting, entro cinque minuti, la stimolazione con IL-1 beta ha portato a una rapida fosforilazione della p38 MAP chinasi poiché la stimolazione di IL-1 beta non ha avuto alcun effetto sui livelli proteici totali di p38 MAP chinasi. Dopo un'ora, la fosforilazione della p38 MAP chinasi indotta da IL-1 beta è tornata ai livelli basali.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule epidermiche umane per esplorare il ruolo dei cheratinociti nelle risposte immunitarie innate, nonché nello sviluppo della pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e coltivare cheratinociti primari dalla pelle umana adulta, che possono essere utilizzati come modello per studiare la biologia cutanea in vitro.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Questo video descrive l'isolamento dei cheratinociti, le cellule più importanti dello strato epidermico della pelle umana, impiegando una combinazione di metodi di digestione enzimatica e di interruzione meccanica. Questo metodo aiuta nella crescita preferenziale dei cheratinociti rispetto ad altri tipi di cellule della pelle utilizzando un mezzo di crescita selettivo.

Isolamento dei cheratinociti della pelle umana: un metodo per coltivare i cheratinociti primari da campioni di pelle

Questo video descrive un protocollo dettagliato per la produzione di retrovirus ricombinanti di cheratinociti umani primari geneticamente modificati. Questo metodo può essere utilizzato per manipolare l'espressione genica nei cheratinociti.

Modificazione genetica dei cheratinociti umani primari: un metodo per manipolare geneticamente i cheratinociti utilizzando retrovirus ricombinanti

Questo manoscritto fornisce una procedura passo-passo per la derivazione e il mantenimento di cheratinociti umani da capelli strappati e la successiva generazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di integrazione da vettori episomiali.

Generazione di cellule staminali Integrazione-libero umano pluripotenti indotte Utilizzando capelli derivati ​​da cheratinociti

L'obiettivo di questo articolo è fornire un protocollo completo e dettagliato su come generare pelle organica umana geneticamente modificata da cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Questo protocollo descrive un metodo semplice per coltivare l'epidermide umana ricostituita tridimensionale in modo riproducibile e robusto. Inoltre, caratterizza la relazione struttura-funzione del modello di barriera epidermica. Vengono presentate anche le risposte biologiche dell'epidermide umana ricostituita su stimoli proinflammatori.

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

Qui descriviamo un protocollo per la coltivazione sistematica di sferoidi epidermici in coltura di sospensione 3D. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio per l'uso in una varietà di tipi di tessuto epiteliale e per la modellazione di diverse malattie e condizioni umane.

Creazione di un sistema di coltura sferoide epidermica ad alto rendimento per modellare la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cheratinociti orali derivati dal palato del topo adulto. Viene anche riportato un metodo di valutazione che utilizza l'immunocolorazione.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Questo protocollo delinea la coltura di cheratinociti appena ottenuti (passaggio 0) per l'uso nell'imaging di cellule vive.

Generazione di colture primarie per l'imaging di cellule vive di cheratinociti

Impara a isolare e coltivare cheratinociti umani primari da pelle adulta per studiare la biologia cutanea in vitro. Questo metodo consente di esplorare la differenziazione cellulare e le malattie infiammatorie della pelle.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

Esplora altri video