Name: Oculare cinematica misurata dalla stimolazione In Vitro dei nervi cranici in tartaruga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Impara a misurare la cinematica oculare in tartaruga tramite preparazione in vitro della testa isolata. Questo metodo elettrofisiologico consente di stimolare i nervi cranici e quantificare rotazioni oculari e variazioni pupillari.

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Gli autori ringraziano la Signora Paulette McKenna e Lisa Pezzino in questo studio per supporto segretariale e Mr. Phil Auerbach per il supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche i dottori Michael Ariel e Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) per ci ha spiegato che la preparazione della testa in vitro isolato. Contributi a sostegno di questa collaborazione è stata fornita dal dipartimento di biologia (Robert S. Chase Fund), il comitato accademico di ricerca e il programma di neuroscienze al Lafayette College. Infine, questo lavoro è dedicato a Mr. Phil Auerbach, scomparso 28 settembre 2016; ha un microscopio elettronico a scansione in disuso e riconosciuto l'utilità del suo stadio di 5 assi per l'uso in questo protocollo. L'amicizia e l'intraprendenza ci mancherà enormemente.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Fasi critiche:
I passaggi critici all'interno di questo protocollo sono i seguenti: 1) la dissezione e la cura per mantenere la vitalità dei nervi transected; 2) la corrispondenza di dimensioni dagli elettrodi aspirazione ai nervi cranici di fornire risposte coerenti; e 3) il posizionamento della testa nella sospensione cardanica per fornire un'adeguata calibrazione delle rotazioni dell'occhio.
Risoluzione dei problemi:
La dissezione può essere...

Spiegazione razionale per usando il cursore rosso-eared tartarughe in esperimenti elettrofisiologici:
Le tartarughe dalle orecchie rosse (Trachemys scripta elegans), sono considerati uno dei peggiore specie invasive1 del mondo e può indicare che un ecosistema è nei guai. Il motivo per cui sono tanto successo tartarughe cursore rosso-eared è capito male ma può essere in parte dovuto la loro fisiologia tollerante e possesso di tessuti nervosi che può sopravvivere in condizioni di ipossia2,3,4 . Li utilizzano per sperimentazione non minacciano i loro numeri e con sforzi minimi, preparazioni elettrofisiologici possono rimanere vitali sopra le durate estese, fino a 18 ore5,6. Il vantaggio è simile al vantaggio dell'utilizzo di animali invertebrati quali gamberi7, che hanno anche la capacità di sopportare i bassi livelli di ossigeno8.
Tecniche per misurare movimenti oculari:
Approcci per misurare movimenti oculari negli animali dagli occhi frontali, uso di primati non umani sono stati ben sviluppato9. L'occhio ruota in orbita intorno a tre assi: orizzontale, verticale e torsionale. Il metodo di ricerca magnetico della bobina è generalmente considerato il più affidabile per la misura di rotazioni, ma è invasivo, che richiedono piccole bobine da inserire le sclere di animali10,11. Sistemi basati su video possono anche misurare rotazioni e hanno il vantaggio di essere non invasivo. Lo sviluppo delle meglio fotocamere con elaborazione immagine innovativa hanno migliorato la loro funzionalità, rendendo i sistemi basati su video alternativa da considerare12,13,14.
Le tecniche sviluppate per misurare i movimenti di occhio in nonmammals sono state molto meno significative. Misure sono entrambi bassa risoluzione o descrivono solo alcune delle rotazioni15,16,17,18. La mancanza di sviluppo può essere parzialmente imputata sulla difficoltà nel nonmammals di formazione da seguire obiettivi visual. Anche se i movimenti oculari sono state ben studiati in cursore rosso-eared tartarughe19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, a causa della sfida in addestramento di animali per tenere traccia degli obiettivi, la cinematica precisa dei loro movimenti oculari è scarsamente capito.
Tartarughe del cursore rosso-eared sono generalmente considerate vertebrati laterale-eyed, ma perché essi possono ritirare completamente le loro teste nel loro guscio31, occlusione significativa dei campi visivi laterali dal carapace si verifica32. Il risultato è che la loro linea di vista visivo è costretto verso la parte anteriore, che li rende si comportano più come mammiferi frontale-eyed. Di conseguenza, loro uso come modello per lo sviluppo di approcci per misurare movimenti oculari offre anche una prospettiva evolutiva unica.
Il protocollo descritto in questo lavoro utilizza una preparazione della testa in vitro isolato per identificare la cinematica dei movimenti dell'occhio in tartarughe cursore rosso-eared. Cervelli vengono sezionati dai teschi intatti i nervi cranici. Teste sono inserite in un giunto cardanico per calibrare i movimenti oculari ed evocano risposte da stimolazione elettrica dei nervi cranici che innervano i muscoli oculari. Misure delle rotazioni degli occhi sono fatte da un sistema basato su video, utilizzando algoritmi software, che traccia la pupilla scura e le marcature dell'iride. La preparazione prevede l'opportunità di misurare cinematica di entrambi extraoculare (cioè, orizzontale, verticale e torsionale rotazioni)32 e intraoculare (cioè, modifiche alla pupilla)33 movimenti.
Sistema modello per l'analisi delle vie neurali efferente:
Più in generale, l'approccio fornisce la possibilità di studiare come efferenti segnali neurali generare movimenti oculari quando muscoli iniziano da loro state rilassate e in assenza di informazioni sensoriali integrate elaborate dal cervello32, gli investigatori 33. Di conseguenza, la cinematica di occhio può essere esaminata in un sistema di modello in cui vengono elaborati esclusivamente dal percorso neurale efferente lasciando il cervello e synapsing sui muscoli.

<table><tbody><tr><td>Tartarughe dalle orecchie rosse</td><td>Kons Scientific</td><td>Trachemys scripta elegans</td><td>Large size (lunghezza del carapace 15-20 cm)</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico concentrato</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH</td><td>Oakton</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di stimolazione ad aspirazione</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>Elettrodo di aspirazione bipolare. Si noti che 573000 è stato sostituito con 573050.</td></tr><tr><td>Vetro capillare</td><td>Sistemi A-M</td><td>626000</td><td>Vetro capillare borosilicato a cilindro singolo senza microfilamento, lunghezza 10 cm, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,50 mm</td></tr><tr><td>Elettrodo di stimolazione ad aspirazione alternativo</td><td>A-M Systems</td><td>573050</td><td>Elettrodo di aspirazione bipolare. Richiede un vetro capillare di diametro maggiore: 627000, diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,68 mm</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Lieca</td><td>GZ7</td><td>Gamma di ingrandimenti, 10x - 70x</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in fibra ottica</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W Scatola luminosa per illuminatore per microscopio a fibre ottiche</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>625654</td><td>acciaio inossidabile, molla diritta, 5,25"</td></tr><tr><td>Sonda di dissezione smussata</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>627405</td><td>Sonda del centro commerciale Huber, sonda a doppia estremità e cercatore, 6 "</td></tr><tr><td>Microforbici</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>Forbici da microdissezione Iris, acciaio inossidabile, lame da 0,5 pollici, pinze fini lunghe 4,75 pollici</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>F6521</td><td>Pinze per gioiellieri, dumont n. 5, lega inox, 4,25"</td></tr> <tr><td>Pinze curve</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>Z168696</td><td>Punta media, pinza curva, acciaio inossidabile,</td></tr> <tr><td>manico per bisturi</td> da 4" <td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2896</td><td>Manici per bisturi, n. 3, lama</td></tr><tr><td>per bisturi</td> in acciaio inossidabile <td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2771</td><td>Lame per bisturi, n. 11,</td></tr><tr><td>ghigliottina</td> in acciaio <td>Apparecchio Harvard</td><td>73-1918</td><td>Ghigliottina Kleine tipo 7575</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Sigma</td><td>Z648299</td><td>Micro cucchiaio e set di pesatura a spatola. Usa una spatola piccola: 5,9" lunghezza x 0,07" diametro manico con estremità quadrata: 0,17" x 1,3 pollici lungo, altro giro terminale: 0,17 " x 1,27 pollici </td></tr><tr><td>gancio</td> lungo <td>Autozone</td><td>98069</td><td>Set di ganci e grimaldelli SureBilt. Utilizzare la smerigliatrice per smussare le punte affilate del gancio per evitare lesioni alla bocca degli animali.</td></tr><tr><td>95/5% O2/CO2</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td><td>5% di anidride carbonica equilibrio ossigeno miscela di gas standard certificata, dimensione 200 Cilindro, CGA-296</td></tr><tr><td>Regolatore</td><td>Airgas, Inc.</td><td>Y11244D296-AG</td><td>Regolatore a cilindro analitico monostadio in ottone 0-100 psi CGA-296 con uscita ad ago. Utilizzare una valvola del tubo dell'aria regolabile in ottone per passare da 3/8", diametro interno, tubo dell'aria in vinile collegato al regolatore a un diametro interno da 3/16", connessione dell'aria che va alla pipetta in pietra porosa o in vetro.</td></tr><tr><td>Valvola regolabile del tubo dell'aria</td><td>Dottori Foster e Smith</td><td>CD-12061</td><td>Valvola in ottone</td></tr><tr><td>Tavolo rigido</td><td>Sconosciuto</td><td>Sconosciuto</td><td>Porta autoclave posta sopra un tavolo robusto. Nove palline da tennis da 5" di diametro isolano le vibrazioni dalla superficie superiore del tavolo.</td></tr><tr><td>5" pallina da tennis</td><td>Petco Animal Supplies, Inc.</td><td>712868</td><td>Petco Jumbo Pet Tennis Ball: le palline non vengono affettate e tenute all'interno di un telaio integrato nella parte inferiore dello sportello dell'autoclave.</td></tr><tr><td>Tavolo alternativo di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Newport Corporation</td><td>INT1-36-6-N</td><td>Sistema rigido di controllo delle vibrazioni, integrità 1: Dimensioni della superficie, 3' x 6'Gimbal</td></tr> <tr><td></td><td>ISI, International Scientific Instruments, Inc.</td><td>Stadio da SUPER III-A Scansione EM</td><td>Stadio eucentrico a 5 assi: movimenti lineari X, Y e Z, &plusmn; 20 mm, precisione 0,1 mm; Rotazioni verticali, & plusmn; 10 gradi, e orizzontale, &plusmn; 12,5&deg;, con 1,25&deg; precisione. Nota: dallo strumento di dismissione.</td></tr><tr><td>Mandrino per gimbal</td><td>Sconosciuto</td><td>Sconosciuto</td><td>Il mandrino proveniente da un vecchio microtomo di fabbricazione sconosciuta è stato lavorato per adattarsi all'albero del portacampioni del</td></tr><tr><td>gimbal alternativo</td> a scansione EM stage <td>ThorLabs, Inc.</td><td>GN2/M con MBT602/M</td><td>Goniometro a doppio asse (GN2/M) montato su tavolino a microblocco a 3 assi con regolatori a vite a testa zigrinata (MBT602/M): progettazione di un mandrino per tenere la testa di tartaruga con occhiello a 12,7 mm sopra la superficie superiore del goniometro (distanza dal punto di rotazione)</td></tr><tr><td>Sistema di tracciamento oculare basato su video</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint EyeTracker, PC-60</td><td>Metodo di tracciamento: video a infrarossi con pupilla scura; Telecamera in bianco e nero (Art. BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisiti di sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Campo visivo: Orizzontale +/- 44°; verticale +/- 20 gradi; Precisione ~0,5&deg;; Risoluzione spaziale ~0,15&deg;; Risoluzione della dimensione della pupilla ~0,03 mm; Dati oculari: posizione X, Y dello sguardo, altezza e larghezza della pupilla, torsione, tempo delta, tempo totale e regioni di interesse (ROI); Comunicazione in tempo reale (articolo 0022): AnalogOut a 4 canali con otto canali di ingresso TTL per contrassegnare i codici nel file di dati</td></tr><tr><td>Base magnetica multiposizione</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>Pittsburg, articolo #5645</td><td>Il supporto magnetico raggiunge fino a 12" e produce 45 libbre di trazione magnetica. Utilizzare per posizionare la telecamera. Infilare a macchina i fori sull'estremità dell'asta per montare le fotocamere.</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>Manipolazione a 5 assi per il montaggio dell'elettrodo di aspirazione: corsa lineare X, Y, Z, 2 assi di rotazione,</td></tr><tr><td>Cannocchiale di dissezione sul braccio</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>Gamma di ingrandimento, 6,7x - 40x</td></tr><tr><td>Stimolatore nervoso/muscolare</td><td>Astro-Med Grass Telefactor Grass</td><td>S88</td><td>Stimolatore di tensione a doppio impulso: due canali di uscita che possono essere azionati in modo indipendente o sincronizzato per generare impulsi di tensione costante non isolati (da 10 mv a 150 V). Gli impulsi possono essere singoli (10 &mu; sec a 10 sec), ripetitivo (da 0,01 Hz a 1 KHz) e treni (da 1 ms a 10 s) e sincronizzato con ingressi e uscite TTL. Inviate le uscite TTL tramite i canali di uscita di un connettore DB25 ai canali di ingresso TTL del ViewPoint EyeTracker. Nota: Astro-Med Grass Telefactor non è più in attività.</td></tr><tr><td>Dispositivo di isolamento di corrente</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>Unità di isolamento di stimolo di corrente: consente l'erogazione sicura di correnti costanti da parte dell'S88 al preparato. Il PSIU6 si collega tramite un cavo BNC a uno dei canali di uscita dell'S88. Gli interruttori moltiplicatori sul PSIU6 consentono all'S88 di generare un'ampia gamma di ampiezze di corrente che vanno da 0,1 &micro; A a 15 mA.</td></tr><tr><td>Stimolatore nervoso/muscolare alternativo con isolamento</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>Stimolatore a impulsi isolato: L'unità è dotata di un isolatore incorporato per produrre correnti costanti.</td></tr></tbody></table>

oculare cinematica misurata dalla stimolazione in vitro dei nervi cranici in tartaruga

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Dopo che gli animali sono euthanized, loro tessuti cominciano a morire. Le tartarughe offrono un vantaggio a causa di un più lungo periodo di sopravvivenza dei loro tessuti, soprattutto se paragonato ai vertebrati a sangue caldo. Per questo motivo, gli esperimenti in vitro in tartarughe possono essere eseguiti per lunghi periodi di tempo per studiare i segnali neurali e il controllo delle loro azioni mirate. Usando una preparazione testa isolata, abbiamo misurato la cinematica dei movimenti oculari in tartarughe, e loro modulazione di segnali elettrici trasportati dai nervi cranici. Dopo che il cervello è stato rimosso dal cranio, intatti i nervi cranici, la testa dissecata fu posto in un giunto cardanico per calibrare i movimenti oculari. Elettrodi di vetro sono stati fissati ai nervi cranici (oculomotore, trocleare e abducente) e stimolato con correnti di evocare movimenti oculari. Abbiamo monitorato i movimenti di occhio con un video a infrarossi tracking system e quantificati rotazioni degli occhi. Impulsi di corrente con una gamma di ampiezze, frequenze, e treno durate venivano utilizzate per osservare gli effetti sulle risposte. Perché la preparazione è separata dal cervello, la via efferente che va agli obiettivi del muscolo può essere esaminata isolatamente per studiare segnalazione neurale in assenza di informazioni sensoriali centralmente elaborate.

La figura 1 Mostra stills di immagini tratte da un video che descrive la dissezione. Immagini forniscono posizioni tipiche dei nervi prima del taglio dal cervello.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg"> Figura 1: Stills di immagini catturate dal video della dissezione per mostrare la località del nervo ottico (nII), nervo oculomotore (nIII), nervo...

Questo protocollo viene descritto come utilizzare una preparazione testa in vitro isolato tartaruga per misurare la cinematica dei loro movimenti oculari. Dopo la rimozione del cervello dal cranio, nervi cranici può essere stimolati con correnti a quantificare le rotazioni dell'occhio e cambiamenti nelle dimensioni della pupilla.

Oculare cinematica misurata dalla stimolazione In Vitro dei nervi cranici in tartaruga

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

L'obiettivo generale di questo protocollo elettrofisiologico è quello di fornire la capacità di misurare la cinematica dei movimenti oculari della tartaruga dalle orecchie rosse utilizzando una preparazione della testa isolata in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo oculo-motorio, come ad esempio come si è evoluta la vista nelle tartarughe. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede l'addestramento degli animali per tracciare i bersagli e utilizza un gimbal per calibrare i movimenti oculari.A dimostrare questa tecnica è Steven Nesbit, uno studente universitario del mio laboratorio. Inizia con la testa di tartaruga in una capsula di dissezione. Tieni a portata di mano una quantità sufficiente di soluzione per l'anello delle tartarughe per irrigare il tessuto.Mantenere il tessuto a quattro gradi Celsius, posizionando del ghiaccio intorno all'esterno del piatto. Posizionare una sonda di dissezione smussata attraverso la bocca per facilitare la manipolazione della testa. Quindi, mentre si lavora al microscopio da dissezione, tagliare l'articolazione che collega l'osso dentario al cranio con il bisturi.Quindi, usa i rongeur per allon

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In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di...

Utilizzando il Granchio Ferro di Cavallo, Limulus Polifemo, In Vision Research

Il controllo neurale e processi cognitivi possono essere studiati attraverso i movimenti oculari. Il software VisualEyes consente all'operatore di programmare stimoli su due schermi di computer in modo indipendente utilizzando un linguaggio semplice, scripting personalizzato. Il sistema è in grado di stimolare i movimenti oculari tandem (saccadi e di esercizio regolare) o movimenti oculari opposti (di convergenza) o qualsiasi combinazione.

VisualEyes: un sistema software modulare per la Sperimentazione oculomotoria

Video-oculografia è un metodo molto quantitativa per indagare le prestazioni del motore oculare così come apprendimento motorio. Qui, descriviamo come misurare la video-oculografia nei topi. Applicando questa tecnica su normali, trattati farmacologicamente o topi geneticamente modificati è un potente strumento di ricerca per esplorare la fisiologia di base dei comportamenti del motore.

Video-oculografia in Mouse

La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire In Vivo Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi

Un protocollo dettagliato per la valutazione delle letture strutturali e visivi in roditori dalla risposta di tomografia e optokinetic ottica di coerenza è presentato. I risultati forniscono informazioni preziose per la ricerca oftalmologica, nonché neurologica.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

VisualEyes2020 (VE2020) è un linguaggio di scripting personalizzato che presenta, registra e sincronizza gli stimoli visivi del movimento oculare. VE2020 fornisce stimoli per movimenti oculari coniugati (saccadi e inseguimento regolare), movimenti oculari disconiugati (vergenza), accomodamento e combinazioni di ciascuno. Due programmi di analisi unificano l'elaborazione dei dati dai sistemi di tracciamento oculare e registrazione degli alloggi.

Quantificazione delle risposte oculomotorie e dell'accomodazione attraverso strumenti di strumentazione e analisi

Qui descriviamo un protocollo standard per quantificare il riflesso optocinetico. Combina la stimolazione virtuale del tamburo e la video-oculografia, e consente quindi una valutazione precisa della selettività delle caratteristiche del comportamento e della sua plasticità adattativa.

Quantificazione della selettività delle caratteristiche visive del riflesso optocinetico nei topi

Descriviamo qui PyOKR, un metodo di analisi quantitativa semi-automatizzato che misura direttamente i movimenti oculari risultanti dalle risposte visive al movimento bidimensionale dell'immagine. Un'interfaccia utente basata su Python e un algoritmo di analisi consentono una maggiore produttività e misurazioni quantitative più accurate dei parametri di tracciamento oculare rispetto ai metodi precedenti.

PyOKR: un metodo semi-automatico per quantificare la capacità di tracciamento del riflesso optocinetico

La metodologia ha esplorato i contributi visivi e vestibolari alla stabilizzazione dello sguardo durante le rotazioni optocinetiche e di tutto il corpo. Le stimolazioni sono state effettuate attraverso prove visive, vestibolari e visuovestibolari. L'aumento del movimento oculare torsionale e le frequenze del nistagmo sono serviti come indicatori per il relè sottocorticale delle informazioni di movimento sensoriali specifiche verso la risposta riflessiva del tronco encefalico per ogni prova.

Utilizzo dell'eye-tracking per valutare l'importanza relativa dell'input visivo e vestibolare per l'elaborazione del movimento sottocorticale nel piano di rollio

Impara a misurare la cinematica oculare in tartaruga tramite preparazione in vitro della testa isolata. Questo metodo elettrofisiologico consente di stimolare i nervi cranici e quantificare rotazioni oculari e variazioni pupillari.

Oculare cinematica misurata dalla stimolazione In Vitro dei nervi cranici in tartaruga

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