Name: Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri come riprogrammare le cellule germinali in neuroni in Caenorhabditis elegans utilizzando RNAi e l'espressione indotta da heat-shock del fattore di trascrizione CHE-1. Questo metodo permette di studiare i meccanismi epigenetici della riconversione cellulare in vivo.

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Ringraziamo Alina El-Khalili e Martina Hajduskova per assistenza tecnica. Ringraziamo i membri del gruppo Tursun per commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sponsorizzato dalla ERC-StG-2014-637530 ed ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 ed è supportato da Max Delbrueck centro per medicina molecolare dell'Associazione Helmholtz.

Tutti i metodi descritti di seguito per quanto riguarda la cura degli animali sono stati approvati dalla LaGeSo Berlino, Germania
1. soluzione preparazione
<ol>
	<li>Piastre di NGM-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di media di peptone (ad es., Bacto-Peptone) e 20 g di agar. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di colesterolo (5 mg/mL a 95% EtOH magazzino), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K2PO4e 1 mL di amfotericina B (2,5 mg/mL di brodo).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Piastre di Agar a NGM RNAi (1 L)
	<ol>
		<li>Aggiungere 3 g di NaCl, 2,5 g di media di peptone e 20 g di agar. Dopo la sterilizzazione in autoclave aggiungere, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL a 95% EtOH magazzino), 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 25 mL di 1 M K2PO4, 1 mL di amfotericina B (2,5 mg/mL di brodo), 1 mL di 1 M IPTG e carbenicillina 1 mL (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Aggiungere 10 g di media di peptone, Estratto di 5 g di lievito, 5 g di NaCl, 20 g di agar, 10 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0. Aggiungere H2O a 1 L. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di carbenicilline 50 mg/mL e 2,5 mL di tetraciclina 5 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Aggiungere 10 g di media di peptone, Estratto di 5 g di lievito, 5 g di NaCl e 10 mL di 1 M Tris-HCl pH 8.0. Aggiungere H2O a 1 L. Dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di carbenicilline 50 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 L)
	<ol>
		<li>Aggiungere 6,0 g di Na2HPO4, 3 g di KH2PO4, 5 g di NaCl e 50 mg di gelatina. Prima dell'uso, aggiungere 1 mL di 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Soluzione sbiancante (10 mL)
	<ol>
		<li>Aggiungere 1 mL di NaClO e 2 mL di NaOH N 5. Aggiungere 10 mL di H2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. preparazione delle piastre di RNAi
Nota: C. elegans è tipicamente coltivate in laboratorio su piastre di Petri di 6 cm contenente 7,5 mL di Agar di Nematode crescita medio (NGM-Agar)10,11. Questo protocollo è ottimizzato per i vermi conservati a 15 ° C. Per preparare piatti con NGM, utilizzare tecniche sterili standard per prevenire la contaminazione batterica e fungina. Di seguito è riportato il protocollo per preparare piatti NGM completati con reagenti per RNAi.
<ol>
	<li>Preparare piastre di Agar a NGM RNAi 6 cm contenente 1mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 50 carbenicillina µ g/mL. Lasciarli asciugare per 24 – 48 h a temperatura ambiente nel buio12.
	<ol>
		<li>Tenere RNAi piastre a 4 ° C al buio. Non utilizzare se più vecchi di 14 giorni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selezionare il clone di batteri (Escherichia coli HT115) RNAi contenenti il plasmide L4440 con la sequenza di DNA del gene di lin-53 dallo stock di glicerolo congelati dalla libreria RNAi disponibili13 sulle piastre di LB-agar contenente 50 µ g/mL carbenicillina e 12,5 µ g/mL tetraciclina utilizzando il modello di striature trifase. Crescere i batteri a 37 ° C durante la notte12. Questo clone permette produzione di IPTG-dipendente di lin-53 dsRNA nei batteri.
	<ol>
		<li>Inoltre, si sviluppano batteri RNAi che contengono il plasmide L4440 senza qualsiasi sequenza del gene come il vettore vuoto controllo14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Il giorno successivo, prendere una singola Colonia da lin-53 o piastre di vettore vuoto LB-agar utilizzando una pipetta 200 µ l punta e inoculare ciascuna di esse in una provetta di cultura separata contenente 2 mL di liquido LB Media14 completati con carbenicillina di 50 µ g/mL. Coltivare culture durante la notte a 37 ° C fino a raggiungere una densità ottica (OD) a 600 nm di 0.6-0.8. Misurare il OD utilizzando un spettrofotometro15. Attenzione: I media LB liquidi non deve contenere tetraciclina in contrasto con la piastra di LB-agar utilizzata per striature i batteri dallo stock di glicerolo, poiché l'inclusione di tetraciclina durante l'alimentazione porta a una diminuzione di efficienza RNAi 12</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di ogni coltura batterica (lin-53 o vettore vuoto) alle piastre di Agar a NGM RNAi 6cm utilizzando un multipipette. Incubare le piastre con il coperchio chiuso durante la notte a temperatura ambiente al buio ad asciugare. Durante questo tempo, IPTG nelle piastre NGM induce una produzione di dsRNA nei batteri.
	<ol>
		<li>Utilizzare almeno 3 piatti coltura batterica per esperimento. Ciò fornirà 3 tecnico replica per ogni esperimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Conservare secchi NGM-agar RNAi piastre con batteri a 4 ° C al buio fino a due settimane.</li>
</ol>
3. preparazione del BAT28 del ceppo di c. elegans
<ol>
	<li>Mantenere il ceppo di vite senza fine BAT288 contenente i transgeni otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] sui batteri OP50 utilizzando piastre di Agar a NGM standard a 15 ° C. Nota: Per protocollo dettagliato sulla cultura del Nematode, Vedi10. Il rol-6(su1006) è un allele dominante e comunemente usato iniezione fenotipica segnapunti16 che provoca il tipico movimento di rotolamento. Utilizzarlo nel transgene otIs305 per tenere traccia hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Mantenere il ceppo di BAT28 a 15 ° C in qualsiasi momento al fine di prevenire l'attivazione precauzioni della hsp-16.2prom::che-1 transgene. Ridurre l'esposizione a temperature superiori ai 15 ° C mentre si maneggia il ceppo per quanto possibile.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per età-sincronizzare vermi, utilizzare la tecnica sbiancante17.
	<ol>
		<li>Lavare i piatti da 6 cm NGM-Agar contenente adulti e uova di BAT28 con 900 µ l di tampone di M9. Pellet vermi mediante centrifugazione a 900 x g per 1 min. eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 – 1 mL di soluzione di candeggio e agitare il tubo per circa 1 minuto fino a quando i vermi adulti iniziano a scoppiare aperto. Monitor utilizzando uno stereomicroscopio standard.</li>
		<li>Pellet vermi mediante centrifugazione a 900 x g per 1 min. eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare 3 volte il pellet di verme aggiungendo 800 µ l di tampone di M9 e centrifugazione a 900 x g.</li>
		<li>Mettere le uova pulite il seminato con batteri OP50 NGM-piatti freschi. Crescere una popolazione sbiancata sui batteri OP50 a 15 ° C fino a quando non raggiungono la fase di L4 (circa 4 giorni). Le larve L4 possono essere riconosciute da una macchia bianca circa a metà strada lungo il lato ventrale del verme18 utilizzando uno stereomicroscopio standard. Nota: Per raggiungere la cellula di germe al fenotipo di conversione neurone all'esaurimento delle lin-53, deve essere esaurita nella generazione parentale (P0).</li></ol></li></ol>Il Punteggio per il fenotipo di conversione è intrapresa nella generazione seguente (generazione filiale F1). Per garantire l' impoveriscono lin-53 già in P0, L4 animali sono sottoposti a RNAi.
	
	
	<li>Trasferire manualmente 50 L4 worm di fase per replica utilizzando un filo di platino ad una piastra del NGM che non contengono tutti i batteri e lasciare che worm abbandonare qualsiasi batteri OP50 trasferiti. Lasciate che i vermi spostare sulla piastra per circa 5 minuti. Uso di batteri dalle piastre di Agar a NGM RNAi precedentemente seminato con lin-53 RNAi batteri (o controllo vettoriale vuoto) per trasferire le rispettive piastre di RNAi.
	<ol>
		<li>Evitare di trasferire i batteri OP50 per le piastre di RNAi effettive. Lavorare velocemente per ridurre al minimo il tempo di esposizione del ceppo a temperature superiori ai 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubare vermi sulle piastre di Agar a NGM RNAi a 15 ° C per circa 7 giorni fino a L3-L4 palco F1 progenie dei vermi. Possono essere chiaramente separati dagli animali P0 poiché sono più grandi e più spesso che la progenie di F1.
	<ol>
		<li>Controllare visivamente sotto un microscopio stereoscopico standard se F1 progenie worms Visualizza il fenotipo sporgente di vulva (pvul) come illustrato nella Figura 1. RNAi contro lin-53 ha effetti pleiotropici e provoca il fenotipo di pvul che può essere utilizzato per valutare se RNAi contro lin-53 ha avuto successo. Nota: RNAi contro lin-53 può anche causare la letalità di embrioni di F1. Questo effetto aumenta se piastre sono esposti a gradi superiori ai 15 ° C prima di animali raggiunto la L3-L4 fase. Embrioni morti possono essere riconosciuti da sviluppo arrestato e mancanza di schiusa.</li>
		<li>Incubare le piastre al buio poiché IPTG è sensibile alla luce.</li>
	</ol>
	</li>

4. induzione di riprogrammazione delle cellule di germe
<ol>
	<li>Incubare esaminati piastre di RNAi contenenti lin-53 e svuotare la progenie F1 RNAi-trattati vettoriale per 30 min a 37 ° C al buio per attivare-1. Utilizzare un incubatore ventilato poiché permette per una scossa di calore più efficiente.</li>
	<li>Permettere agli animali di calore-scioccato di recuperare per 30 min a temperatura ambiente al buio e poi incubare le piastre a 25 ° C durante la notte nel buio.</li>
	<li>Utilizzando uno standard stereomicroscopio accoppiato ad una sorgente di luce di fluorescenza, esaminare gli animali sotto il filtro GFP per gcy-5prom::gfp-derivato segnali nella zona metà del corpo dei vermi come mostrato nella Figura 2. Set microscopio per GFP segnali: eccitazione massima a 488 nm con emissioni massime a 509 nm.</li>
	<li>Valutare il grado di cellule germinali alla conversione del neurone dagli animali di montaggio con segnali GFP in zona metà del corpo su agar contenente tampone microscopia diapositive19.
	<ol>
		<li>Contare il numero di animali che mostrano la cellula di germe per conversione di neurone vs scuri animali per valutare la penetranza di fenotipo. In genere, circa 30% degli animali mostrano segnali discreti GFP sulla linea germinale all'impoverimento di lin-53 , mentre non più del 5% degli animali mostrano segnali di GFP diffusi sulla linea germinale su vettore vuoto RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
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</ol>

Gli autori hanno dichiarato che non interessi concorrenti presenti.

Mentre il protocollo descritto utilizzando la transgenici c. elegans ceppo BAT28 e RNAi contro lin-53 è semplice, una serie di passaggi è fondamentale in ordine per garantire il risultato previsto di cellule germinali di riprogrammazione del neurone. È importante che il ceppo BAT28 è tenuto a 15 ° C in ogni momento prima gli esperimenti. Durante la manipolazione e manutenzione del ceppo, il tempo a temperature superiori a 15 ° C deve essere ridotto al minimo per quanto possibile. Condizioni di scossa di calore adeguata sono importanti in quanto insufficiente induzione della sovraespressione di -1 non si tradurrà in cellule germinali alla conversione del neurone ASE. Questo può essere rilevato misurando la penetranza di fenotipo come descritto nel protocollo. Ampia di scossa di calore può causare mortalità degli animali. Per esempio, piatti che sono stati collocati vicino le pareti interne o sul terreno di un incubatore di aria statica inferiore spesso esperienza vasta trattamento termico. Pertanto, si consiglia di utilizzare un incubatore di calore ventilati. Inoltre, sincronizzazione dell'induzione shock termico è critica dal sovra-espressione di -1 durante fasi larvali all'inizio poi L3 può portare a induzione ectopico gcy-5prom::gfp nelle regioni differenti del corpo come la vulva (Figura 3) 9. Inoltre, ricca di scossa di calore può essere rilevato dalla penetranza di fenotipo in animali di RNAi vettore vuoto che non si estenda 5% e aumento della auto-fluorescenza di altri tessuti, vale a dire l'intestino.
Sporadicamente, RNAi batteri possono perdere la loro attività per produrre in modo efficiente dsRNA del gene target. Purtroppo, questo non può essere rilevato prima dell'esperimento di RNAi. In tali casi deve essere coltivata una vena fresca dal glicerolo come descritto nella sezione 2 del protocollo. Se c'è ancora nessun RNAi-ha causato pleiotropico fenotipo visibile come il fenotipo pvul causato da successo RNAi contro lin-53, quindi un plasmide isolamento del DNA dei batteri rispettivo deve essere eseguito e fresca HT115 batteri hanno bisogno di essere trasformate con il plasmide L4400 contenente la sequenza di lin-53 .
D'importanza, il ceppo di BAT28 ha un fenotipo rullo causato dall'iniezione marcatore pRF4, che è stato usato durante la transgenesi degli animali con il hsp-16.2prom::che-1 costruzione del DNA. In alcuni casi, gli animali perdono il fenotipo di rotolamento, che può indicare il silenziamento della hsp-16.2prom::che-1 transgene. Per effettuare correttamente il ceppo BAT28, scegli 10 rullo gli animali per un piatto fresco e propagare selezionando per animali di rotolamento.
L'applicazione del protocollo è limitato alla procedura F1 RNAi, che significa che gli animali i cui genitori (P0 generazione) non sono stati esposti a lin-53 RNAi non mostrerà delle cellule di germe per conversione di neurone dovuto materno soccorso4. Procedura alternativa per convertire le cellule germinali in neuroni è stato descritto da Ciosk e colleghi15 mediante RNAi knock-down del gld-1 e mex-3 senza sovra-espressione di un fattore di trascrizione. Tuttavia, i neuroni ottenuti non appartengono a un tipo specifico di neuroni e cellule germinali anche convertire in tipo di muscolo cellule su svuotamento RNAi-mediata di gld-1 e mex-315. In precedenza, è stato dimostrato il RNAi contro lin-53 ammessi conversione delle cellule di germe in GABAergici neurone-come le cellule su over-espressione del fattore di trascrizione homoedomain Pitx-tipo UNC-3016 invece-14 . Per le direzioni future, differenti destino-induzione della trascrizione fattori possono essere testati se lin-53 impoverito le cellule germinali può essere convertita in altri tipi cellulari di neuroni specifici. In questo contesto, l'iperespressione del fattore di trascrizione bHLH miogeniche HLH-1, omologo del mammifero MyoD17, induce la conversione di cellule germinali in muscoli su lin-53 RNAi5. La consolidata riprogrammazione delle cellule di germe per un tipo specifico di cellule somatiche su lin-53 RNAi e sovra-espressione di un fattore di trascrizione che inducono destino appropriato può essere utilizzata per un certo numero di diversi schermi genetici. Tali schermi soppressore o enhancer possono aiutare dissezione vie regolarici che svolgono un ruolo durante la conversione di destino delle cellule.

Cellulari destino riprogrammazione di espressione ectopica di TF come myogenic MyoD di TF, che, quando sovraespresso, fibroblasti converte direttamente nel muscolo-come le cellule1, è stato un fuoco di ricerca per decenni. Tuttavia, le cellule differenziate sono spesso refrattari a questo processo, a causa di meccanismi che salvaguardare la loro identità cellulare. Cellule germinali mostrano un grado di protezione simile e ci sono meccanismi di fondo che spesso agiscono come una barriera per impedire la conversione delle cellule di germe in altri tipi di cella su over-espressione di un TF destino-induzione. In genere, regolazione epigenetica quali modificazioni istoniche e struttura della cromatina impone un impedimento per la conversione di cella destini2,3. Abbiamo precedentemente applicato genetica inversa mediante RNAi knock-down in c. elegans e identificato i fattori che salvaguardare identità cellulare e quindi contrastano la riprogrammazione delle cellule di germe in neuroni4. In particolare, il polycomb repressive complex 2 (PRC2) e il chaperone altamente conservato istone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 in esseri umani) impediscono la conversione diretta di cellule germinali in tipi specifici di cellule somatiche come neuroni gusto glutamatergici in c. elegans 4 , 5. per identificare questi fattori barriera di riprogrammazione delle cellule di germe, abbiamo usato animali transgenici che trasportano il shock termico inducibile Zn-dito CHE TF-1. -1 è normalmente espressa in testa due neuroni di c. elegans, dove specifica che il destino di neuroni glutamatergici gusto definito ASE6. Il destino di neurone ASE può essere visualizzato dall'espressione dell'ASE specifiche reporter fluorescente gcy-5prom::gfp. GCY-5 è un chemocettore espresse solo in ASE neurone destro7. Al momento lo svuotamento di lin-53 da RNAi e induzione di ampia espressione ectopica di-1 di scossa di calore, le cellule germinali può essere convertite in neuroni in vivo4,5. D'importanza, il tempismo del trattamento RNAi è cruciale come vermi solo adulti (P0 generazione) esposti a lin-53 RNAi danno luogo agli animali di progenie di F1 con un germline che è permissiva per riprogrammare in neuroni4.
La cellula di germe sopra alla procedura di conversione di neurone in c. elegans può essere utilizzata per studiare una varietà di domande biologiche come l'implicazione delle vie in cella destino riprogrammazione di segnalazione. Per esempio, abbiamo usato la cellula di germe-1-induced riprogrammazione in neuroni ASE su RNAi contro lin-53 al fine di studiare l'implicazione della tacca via nel processo delle cellule di germe riprogrammazione8di segnalazione. Eseguendo doppio RNAi per co-impoveriscono lin-53 e l'istone demetilasi-codifica gene utx-1 abbiamo indicato che la tacca signaling pathway contrasta silenziamento genico mediato da PRC2 attivando l'espressione di UTX-1 sulla linea germinale8 . Questa scoperta dimostra che la conversione delle cellule di germe in neuroni descritti nel presente protocollo potrebbe essere usata per studiare un processo biologico complesso come la riprogrammazione cellulare in un organismo intatto e nel contesto di differenti dello sviluppo e dell'ambiente condizioni. Inoltre, fornisce la prospettiva per sfidare le cellule germinali di sovraesprimere diverso destino-induzione TFs per studiare il loro ruolo nella restrizione di plasticità cellulare9o per valutare il loro potenziale di indurre la riprogrammazione delle cellule di germe di tipi di altre cellule in vivo.
Mentre colture di tessuti dei mammiferi consentire anche lo studio di diversi aspetti della cella destino riprogrammazione, le cellule in coltura hanno una limitata capacità di imitare la segnalazione condizioni di percorso rispetto ad un organismo intatto. Di conseguenza, c. elegans è un modello versatile per l'esame dei ruoli dei vari processi biologici come la tacca di segnalazione durante la riprogrammazione in vivo. Inoltre, è un potente modello per schermi genetici che è relativamente facile da mantenere e modificare geneticamente per i bassi costi.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Estratto di lievito&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>USBiologico</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25.163.364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Incubatori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td> per incubatore <td>con shock termico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>per il mantenimento di ceppi di vermi a 15 gradi C o 25 gradi Microscopi C</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>M205 FA</td><td></td> Microscopio Leica <td></td></tr><tr><td>(Imaging) + fotocamera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Microscopio Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(Imaging) + fotocamera</td><td>Stereomicroscopio</td><td>Sensicam PCO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial ceppi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promotore -T7 polimerasi) (polimerasi T7 inducibile da IPTG) (RNAse III minus).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph Ceppo di E. coli</td></tr><tr><td>Worm ceppi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>derivato da OH9846 da 4 volte più incrocio con</td></tr> <tr><td>cloni N2RNAi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>FonteBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Libreria Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm pick&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Fatto in casa utilizzando una pipetta Pasteur e un filo di platino</td></tr></tbody></table>

applicazione di rnai ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studiare i processi biologici delle cellule durante la conversione l'identità dei tipi cellulari specifici fornisce le comprensioni importanti nel meccanismo che mantengono e proteggono le identità cellulare. La conversione delle cellule di germe in neuroni specifici nel nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un potente strumento per l'esecuzione di schermi genetici al fine di sezionare vie regolarici che salvaguardare le identità cellulari stabilizzate. Riprogrammazione delle cellule di germe in un tipo specifico di neuroni chiamati ASE richiede animali transgenici che permettono ampia sovra-espressione della trascrizione Zn-dito fattore (TF)-1. Endogena-1 è espresso esclusivamente nei due neuroni testa e viene richiesto di specificare il destino di neuroni glutamatergici ASE, che possa essere facilmente visualizzato dal reporter gcy-5prom::gfp . Un gene di trans che contiene il costrutto di espressione genica di shock termico promotore-driven -1 permette ampia mis-espressione di-1 nell'animale intero previo trattamento di scossa di calore. La combinazione di RNAi contro il fattore di regolazione della cromatina LIN-53 e la sovra-espressione indotta da calore-shock -1 conduce alla riprogrammazione di cellule germinali in cellule del neurone-come ASE. Descriviamo qui la procedura specifica di RNAi e condizioni adeguate per il trattamento di shock termico di animali transgenici per indurre con successo delle cellule di germe alla conversione del neurone.

Come mostrato nella Figura 1, F1 animali che presentano il fenotipo pvul illustrano la riuscita applicazione di lin-53 RNAi. Questi animali sono inclini consentire la conversione delle loro cellule di germe in ASE neurone-come le cellule all'induzione di scossa di calore di sovra-espressione -1 come illustrato nella Figura 2. A differenza di worm che è cresciuta sul controllo vuoto vector RNAi lin-53 RNAi trattamento produrrà animali che visualizzano ectopici GFP-segnali in zona metà del corpo dopo shock termico e incubazione di 25 ° C durante la notte come descritto precedentemente4, 8. approfondimento sotto un microscopio a epifluorescenza di questi vermi rivela che le cellule mostrando segnali GFP anche visualizzano neurone-come le proiezioni (Figura 2B, frecce bianche) che sono tipiche per le cellule di un neurone. Se RNAi contro lin-53 non riuscita o condizioni di scossa di calore sono state inadeguate GFP segnali saranno simili a quelli di controllo RNAi animali trattati (Figura 2). Importante, di evitare inducendo la sovra-espressione di -1 tramite induzione di calore prima che raggiungano gli animali metà L3 fase. Gli animali che erano troppo giovani al momento della induzione di sovraespressione di -1 possono visualizzare espressione ectopica gcy-5prom::gfp in altre regioni del corpo come la vulva in via di sviluppo, come illustrato nella Figura 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figura 1: Pvul fenotipo causato da RNAi contro lin-53. (In alto) Foto DIC di vermi di L4/giovane adulto palco F1 progenie derivata da madri di RNAi trattati di controllo o lin-53 . Scala bar = 20 µm. (in basso) animali trattati con lin-53 RNAi Visualizza il fenotipo di vulva (pvul) sporgente (frecce nere). Il fenotipo di pvul conferma che la RNAi contro lin-53 è stata completata. Scala bar = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figura 2: Worm con riprogrammata con successo delle cellule di germe in neuroni. (A) BAT28 animali di ceppo coltivati il vettore vuoto non mostrano segnali GFP in linea germinale dopo induzione di scossa di calore della sovraespressione di -1 . Linea bianca tratteggiata delinea verme. Scala bar = 20 µm. (B) in contrasto con BAT28 animali di ceppo coltivati sul controllo vettore vuoto RNAi animali cresciuti su lin-53 RNAi visualizzare gcy-5prom::gfp i segnali nella zona metà del corpo. Foto della sezione metà del corpo con segnali GFP prese a ingrandimento X 63 rivela cellule GFP-positive mostrando sporgenze (frecce bianche). Questa caratteristica morfologica indica che le cellule germinali hanno subito la conversione in ASE neurone-come cellule. Gli asterischi bianchi contrassegnano intestino-derivato auto-fluorescenza. Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza con ingrandimento e 63 X ingrandimento: 20x. Linea bianca tratteggiata delinea vermi. Scala bar = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figura 3: Verme di fase precoce con GFP ectopico. BAT28 ceppo animali cresciuti sui batteri RNAi vettore vuoto che sono stati di shock termico indotto per la sovraespressione di -1 nei primi stadi larvali come L2 mostrano segnali GFP in zona metà del corpo (bianchi asterischi). Questi segnali non sono a causa di riprogrammazione delle cellule di germe. Linea bianca tratteggiata delinea verme. Scala bar = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive come studiare processi cellulari durante la conversione di destino delle cellule in Caenorhabditis elegans in vivo. Utilizzo di animali transgenici, permettendo la sovraespressione di promotore-driven shock termico il neurone destino-induzione del fattore di trascrizione-1 e lo svuotamento RNAi-mediata della cellula di germe di LIN-53 della cromatina-Regolazione fattore di riprogrammazione del neurone può essere osservato in vivo.

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre la conversione di cellule germinali in neuroni in C.elegans. Questo metodo può aiutare a studiare l'implicazione di processi biologici, come le vie di segnalazione o l'epigenetica nella regolazione della riprogrammazione del destino cellulare. Il vantaggio principale del metodo descritto in questo video è che negli animali vivi, le cellule germinali possono essere sfidate dalla sovraespressione di un fattore di trascrizione che induce il destino.Parallelamente, è possibile eseguire uno screening genetico come uno screening RNAi al fine di identificare nuovi fattori implicati nella regolazione della riprogrammazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia rigenerativa. Perché questo metodo in vivo potrebbe essere utilizzato per studiare la riprogrammazione cellulare in diverse condizioni di sviluppo e ambientali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di riprogrammazione sono difficili da imparare. Perché il fenotipo di conversione da cellula germinale a neurone, dopo l'esaurimento di lin-53, avviene solo in condizioni attentamente controllate. Per le piastre RNAi, caricare piastre da sei centimetri con agar NGM contenente IPTG e carbenicillina.Lasciateli asciugare per 24-48 ore a temperatura ambiente al buio. Quindi trasferirli a quattro gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Successivamente, striare piastre selettive contenenti carbenicillina e tetraciclina con cloni di batteri RNAi con plasmide L4440 che trasporta il gene lin-53.Utilizzare un modello di striature trifase e assicurarsi di placcare un controllo vettoriale vuoto. Quindi, fai crescere le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, raccogli almeno tre colonie singole e inocula ciascuna di esse in una provetta di coltura separata con due millilitri di LB, integrata con carbenicillina, ma non tetraciclina.Pianifica di avere tre colture sane per condizione. Successivamente, coltiva le colture durante la notte a 37 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri da 0,6 a 0,8. Quindi, aggiungere 500 microlitri di ciascuna coltura batterica a una piastra NGM agar RNAi da sei centimetri.Incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente al buio. Questo protocollo è ottimizzato per i vermi del ceppo BAT28 mantenuti a 15 gradi Celsius, ai quali i transgeni sono più stabili. I dettagli sulla genetica del ceppo sono forniti nel testo.La sincronizzazione dell'età dei vermi è fondamentale. Usa la tecnica dello sbiancamento. Lavare le piastre di agar NGM da sei centimetri contenenti adulti e uova utilizzando 800 microlitri di M9. Quindi pellettare i vermi mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante.Quindi, aggiungi da 1/2 a un millilitro di soluzione sbiancante ai vermi. E mentre guardi i vermi sotto uno stereoscopio, agita il tubo fino a quando i vermi adulti iniziano ad aprirsi, quindi raccogli le uova. Ora, separa i rifiuti dalle uova.Per prima cosa centrifugare la provetta e smaltire il surnatante. Quindi lavare tre volte il pellet di fazzoletti con 800 microlitri di M9. Assicurati di utilizzare la centrifugazione per raccogliere i tessuti tra i lavaggi.Ora, trasferisci le uova pulite in piastre NGM fresche seminate con batteri OP50. Controllare brevemente il successo dell'isolamento degli embrioni e il loro trasferimento nelle piastre NGM. Fai crescere gli animali a 15 gradi Celsius.Per ottenere la conversione da cellula germinale a neurone dopo la deplezione di lin-53, la deplezione deve iniziare nella generazione parentale. Per esaurire lin-53, sottoporre gli animali L4 a RNAi. Trasferire manualmente 50 vermi L4 per replica su una piastra NGM RNAi senza batteri.Usa un filo di platino. I vermi L4 possono essere riconosciuti da una macchia bianca circa a metà strada lungo i loro lati ventrali. Ora, incubare i vermi a 15 gradi Celsius al buio per circa sette giorni.L'IPTG è sensibile alla luce. Quando la progenie F1 raggiunge gli stadi L3 e L4, separala dagli animali parentali più grandi e più spessi. A questo punto, esaminare l'F1 per il fenotipo vulva sporgente, che indica che l'RNAi contro lin-53 ha avuto successo.L'attività dell'RNAi può anche provocare letalità, che aumenta oltre i 15 gradi Celsius. Per attivare il che-1 e indurre la conversione da cellula germinale a neurone nella progenie F1, lo shock termico dei vermi per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Utilizzare un'incubatrice ventilata, poiché consente uno shock termico più efficiente.Dopo lo shock termico, incubare le piastre a 25 gradi Celsius durante la notte al buio. È importante evitare di indurre la sovraespressione di che-1 per shock termico prima che gli animali raggiungano lo stadio L3 medio. Questo può portare all'espressione della proteina che-1 in tessuti non bersaglio.Il giorno successivo, impostare una sorgente di luce a fluorescenza e un filtro GFP per esaminare gli animali alla ricerca di fluorescenza derivata da transgeni nell'area centrale del corpo. Per valutare la penetranza fenotipica, trovare il rapporto tra gli animali che emettono un segnale fluorescente. In genere, circa il 30% mostrerà un segnale GFP discreto.In confronto, negli animali portatori del vettore RNAi vuoto, anche un segnale diffuso nella linea germinale non è visto in più del 5% della popolazione. Gli animali F1 che presentano il fenotipo della vulva sporgente illustrano l'applicazione di successo dell'RNAi lin-53. In questi animali, la conversione di cellule germinali in cellule simili ai neuroni ASE dopo l'induzione da shock termico di che-1 è comune.Un esame ravvicinato rivela proiezioni simili a quelle dei neuroni che sono tipiche dei neuroni delle cellule germinali. Al contrario, i controlli vettoriali vuoti hanno mostrato un'espressione minima di GFP, che era al massimo diffusa. Le cellule germinali di questi animali mancavano di caratteristiche simili a quelle dei neuroni.Quando gli animali erano troppo giovani al momento dell'induzione della sovraespressione di che-1, spesso mostravano l'espressione del transgene ectopico in altre regioni del corpo, come la vulva in via di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come pianificare ed eseguire attentamente gli esperimenti utilizzando vermi viventi al fine di riprogrammare le cellule germinali in neuroni. Il metodo descritto qui in questo video vi permetterà ora di studiare l'implicazione di una serie di fattori diversi nella regolazione della riprogrammazione cellulare.Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 10 giorni. Durante il tentativo di esperimento, è importante mettere in scena attentamente gli animali prima dell'induzione della riprogrammazione e mantenere il ceppo BAT28 a 15 gradi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il doppio RNAi per affrontare ulteriori domande come: quali sono i meccanismi sottostanti che svolgono un ruolo durante le conversioni del destino cellulare?

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Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans (Video) | JoVE Journal

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

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