Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre la conversione di cellule germinali in neuroni in C.elegans. Questo metodo può aiutare a studiare l'implicazione di processi biologici, come le vie di segnalazione o l'epigenetica nella regolazione della riprogrammazione del destino cellulare. Il vantaggio principale del metodo descritto in questo video è che negli animali vivi, le cellule germinali possono essere sfidate dalla sovraespressione di un fattore di trascrizione che induce il destino.

Parallelamente, è possibile eseguire uno screening genetico come uno screening RNAi al fine di identificare nuovi fattori implicati nella regolazione della riprogrammazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia rigenerativa. Perché questo metodo in vivo potrebbe essere utilizzato per studiare la riprogrammazione cellulare in diverse condizioni di sviluppo e ambientali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di riprogrammazione sono difficili da imparare. Perché il fenotipo di conversione da cellula germinale a neurone, dopo l'esaurimento di lin-53, avviene solo in condizioni attentamente controllate. Per le piastre RNAi, caricare piastre da sei centimetri con agar NGM contenente IPTG e carbenicillina.

Lasciateli asciugare per 24-48 ore a temperatura ambiente al buio. Quindi trasferirli a quattro gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Successivamente, striare piastre selettive contenenti carbenicillina e tetraciclina con cloni di batteri RNAi con plasmide L4440 che trasporta il gene lin-53.

Utilizzare un modello di striature trifase e assicurarsi di placcare un controllo vettoriale vuoto. Quindi, fai crescere le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, raccogli almeno tre colonie singole e inocula ciascuna di esse in una provetta di coltura separata con due millilitri di LB, integrata con carbenicillina, ma non tetraciclina.

Pianifica di avere tre colture sane per condizione. Successivamente, coltiva le colture durante la notte a 37 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri da 0,6 a 0,8. Quindi, aggiungere 500 microlitri di ciascuna coltura batterica a una piastra NGM agar RNAi da sei centimetri.

Incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente al buio. Questo protocollo è ottimizzato per i vermi del ceppo BAT28 mantenuti a 15 gradi Celsius, ai quali i transgeni sono più stabili. I dettagli sulla genetica del ceppo sono forniti nel testo.

La sincronizzazione dell'età dei vermi è fondamentale. Usa la tecnica dello sbiancamento. Lavare le piastre di agar NGM da sei centimetri contenenti adulti e uova utilizzando 800 microlitri di M9. Quindi pellettare i vermi mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante.

Quindi, aggiungi da 1/2 a un millilitro di soluzione sbiancante ai vermi. E mentre guardi i vermi sotto uno stereoscopio, agita il tubo fino a quando i vermi adulti iniziano ad aprirsi, quindi raccogli le uova. Ora, separa i rifiuti dalle uova.

Per prima cosa centrifugare la provetta e smaltire il surnatante. Quindi lavare tre volte il pellet di fazzoletti con 800 microlitri di M9. Assicurati di utilizzare la centrifugazione per raccogliere i tessuti tra i lavaggi.

Ora, trasferisci le uova pulite in piastre NGM fresche seminate con batteri OP50. Controllare brevemente il successo dell'isolamento degli embrioni e il loro trasferimento nelle piastre NGM. Fai crescere gli animali a 15 gradi Celsius.

Per ottenere la conversione da cellula germinale a neurone dopo la deplezione di lin-53, la deplezione deve iniziare nella generazione parentale. Per esaurire lin-53, sottoporre gli animali L4 a RNAi. Trasferire manualmente 50 vermi L4 per replica su una piastra NGM RNAi senza batteri.

Usa un filo di platino. I vermi L4 possono essere riconosciuti da una macchia bianca circa a metà strada lungo i loro lati ventrali. Ora, incubare i vermi a 15 gradi Celsius al buio per circa sette giorni.

L'IPTG è sensibile alla luce. Quando la progenie F1 raggiunge gli stadi L3 e L4, separala dagli animali parentali più grandi e più spessi. A questo punto, esaminare l'F1 per il fenotipo vulva sporgente, che indica che l'RNAi contro lin-53 ha avuto successo.

L'attività dell'RNAi può anche provocare letalità, che aumenta oltre i 15 gradi Celsius. Per attivare il che-1 e indurre la conversione da cellula germinale a neurone nella progenie F1, lo shock termico dei vermi per 30 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Utilizzare un'incubatrice ventilata, poiché consente uno shock termico più efficiente.

Dopo lo shock termico, incubare le piastre a 25 gradi Celsius durante la notte al buio. È importante evitare di indurre la sovraespressione di che-1 per shock termico prima che gli animali raggiungano lo stadio L3 medio. Questo può portare all'espressione della proteina che-1 in tessuti non bersaglio.

Il giorno successivo, impostare una sorgente di luce a fluorescenza e un filtro GFP per esaminare gli animali alla ricerca di fluorescenza derivata da transgeni nell'area centrale del corpo. Per valutare la penetranza fenotipica, trovare il rapporto tra gli animali che emettono un segnale fluorescente. In genere, circa il 30% mostrerà un segnale GFP discreto.

In confronto, negli animali portatori del vettore RNAi vuoto, anche un segnale diffuso nella linea germinale non è visto in più del 5% della popolazione. Gli animali F1 che presentano il fenotipo della vulva sporgente illustrano l'applicazione di successo dell'RNAi lin-53. In questi animali, la conversione di cellule germinali in cellule simili ai neuroni ASE dopo l'induzione da shock termico di che-1 è comune.

Un esame ravvicinato rivela proiezioni simili a quelle dei neuroni che sono tipiche dei neuroni delle cellule germinali. Al contrario, i controlli vettoriali vuoti hanno mostrato un'espressione minima di GFP, che era al massimo diffusa. Le cellule germinali di questi animali mancavano di caratteristiche simili a quelle dei neuroni.

Quando gli animali erano troppo giovani al momento dell'induzione della sovraespressione di che-1, spesso mostravano l'espressione del transgene ectopico in altre regioni del corpo, come la vulva in via di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come pianificare ed eseguire attentamente gli esperimenti utilizzando vermi viventi al fine di riprogrammare le cellule germinali in neuroni. Il metodo descritto qui in questo video vi permetterà ora di studiare l'implicazione di una serie di fattori diversi nella regolazione della riprogrammazione cellulare.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 10 giorni. Durante il tentativo di esperimento, è importante mettere in scena attentamente gli animali prima dell'induzione della riprogrammazione e mantenere il ceppo BAT28 a 15 gradi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il doppio RNAi per affrontare ulteriori domande come: quali sono i meccanismi sottostanti che svolgono un ruolo durante le conversioni del destino cellulare?