Name: Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Scopri un metodo di rilevamento in loco dei fitopatogeni terricoli mediante PCR in tempo reale portatile. Questo protocollo consente una diagnosi rapida sul campo per una gestione efficace delle malattie delle piante.

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Siamo grati al Dr. Neil C. Gudmestad North Dakota State University per la fornitura di S. subterranea plasmide DNA, Dr. Hanu Pappu a Washington State University (WSU) per la fornitura di PMTV RNA e Dr. Debra Inglis presso WSU per la fornitura di r. solani AG3. Grazie Dr. Jeremy Jewell presso WSU speciale per fornire commenti sul manoscritto e WSU CAHNRS Communications per videografia. Questa ricerca è stata sostenuta dal Consorzio di ricerca di patate di nord-ovest e Washington State Department of Agriculture - programma di specialità Crop Block Grant (grant no. K1764). PPNS n. 0741, dipartimento di fitopatologia, Università di agricoltura, delle risorse umane e naturali scienze, centro di ricerca agricolo, tratteggio progetto n ° WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, Stati Uniti.

1. in loco rilevazione molecolare degli agenti patogeni utilizzando un sistema di PCR in tempo reale portatile
Nota: Vedere la Figura 1.
<ol><li>Estrazione di DNA magnetico basato sul tallone Nota: Un branello-base DNA estrazione kit magnetico (ad es. da PCR) è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Tutti i reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente (18-25 ° C). Una volta che il liofilizzato proteinasi K (bottiglia no. 1) è sospeso (con bottiglia no. 1a), conservare a-20 ° C.<ol>
<li>Mescolare 20-50 mg di campione di terreno con 500 µ l di soluzione di preparazione del campione in una microprovetta. Nota: Il rapporto del suolo: Prep soluzione è importante come mescolarli in altri rapporti può causare un errore di esperimenti a valle (ad es., contaminazione dagli inibitori della PCR).</li>
		<li>Macinare il suolo sul fondo del tubo con un piccolo pestello sterile fino a quando la soluzione è torbida. Ulteriormente sospendere particelle di suolo nella soluzione agitando i conetti e lasciar riposare, indisturbato, di lasciare il suolo particelle si depositano completamente (in genere tra 5-10 min).</li>
		<li>Trasferire 200 µ l del surnatante in una microprovetta fresca e aggiungere 200 µ l di tampone di lisi (bottiglia n ° 2: soluzione di cloridrato della guanidina) e 20 µ l di proteinasi K (bottiglia no. 1).</li>
		<li>Mescolare il lisato accuratamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Nota: Se il lisato viene trovato sul coperchio conetti, tocca il tubo o utilizzare una centrifuga, se disponibile per rimuovere il coperchio.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di mix di perle buffer/magnetico l'associazione (bottiglia no. 3) al campione lisato. Miscelare bene pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti di distanza il portaprovette magnetico. Nota: Assicurarsi di mescolare la soluzione perlina bene prima dell'uso per garantire che le perle sono aliquotate in modo uniforme da bombola di stoccaggio.</li>
		<li>Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico. Quindi, rimuovere e scartare tutte del surnatante pipettando. Nota: Non disturbare le perline magnetizzate durante la rimozione e aspirare il supernatante. DNA in questo momento è stato catturato dai branelli magnetici.</li>
		<li>Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-1 (bottiglia n. 4: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Eseguire questo passaggio di lavaggio per rimuovere le proteine e sale dal campione. Lasciate il composto riposare per 30 s.</li>
		<li>Ripetere il punto 1.1.6.</li>
		<li>Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-2 (bottiglia n ° 5: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate il composto riposare per 30 s.</li>
		<li>Ripetere il punto 1.1.6.</li>
		<li>Rimuovere la microprovetta da portaprovette magnetico e quindi aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% (bottiglia no. 6). Nota: Questo passaggio è necessario per la rimozione di sali residui dal campione.<ol>
<li>Risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate che questo stand per 10 min con miscelazione occasionale di inversione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ripetere il punto 1.1.6.</li>
		<li>Il pellet di biglie magnetiche per 10 min a temperatura ambiente con il coperchio di Conetti aperto asciugare all'aria. Nota: Le perle dovrebbero essere liberi da qualsiasi etanolo residuo visibile ma non completamente asciugato.</li>
		<li>Rimuovere la provetta dal portaprovette magnetico, 50-200 µ l di tampone di eluizione (bottiglia n. 7) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi e lasciar riposare per 30 s. Nota: Nei passaggi precedenti, il DNA purificato è rilasciato dai branelli magnetici il tampone di eluizione.</li>
		<li>Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico.</li>
		<li>Trasferire il surnatante che ora contiene il DNA/RNA purificato ad una microprovetta 0,5 mL per uso nelle fasi a valle.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR in tempo reale portatile Nota: Un termociclatore portatile e il kit di dosaggio PCR sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore (Vedi la Tabella materiali).<ol>
<li>Aprire ed eseguire il software thermocycler-collegato, selezionare test di rilevazione dei Target e tutte le informazioni di descrizione nei campi di immissione dati nome & dettagli, note, campioni e test di ingresso. Nota: Wells #1 e #2 sono designati con il software per il controllo negativo e positivo controllo, rispettivamente.</li>
		<li>Preparare prima i reagenti PCR dell'uso. Trasferire 500 µ l di buffer di risospensione di mix master nel mix master liofilizzato contenente di tubo e mescolare bene capovolgendo. Trasferire l'intero mix master in provetta marrone etichettato primer/sonda (tabella 2).<ol>
<li>Tappo e agitare la provetta per mescolare. Accurata miscelazione è necessario assicurarsi che tutti i componenti sono nuovamente sospeso completamente. Lasciate questo composto riposare per 5 minuti prima dell'uso. Nota: Conservare la miscela di reazione a-20 ° C dopo l'uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare un controllo negativo con il trasferimento di 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di acqua deionizzata sterile privo di nucleasi.</li>
		<li>Preparare un controllo positivo trasferendo 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passo 1.2.2 in una provetta PCR da 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di modello di controllo positivo.</li>
		<li>Per ogni campione, trasferire 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e quindi aggiungere 10 µ l di DNA campione preparato dal passaggio 1.1.16.</li>
		<li>Caricare i pozzetti del termociclatore con il contenuto da loro rispettivi tubi PCR come descritto al punto 2.1.1.</li>
		<li>Una volta che tutte le informazioni necessarie sono state inserite e confermate, selezionare Start, Esegui e scegliere lo strumento collegato a ethernet o un drive USB. Nota: Se è selezionata l'opzione di unità USB, l'esecuzione file deve essere salvato sul disco per essere utilizzato con il termociclatore (ad esempio, F:\genesig). La corsa inizierà immediatamente dopo l'unità è inserita nel termociclatore.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati del portatile PCR in tempo reale.
	<ol>
<li>Una volta terminata la corsa, aprire il file run (dongle) da unità USB utilizzando il software thermocycler-collegata o visualizzare direttamente i risultati di esecuzione del software facendo clic su risultati.</li>
		<li>Prima di analizzare i risultati, salvare la corsa completata per evitare di perdere dati.</li>
		<li>Nella scheda risultati , visualizzare lo stato dell'esecuzione, classificati da campioni. Nota: Dati che possono essere ottenuti in questa scheda sono lo stato di risultati e copiare il numero rilevato nel campione.</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Dettagli per visualizzare le curve di amplificazione. Quando l'obiettivo viene rilevata correttamente, vengono visualizzati valori di Cq (ciclo di quantificazione) del bersaglio e del controllo interno. Nota: Questi valori sono calcolati nel rapporto finale e vengono utilizzati per determinare se un campione è positivo per la destinazione e se ci sono problemi con la reazione o i campioni di DNA.</li>
	</ol></li>
</ol>2. altri protocolli
<ol><li>
Metodi alternativi basati su laboratorio DNA estrazione
	<ol>
<li>
Metodi basati CTAB-fenolo-cloroformio
		<ol>
<li>Eseguire metodi CTAB-fenolo-cloroformio basato, seguendo il metodo Doyle18 e la Dellaporta metodo19 come descritto in precedenza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Metodo di mini-preparazione DNA Nota: Il metodo Edwards20 è stato effettuato come segue.<ol>
<li>Aggiungere 500 mg di terreno, seguito da 750 µ l di tampone di Edwards (200 millimetri Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) e cinque perle di ceramica di 1.4 mm per una microprovetta e mescolare bene.</li>
			<li>Incubare i conetti a 65 ° C per 5 min.</li>
			<li>Omogeneizzare il campione con un omogeneizzatore del battitore di tallone per 60 s (o utilizzando un mortaio e pestello).</li>
			<li>Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 min.</li>
			<li>Trasferire 500 µ l del surnatante ad una microprovetta fresca e poi mescolare con 500 µ l di isopropanolo refrigerato. Mescolare capovolgendo la provetta 10 volte.</li>
			<li>Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min pelletizzare il DNA.</li>
			<li>Decantare il supernatante e lasciare che l'aria di pellet di DNA asciugare a temperatura ambiente fino a quando i rimanente etanolo evaporato.</li>
			<li>Lavare la pallina di DNA con 750 µ l di etanolo al 70% refrigerati.</li>
			<li>Il pellet asciugare all'aria prima di ri-sospendere in 50-100 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Altri metodi alternativi
		<ol>
<li>Eseguire l'estrazione di DNA di silice-base utilizzando kit #1 (MP BIO Fast Spin del DNA) e kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) secondo le istruzioni dei fabbricanti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale. Nota: Un termociclatore convenzionale è stato utilizzato con mastermix per PCR basata su probe, vari primer e sonde del oligonucleotide (tabella 2).<ol>
<li>Usando la PCR a fondo non trasparente tubi o un piatto PCR, preparare 20 reazioni µ l per tutti i campioni di DNA da analizzare, così come un negativo di controllo (acqua deionizzata priva di nucleasi) e un controllo positivo modello preparate in casa.</li>
		<li>Per ogni PCR tubo o Beh, preparare una miscela tra cui 10 µ l del mastermix, 7 µ l di acqua deionizzata priva di nucleasi, 2 µ l di primer/sonda di 2 µM e 1 µ l di DNA campione (dal passaggio 1.1.16 o 2.1) o modello di controllo, per esempio.</li>
		<li>Chiudere le provette PCR o la piastra e iniziare la reazione selezionando il programma PCR appropriato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati di PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale
	<ol>
<li>Utilizzare software thermocycler-collegato per analizzare i risultati dal termociclatore convenzionali. Per iniziare l'analisi dei dati, è possibile trasferire il file eseguito dal termociclatore su un'unità USB, inserire un'unità USB e selezionare Export.</li>
		<li>Aprire il file di dati (.pcrd) dall'esportato esecuzione nel software thermocycler-collegata.</li>
		<li>Evidenziare il pozzo di un campione individuando la corrispondente bene sullo strumento. Curve di amplificazione e curve standard (se applicabile) sono generate automaticamente. Se non viene immesso le informazioni di esempio, fare clic su Installazione piastra o una funzione simile per iniziare i dati di input prima di analizzare i dati.</li>
		<li>Visualizzare i dati sulla scheda di quantificazione; Questo può essere esportato per l'analisi dei dati con un software di terze parti come i lettori di file CSV, XML o HTML.</li>
		<li>Ottenere dati Cq basati su determinate soglie e confrontarlo con i controlli positivi e negativi. Nota: Se gli standard di DNA dell'obiettivo sono stati utilizzati nel test, confrontare i dati di Cq di campione a quella delle norme per determinare il cut-off di Cq</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).</li>
<li>Narayanasamy, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNarayanasamy%2C+P+%22Microbial+Plant+Pathogens%3A+Detection+and+Management+in+Seeds+and+Propagules%22">Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules</a>. , John Wiley & Sons. (2016).</li>
<li>Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lateral-flow+immunoassay+for+phytosanitary+detection+of+Erwinia+amylovora+and+on-site+fire+blight+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Come illustrato nella tabella 1, i recenti progressi tecnologici nell'identificazione molecolare di agenti patogeni hanno aumentato l'efficacia, precisione e velocità della diagnosi, che hanno contribuito alla rilevazione di infezioni pre-sintomatiche27. Per quanto riguarda la diagnosi in loco, lampada e metodi di flusso laterale spesso vengono utilizzati perché sono portatili e fornire risultati immediati ad un costo inferiore. Tuttavia, nel caso di metodi sierologici, specie-rilevazione può essere difficile da raggiungere. In questo modo occasionalmente misdetection di microbi fuori bersaglio come abitanti di terreno comune. Ad esempio, ci possono essere cross-reattività tra i test sierologici di Phytophthora spp. e Pythium spp. nel caso di patate patogeni28, che indica che ci sono a volte difficoltà rilevare la pianta mirata agenti patogeni.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per il rilevamento in loco molecolare degli agenti patogeni terricoli patate utilizzando il sistema PCR in tempo reale portatile confrontando le sue capacità con quella di un convenzionale sistema PCR in tempo reale basato su lab. Abbiamo trovato che il metodo in loco rileva specificamente gli agenti patogeni della patata nel campione di terreno, anche se la sensibilità è ~ 10 volte inferiore a quello di un'analisi di laboratorio-basata equivalente. Vale anche la pena considerare che in questo caso i test di laboratorio e di campo non ha utilizzato un campione di biologicamente rilevanti dimensioni. Campioni di grandi dimensioni sono necessari per l'utilizzo in terreni campo di screening ordinariamente come descritto in precedenza29,30, dove vengono elaborati dimensioni del campione di fra 250 g e 1 kg, anche se questi metodi richiedono operatori specializzati e sofisticati attrezzature per estrazione del DNA. In genere, un terreno su larga scala estrarre DNA è ripreso da un campione rappresentativo di singolo terreno di aggregazione dei numerosi sottocampioni da 1 a 4 ettari6,29,30. Tuttavia, il protocollo sviluppato qui è veloce, facile da usare per gli utenti con nessuna esperienza precedente nella diagnostica molecolare e può essere utilizzato di fuori di un laboratorio. Come il metodo è rapido e relativamente economico rispetto ad estrazione dal suolo su larga scala, esso potrebbe essere usato per schermo molti su piccola scala campioni prelevati da un'area di campionamento simile a campioni globali su larga scala. Questo potrebbe superare alcune delle carenze di un campione di piccole dimensioni e determinare ulteriori informazioni sulla distribuzione spaziale del patogeno nel campo. Inoltre, la portabilità e la velocità del metodo significa che può anche essere utilizzato in attività di dimostrazione ai coltivatori per didattica e scopi di fidanzamento.
Un'altra considerazione è che molti Real-Time PCR sono già stati pubblicati per una vasta gamma di agenti patogeni di impianto5. Questo sistema può fare uso di queste analisi esistenti senza la necessità di progettare nuovi primer lampada per abilitare in test sul campo. Una critica frequente di lampada saggi è che possono essere difficili da progettare31. PCR portatile, pertanto, consente l'implementazione relativamente facile di una vasta gamma di test di agente patogeno prontamente disponibili per la prova in loco.
Metodi tradizionali possono essere spesso costosa, laboriosa, inesatti e che richiede tempo. La semplicità del metodo in loco che abbiamo sviluppato consente i coltivatori e lavoratori del settore per eseguire il rilevamento del patogeno da soli e forse generare un risultato molto più velocemente che l'invio ad un laboratorio di diagnostico che potrebbe essere una certa distanza. La prontezza e la sensibilità del metodo PCR portatile può aiutare i coltivatori a fine di evitare possibili infezioni secondarie, che possono ulteriormente aumentano della popolazione dell'agente patogeno e involontaria diffusione (tramite apparecchiature o esseri umani). In conclusione, il metodo in loco sviluppato nello studio presente consente il rilevamento preciso e relativamente sensibile di importanti patogeni terricoli nel settore. La nostra speranza è che il metodo in loco sviluppato in questo studio contribuirà a una pipeline di diagnostica corrente (Figura 6), non solo fornendo risposte rapide e precise alle domande epidemiologiche sulle malattie delle piante in campo, ma anche fornendo comprensione aumentata della biologia e l'epidemiologia dei patogeni vegetali.

Identificazione rapida e accurata di agenti patogeni causativi influisce notevolmente le decisioni per quanto riguarda la gestione della malattia di pianta. Malattie del suolo sono particolarmente difficili da diagnosticare perché l'ambiente di suolo è estremamente grande rispetto impianto di massa e complesso, rendendolo una sfida per capire tutti gli aspetti delle malattie del suolo. Inoltre, malattie del suolo possono essere senza sintomi durante le prime fasi di infezione, dipendente da fattori di stress ambientale, e alcuni hanno lunghi tempi di latenza che provocano le diagnosi in ritardo1. Molti agenti patogeni terricoli hanno sviluppato strutture di sopravvivenza, come specializzate spore o IFE melanized, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni anche in assenza dei loro ospiti. Gli approcci utilizzati per la gestione della malattia terricoli includono: evitando noti campi infestati, utilizzo di sementi certificate da organismi patogeni e piantine, mantenere attrezzature sanitarie e limitare il movimento del suolo e dell'acqua quando possibile. Conoscenza della presenza dell'agente patogeno attraverso strategie di rilevazione molecolare può anche svolgere un ruolo utile informando decisioni tempestive per quanto riguarda i trattamenti in fase iniziale o pre-impianto valutazioni dei campi. Test in loco fornisce ulteriori vantaggi di fornire un risultato rapido senza inviare il campione ad un laboratorio di diagnostico che forse qualche distanza distanza e anche possibile impegnarsi il coltivatore se è tale una diagnostica eseguita lato del campo in loro presenza.
Per la diagnosi in loco basata sulla rilevazione molecolare, sensibilità, specificità, robustezza (ripetibilità e riproducibilità) ed efficienza (cioè., semplicità e l'economicità) sono fattori cruciali per la considerazione. Laterale dispositivi di flusso (LFDs) come il Immunostrip e PocketDiagnostic, sono metodi popolari per rilevamento del patogeno in loco a causa della loro semplicità come un saggio di uno stadio. Tuttavia, LFDs non può essere lo strumento di diagnostica di destra in tutte le situazioni, perché manca la sensibilità e specificità e occasionalmente fornisce risultati ambigui se l'agente patogeno bersaglio e in basse concentrazioni possa cross-reagiscono con specie o generi simili 2. amplificazione isotermica mediata da Loop (lampada) è anche applicabile per il rilevamento del patogeno in loco ed è particolarmente poco costoso a causa del basso costo reagenti, condizioni di reazione che rimangono costanti e semplice analisi colorimetrica visiva. Tuttavia, lampada e LFDs vengono in genere utilizzati qualitativamente, sebbene entrambi gli approcci possono essere utilizzati quantitativamente con più costose attrezzature3. La reazione a catena della polimerasi (PCR) offre alta specificità, alta sensibilità e una possibilità quantitative rispetto ai metodi di rilevazione di cui sopra. Tuttavia, la tecnologia PCR basati su laboratorio convenzionale richiede costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato, che è dei principali svantaggi nell'adozione di questa tecnologia come metodo di rilevazione per scopi in loco.
In questo protocollo, è dimostrato un metodo diagnostico in loco utilizzando uno strumento portatile di PCR in tempo reale. Tecnologia PCR in tempo reale offre vantaggi rispetto ad altri metodi in termini di accuratezza quantitativa, sensibilità e versatilità ed è stato ampiamente utilizzata per la rilevazione di una vasta gamma di pianta patogeni4,5, tra cui vari agenti patogeni della patata nel suolo6. A causa delle recenti tendenze del mercato competitivo, rapida crescita, attrezzature necessarie per la tecnologia PCR ha continuato a sviluppare per essere più compatto e meno costoso7. Il protocollo è composto come segue: estrazione dell'acido nucleico tallone-base magnetica, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay) e analisi quantitativa dei dati che può essere fatto in remoto utilizzando un computer portatile (Figura 1).
Utilizzando il protocollo PCR portatile sviluppato qui, campioni di terreno sono stati analizzati per rilevare l'agente patogeno terricoli, Spongospora subterranea. Spongospora è stato scelto in quanto è un agente patogeno importante patata come agente causale di scab farinosa8. Negli ultimi decenni, la presenza di questa malattia è considerata di avere diffuso in molte regioni dove le patate sono coltivate9,10. Crosta è farinosa, attraverso la presenza di brufolo come lesioni sui tuberi possono causare perdite di resa qualitativa considerevole ai coltivatori di patate. Inoltre, S. subterranea può vector patata Mop Top Virus (PMTV), che può causare sintomi di lesione interna in tuberi (conosciuti come spraing)11,12. Pertanto, è importante sapere se S. subterranea è presente nei campi prima della piantatura6. Inoltre dimostriamo l'utilità di questo protocollo per la rilevazione di Rhizoctonia solani anastomosi gruppo 3 (AG3) e PMTV. Anche se parecchi gruppi di anastomosi di Rhizoctonia solani causano malattie nelle patate, AG3 è senza dubbio il più importante in tutto il mondo13, causando cancro staminali e forfora nera con conseguente perdite di rendimento negoziabili fino al 30%14. PMTV provoca lesioni necrotiche all'interno i tuberi, che sono comunemente chiamati spraing. Questo virus recentemente è stato segnalato per la prima volta in diversi stati nel nord-ovest Pacifico15,16,17ed è di crescente preoccupazione per i coltivatori in questa regione in crescita importante della patata. Oltre a determinare l'efficacia del portatile PCR per queste malattie importanti, DNA estrazione metodologia e terreno campione dimensione ottimale inoltre sono stati studiati in questo studio.
I risultati indicano che il metodo PCR portatile è versatile e applicabile per la rilevazione di diversi patogeni. Il metodo di rilevamento in loco che abbiamo sviluppato può consentire ai lavoratori di frontline in agricoltura (ad esempio, i coltivatori) per prendere decisioni precedenti per quanto riguarda la gestione della malattia, quali le selezioni di varietà o rotazioni e possibile quantificare un pianta patogeno nel campione durante un'indagine di campo, prima dell'impianto, per evitare potenziali focolai di malattia.

<table><tbody><tr><td>Piastra PCR a guscio bianco</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>CFX Manager</td><td>Bio-Rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Sonde universali Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725280</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Strumento touch qPCR</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1855195</tr><tr><td>Alcool etilico, puro 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo, saturo&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1750I-400</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>q16 Genesig della macchina per PCR in tempo reale</td><td></td><td>MBS486001</td><td></td></tr><tr><td>Sodio ultrapuro dodecil solfato (SDS)</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo (isopropanolo)</td><td>JT Baker</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 36,5-38,0% (HCl)</td><td>JT Baker</td><td>9535-03</td><td></td></tr><tr><td>alcool iso-amilico</td><td>JT Baker</td><td>9038-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rotazione FastDNA.</td><td>MP Biomedicals</td><td>6560-200</td><td>Kit di estrazione del DNA a base di silice #1</td></tr><tr><td>Kit universale Luna One-Step RT-qPCR</td><td>New England Biolabs</td><td>E3005S</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR individuali a basso profilo da 0,1 ml</td><td>Phenix Research</td><td>MPC-100LP</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione facile del DNA/RNA&nbsp;</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-EK</td><td></td></tr><tr><td>genesig Easy 1.5 mL provette</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnetico per provette</td><td>Primerdesign</td><td>genesigEASY-MR</td><td></td></tr><tr><td>Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit</td><td>Primerdesign</td><td>Path-S.subterranea-EASY</td><td></td></tr><tr><td>Hexedyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pestelli a pellet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNA Miniprep&nbsp;</td><td>ZymoBIOMICS</td><td>D4300</td><td>Kit di estrazione del DNA a base di silice #2</td></tr></tbody></table>

rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema pcr in tempo reale portatile

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

In loco diagnosi delle malattie delle piante può essere un utile strumento per i coltivatori per decisioni tempestive che consente l'implementazione precedente di strategie di gestione di malattia che riducono l'impatto della malattia. Attualmente in molti laboratori diagnostici, la reazione a catena della polimerasi (PCR), in particolare Real-Time PCR, è considerato il più sensibile e preciso metodo per il rilevamento del patogeno di pianta. Tuttavia, basato su laboratorio PCRs in genere richiedono costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato. In questo studio, patogeni terricoli di patate vengono utilizzati per illustrare il potenziale per rilevazione molecolare in loco. Questo è stato ottenuto utilizzando un protocollo semplice e rapido composto da estrazione di acidi nucleici magnetico della perlina-basato, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay). L'approccio PCR in tempo reale portatile rispetto favorevolmente con un sistema basato su laboratorio, rilevare da un minimo di 100 copie del DNA da Spongospora subterranea. Il metodo PCR in tempo reale portatile sviluppato qui può servire come un'alternativa ad approcci basati su laboratorio e un utile strumento in loco per la diagnosi del patogeno.

Confronto tra metodi di estrazione del DNA
Rilevando la quantità di DNA S. subterranea in un campione di terreno da campi infestati con l'agente patogeno è stata valutata la compatibilità di un metodo di estrazione del DNA basato su tallone magnetico con PCR in tempo reale. Come mostrato in supplementare nella figura 1, il metodo magnetico basato su tallone è stato confrontato con altri metodi compresi un CTAB-fenolo-cloroformio basato su metodo18, rapido DNA mini-preparazione metodi19,20e altri standard a base di silice le kit di estrazione del DNA. Campioni di DNA estratti utilizzando i sei diversi metodi sono stati sottoposti a PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale. I risultati hanno indicato che il metodo basato su tallone magnetico è paragonabile con altri metodi, anche se a base di silice kit di estrazione del DNA ha mostrato la migliore performance tra i metodi che abbiamo testato. Tutti i kit contengono tiocianato di guanidinium o cloridrato di guanidinium: entrambi sono agenti caotropici potente, che denaturano la maggior parte delle proteine cellulari compreso RNAsi e dnasi. Pertanto, utilizzando i metodi è adatto per le estrazioni di DNA e di RNA.
Confronto tra un portatile PCR in tempo reale e una PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale
Per confrontare la sensibilità e la specificità di una PCR portatile per una PCR convenzionale di lab-basata, quantificazione assoluta dell'agente patogeno che DNA è stato effettuato usando diverse quantità del gene S. subterranea ITS, che è stato trasportato dal vettore pGEM-T21 . Una serie di diluizioni di 10 volte del gene di ITS (106 a 100 copie) sono stati analizzati utilizzando il set di primer/sonda SsTQ22. I risultati hanno dimostrato che il metodo PCR portatile rilevato l'agente patogeno bersaglio del DNA (~ 100 copie), anche se la sensibilità era 10 volte inferiore a quello che del metodo PCR basati su laboratorio convenzionale, che rilevato almeno 10 copie (Figura 2).
Per ulteriore convalida, terreni artificialmente infestati sono stati testati. Sporosori subterranea S. sono stati ottenuti da Galle di radice polvere scab dalle radici della patata. I terreni erano infestati di sospensioni sporosori ad una concentrazione finale di 105 sporosori/g di peso secco del terreno. Utilizzando il metodo magnetico basato su tallone, DNA è stato Estratto da campioni del terreno infestato, e 10 volte diluizioni seriali sono stati preparati per ottenere concentrazioni equivalenti a 105, 104, 103, 102, 101e 100 sporosori/g di peso del suolo secco. I campioni di DNA sono stati utilizzati per PCR usando il set di primer/sonda SPO23. I risultati hanno mostrato che il metodo PCR portatile ha capacità analitiche paragonabile a un metodo PCR convenzionale basato su laboratorio ma, ancora una volta, la sensibilità è stata ridotta di un fattore pari a ~ 10 (Figura 3).
Infine, abbiamo testato un campione di terreno da un campo che è stato naturalmente contaminato con S. subterranea. L'estrazione di DNA basato su tallone magnetica è stata effettuata su diverse quantità di terreni (10, 20, 50 e 100 mg di terreno a 500 µ l di soluzione tampone di estrazione). I risultati hanno indicato che il peso ottimale del suolo come materiale di partenza per l'estrazione di DNA era di 50-100 mg (Figura 4). Quantità di terreno di fuori della gamma ha provocato un errore dei passi PCR a valle. Questo effetto potrebbe essere perché quando una quantità eccessiva di terreno vengono utilizzata come materiale di partenza, contaminazioni (ad esempio, i composti fenolici) possono interferire con la PCR24. Nel caso di volumi inferiori del suolo, la quantità di DNA estratto può essere inferiore al limite di rilevazione di PCR (ad esempio, il rendimento totale è stato variato il DNA estratto dal suolo di 10-20 mg). La sensibilità era abbastanza paragonabile tra la PCR portatile e convenzionali metodi di PCR. Risultati simili sono stati ottenuti in campioni di DNA dai metodi differenti dell'estrazione (Supplemental figura 2)
Rilevamento di altri agenti patogeni dal sistema di rilevamento in loco usando una PCR in tempo reale portatile
Abbiamo testato il metodo PCR portatile per rilevare altri agenti patogeni importanti patata terricoli, r. solani AG3 e PMTV. In questo studio, abbiamo effettuato la PCR in tempo reale utilizzando la sonda primer/RQP1 set25 RsTq r. solani AG3 rilevazione con DNA da coltura pura. Abbiamo anche effettuato in tempo reale PCR utilizzando PMTV-D primer/sonda set26 rilevazione PMTV con RNA da un campione di tubero sintomatico spraing è stato usato. Come illustrato nella Figura 5, il metodo PCR portatile rilevato con successo entrambi gli agenti patogeni. I risultati erano comparabili fra gli strumenti portatili e convenzionali, suggerendo che il portatile metodo PCR è versatile e applicabile ad altri rilevamenti di agente patogeno se le sequenze dell'iniettore progettate per PCR in tempo reale sono disponibili.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig1.jpg"> Figura 1. Procedura di un sistema PCR in tempo reale portatile per rilevamento del patogeno in loco. Il protocollo è composto da passaggi nell'ordine seguente: preparazione del lysate di omogeneizzazione breve (A), estrazione di acidi nucleici magnetico della perlina-base (B), PCR in tempo reale portatile (C) e analisi quantitativa dei dati utilizzando un computer portatile (D). Si noti che tutti i passaggi possono essere completati in loco.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig2v2.jpg"> Figura 2 . Confronto della sensibilità tra un portatile PCR e una PCR convenzionale basato su lab. Quantificazione dell'agente patogeno del DNA è stata effettuata usando diverse quantità del gene di ITS S. subterranea (106 a 100 copie) con la SsTQ primer/sonda impostata. Regressione lineare tra il valore di registro di DNA del plasmide S. subterranea e valore reciproco di Log di Cq sul termociclatore convenzionale (A) e il termociclatore portatile (B). <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig3v2.jpg"> Figura 3 . Confronto delle prestazioni di rilevamento in terreni artificialmente infestati con subterranea di S.. I terreni erano artificialmente infestati (105 a0 sporosori/10g peso del suolo secco) con S. subterranea sporosori sospensioni. Utilizzando il metodo magnetico basato su tallone, il DNA è stato Estratto da campioni del terreno infestato. PCRs sono stati eseguiti utilizzando i campioni del terreno con il set di primer/sonda SPO. Regressione lineare tra il valore di registro della quantità iniziale in sporosori per grammo di terreno e il valore di registro reciproco di Cq sul termociclatore convenzionale (A) e il termociclatore portatile (B). <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig4v2.jpg"> Figura 4 . Confronto di avviamento quantità di campioni di suolo per estrazione del DNA. Il metodo basato su tallone magnetico è stato utilizzato per l'estrazione di DNA da 10, 20, 50 e 100 mg di campioni di terreno. PCR in tempo reale sono stati eseguiti utilizzando il termociclatore portatile. Le curve standard rappresentano il rapporto tra la quantità di DNA totale Estratto da campioni di suolo (asse x) e le quantità di prodotto di PCR (asse y) amplificate dal set di primer/sonda Sss. <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig5.jpg"> Figura 5 . Rilevamento di altri agenti patogeni della patata, r. solani e PMTV. PCR in tempo reale sono stati eseguiti utilizzando il termociclatore portatile e il termociclatore convenzionali. R. solani AG3 è stata rilevata in DNA totale Estratto da coltura pura mediante RsTq primer e la sonda di RQP1 (A) PMTV è stato rilevato in RNA totale Estratto da un campione di tubero PMTV-infettato tramite che il primer PMTV-D/sonda impostata (B). <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56891/56891fig6.jpg"> Figura 6 . Una pipeline di diagnostica per fitopatogeni. Diagramma di flusso Mostra un flusso di lavoro generale per la diagnosi di phytopathogen. Si noti che il passo tradizionale, ad esempio, identificazione visiva, può essere omesso se è utilizzata in loco rilevazione molecolare, che rende l'intero processo di diagnosi semplice e veloce. <a href="/files/ftp_upload/56891/56891fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>PCR in tempo reale portatile</td>
			<td>PCR in tempo reale</td>
			<td>LAMPADA</td>
			<td>ELISA</td>
			<td>Flusso laterale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Costo per reazione target</td>
			<td>$0,60-$8,47</td>
			<td>$0,60</td>
			<td>$0,75</td>
			<td>$0,60</td>
			<td>$4,74</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità</td>
			<td>100 copie</td>
			<td>10 copie</td>
			<td>10 copie</td>
			<td>1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (proteina)33
</td>
			<td>1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spesa di tempo</td>
			<td>90 minuti</td>
			<td>80-240 minuti</td>
			<td>50-90 minuti32
</td>
			<td>3-24 ore</td>
			<td>10-15 minuti</td>
		</tr>
<tr>
<td>Preparazione necessaria</td>
			<td>Estrazione acido ●Nucleic Disegno dell'iniettore di ●</td>
			<td>Estrazione acido ●Nucleic Disegno di Primer/sonda ●</td>
			<td>Estrazione di acido nucleico ● Disegno dell'iniettore di ●</td>
			<td>Estrazione di proteine ● ● gli anticorpi</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Altri materiali richiesti</td>
			<td>● thermocycler portatile</td>
			<td>● thermocycler convenzionale</td>
			<td>Macchia di Colormetric ● ● Incubatore</td>
			<td>Lettore di piastre ● Attrezzatura di lavaggio del ●</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Tabella comparativa dei metodi di rilevazione sierologica e molecolare per fitopatogeni
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza (5 '-3 ')un
</td>
			<td>Obiettivob
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SsTQ-F13
</td>
			<td colspan="2">CCGGCAGACCCAAAACC</td>
			<td>ITS1-ITS2 in S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SsTQ-R13
</td>
			<td colspan="2">CGGGCGTCACCCTTCA</td>
			<td>ITS1-ITS2 in S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SsTQ-P13
</td>
			<td colspan="2">[FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM]</td>
			<td>ITS1-ITS2 in S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genesig S.subterranea primer/sonda</td>
			<td colspan="2">N/A</td>
			<td>Actina in S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPO1014
</td>
			<td colspan="2">GGTCGGTCCATGGCTTGA</td>
			<td>ITS a S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPO1114
</td>
			<td colspan="2">GGCACGCCAATGGTTAGAGA</td>
			<td>ITS a S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPOPRO114
</td>
			<td colspan="2">[FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM]</td>
			<td>ITS a S. subterranea
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RsTqF119
</td>
			<td colspan="2">AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT</td>
			<td>ITS1-ITS2 in r. solani
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RsTqR119
</td>
			<td colspan="2">AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT</td>
			<td>ITS1-ITS2 in r. solani
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RQP119
</td>
			<td colspan="2">[FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM]</td>
			<td>ITS1-ITS2 in r. solani
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genesig PMTV primer/sonda</td>
			<td colspan="2">N/A</td>
			<td>CP-RT in PMTV</td>
		</tr>
<tr>
<td>PMTV-D-F20
</td>
			<td colspan="2">AGAATTGRCATCGAAACAGCA</td>
			<td>CP in PMTV</td>
		</tr>
<tr>
<td>PMTV-D-R20
</td>
			<td colspan="2">GTCGCGCTCCAATTTCGTT</td>
			<td>CP in PMTV</td>
		</tr>
<tr>
<td>PMTV-D-P20
</td>
			<td colspan="2">[FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM]</td>
			<td>CP in PMTV</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
un Primer oligo DNA sono stati modificati con FAM (6-carboxyfluorescein) o TAM (5-carboxytetramethylrhodamine)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">
b ITS: Interni trascritti distanziali, CP: cappotto della proteina; CP-RT: cappotto della proteina readthrough</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Primer usati in questo studio
Complementare figura 1. Confronto tra i metodi di estrazione del DNA per il rilevamento del patogeno farinosa scab. Sei diversi metodi di estrazione del DNA (A-F) sono stati confrontati per la rilevazione dell'agente patogeno farinosa scab, S. subterranea nei campioni di terreno. (B, D, F). DNA è stato estratto utilizzando a base di silice kit #1 (Vedi la tabella materiali per tutti i nomi di kit), a base di silice kit #2 e magnetico kit basati su tallone, repsectively. PCR è stata effettuata utilizzando le convenzionali basati su laboratorio PCR termociclatore. Le curve standard rappresentano il rapporto tra la quantità di DNA totale estratto dai campioni del terreno e la quantità del prodotto PCR amplificato dal set di primer/sonda SsTQ. <a href="/files/ftp_upload/56891/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Complementare nella figura 2. Confronto tra il limite di rilevamento tra un portatile PCR e una PCR convenzionale basato su lab. DNA totale è stato isolato da un campione di terreno utilizzando tre metodi di estrazione differenti: (metodo A, B) Doyle, (C, D) a base di silice kit #2 e (E, F) il kit magnetico basato sul tallone. Grafici riportati a sinistra dati utilizza il termociclatore portatile con il set di primer/sonda Sss, mentre i grafici sulla destra rappresentano dati generati utilizzando il termociclatore convenzionali basate su laboratori con la SsTQ primer/sonda impostata. <a href="/files/ftp_upload/56891/Supplementary_Figure_2.pdf" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questa figura.</a>

Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Ciao, mi chiamo Joseph DeShields, lavoro presso il Dipartimento di Patologia Vegetale della Washington State University e oggi vi mostrerò un protocollo di rilevamento in loco per rilevare le malattie trasmesse dal suolo nel suolo. La diagnosi in loco delle malattie delle piante sul campo è fondamentale per un'efficace gestione delle malattie e può ridurre la diffusione secondaria di agenti patogeni sul campo. I patogeni trasmessi dal suolo sono particolarmente difficili da diagnosticare a causa degli ambienti del suolo ampi e complessi e questo può rendere difficile la comprensione delle malattie trasmesse dal suolo. La reazione a catena della polimerasi, altrimenti nota come PCR, è attualmente l'approccio sensibile e accurato più ampiamente accettato per rilevare i patogeni delle piante sul campo. Il seguente protocollo dimostra un metodo sensibile e in loco per rilevare i patogeni presenti nel suolo composto da un'estrazione del DNA basata su biglie magnetiche, PCR, che può essere eseguita utilizzando uno strumento PCR portatile, e l'analisi dei dati, che può essere eseguita in remoto, utilizzando un computer portatile. Estrazione del DNA basata su biglie magnetiche. Il kit per l'estrazione del DNA e dell'RNA è stato preparato e utilizzato secondo le istruzioni del produttore con lievi modifiche. Tutti i reagenti sono stati conservati a temperatura ambiente e la proteinasi K preparata è stata conservata a 20

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La progettazione di un semplice schema di un giorno di workflow per la diagnostica dei patogeni batterici permette il rapido riconoscimento di infezioni del sangue. L'inclusione di otto obiettivi clinicamente rilevanti batteriche ed i loro profili di resistenza agli antibiotici offre al medico una prima idea il giorno stesso, che può portare ad una terapia più adeguata.

Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Un test qPCR è stato sviluppato per il rilevamento di Escherichia coli O157: H7 mira un marcatore genetico unico, Z3276. La qPCR è stato combinato con propidio monoazide (PMA) Trattamento per il rilevamento di cellule vive. Questo protocollo è stato modificato e adattato ad un formato piastra a 96 pozzetti per maneggevolezza e coerente di numerosi campioni...

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Presentato qui è un protocollo per l'identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile. Questo protocollo facile da eseguire è ideale come metodo per confermare l'identità di una specie botanica in luoghi in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato, come aziende agricole e magazzini.

Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Per facilitare la rilevazione rapida e precisa di Acinetobacter baumannii, presentiamo un protocollo che impiega l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) in combinazione con l'endonucleasi LbaCas12a per identificare le infezioni da A. baumannii.

Rilevamento rapido e specifico delle infezioni da Acinetobacter baumannii utilizzando un sistema basato su amplificazione della polimerasi ricombinasi/Cas12a

In questo protocollo, viene illustrato un saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinasi CRISPR/Cas12a per la rilevazione del patogeno invasivo delle piante, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinata CRISPR/Cas12a per il rilevamento di Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Forme affidabili e accurate di analisi del DNA dispiegabile sul campo sono fondamentali per molti settori. Questo articolo offre due metodi per l'analisi microbica ambientale sul campo: 1) l'isolamento del DNA microbico da campioni ambientali utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo, e 2) l'analisi del DNA tramite l'unità qPCR di campo.

Analisi del DNA microbico sul campo utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo e un'unità qPCR sul campo

Scopri un metodo di rilevamento in loco dei fitopatogeni terricoli mediante PCR in tempo reale portatile. Questo protocollo consente una diagnosi rapida sul campo per una gestione efficace delle malattie delle piante.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

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