Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile
23 febbraio 2018
Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.
Ciao, mi chiamo Joseph DeShields, lavoro presso il Dipartimento di Patologia Vegetale della Washington State University e oggi vi mostrerò un protocollo di rilevamento in loco per rilevare le malattie trasmesse dal suolo nel suolo. La diagnosi in loco delle malattie delle piante sul campo è fondamentale per un'efficace gestione delle malattie e può ridurre la diffusione secondaria di agenti patogeni sul campo. I patogeni trasmessi dal suolo sono particolarmente difficili da diagnosticare a causa degli ambienti del suolo ampi e complessi e questo può rendere difficile la comprensione delle malattie trasmesse dal suolo. La reazione a catena della polimerasi, altrimenti nota come PCR, è attualmente l'approccio sensibile e accurato più ampiamente accettato per rilevare i patogeni delle piante sul campo. Il seguente protocollo dimostra un metodo sensibile e in loco per rilevare i patogeni presenti nel suolo composto da un'estrazione del DNA basata su biglie magnetiche, PCR, che può essere eseguita utilizzando uno strumento PCR portatile, e l'analisi dei dati, che può essere eseguita in remoto, utilizzando un computer portatile. Estrazione del DNA basata su biglie magnetiche. Il kit per l'estrazione del DNA e dell'RNA è stato preparato e utilizzato secondo le istruzioni del produttore con lievi modifiche. Tutti i reagenti sono stati conservati a temperatura ambiente e la proteinasi K preparata è stata conservata a 20
Panoramica
Questo articolo presenta un sistema portatile di rilevamento PCR in tempo reale per la diagnosi in loco di patogeni vegetali trasmessi dal suolo. Un rilevamento rapido è essenziale per una gestione efficace delle malattie e per prevenire la diffusione di patologie vegetali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Patologia Vegetale
- Microbiologia del Suolo
- Diagnostica sul Campo
Sfondo
- I patogeni del suolo sono difficili da diagnosticare a causa dell'ambiente complesso del suolo.
- La diagnosi in loco è fondamentale per gestire efficacemente le malattie delle piante.
- La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo ampiamente accettato per il rilevamento dei patogeni.
- I sistemi PCR portatili consentono diagnosi basate sul campo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo sensibile e accurato per la rilevazione di patogeni presenti nel suolo.
- Dimostrare l'utilizzo di un sistema PCR portatile per la diagnosi in loco.
- Ridurre la diffusione secondaria di patogeni negli ambienti agricoli.
Metodi Utilizzati
- Estrazione del DNA basata su microsferette magnetiche.
- PCR in tempo reale per il rilevamento di patogeni.
- Utilizzo di uno strumento PCR portatile per l'analisi in campo.
- Analisi dei dati a distanza mediante un computer portatile.
Risultati principali
- Il metodo sviluppato consente un rilevamento rapido dei patogeni presenti nel suolo.
- Le condizioni di campo possono essere gestite efficacemente utilizzando questo sistema portatile.
- La diagnosi in loco può prevenire un'ulteriore produzione di inocolo.
- Il protocollo è adattabile a diversi ambienti edafici.
Conclusioni
- Il sistema PCR portatile migliora la capacità di diagnosticare patogeni del suolo in campo.
- Un rilevamento rapido e accurato è essenziale per una gestione efficace delle malattie.
- Questo metodo può contribuire in modo significativo alla riduzione della diffusione delle malattie delle piante.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento rapido in loco di patogeni del suolo consente un intervento tempestivo nei processi biotecnologici agricoli, riducendo la perdita di raccolti e sostenendo strategie di gestione predittiva delle malattie. I dispositivi diagnostici molecolari portatili collegano il campionamento sul campo alla validazione in laboratorio, accelerando il processo decisionale nello sviluppo precoce di agrochimici e biopesticidi. Questo approccio migliora la validazione degli obiettivi negli studi sulle interazioni pianta-patogeno fornendo dati quantificabili e riproducibili sul carico patogeno direttamente da matrici ambientali complesse.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale dei fattori di virulenza dei patogeni mediante rilevamento quantitativo di copie di DNA nel suolo.
- Valore operativo: Supporta la verifica delle ipotesi nei flussi di lavoro di validazione dei bersagli fornendo una quantificazione riproducibile dei patogeni da campioni raccolti sul campo.
- Valore predittivo: Genera dati di risposta alla dose per lo screening di composti antimicrobici o in grado di superare la resistenza, in condizioni ambientali realistiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: L'estrazione degli acidi nucleici basata su microsferette magnetiche fornisce una preparazione del campione standardizzata e resistente agli inibitori per il rilevamento ad alto rendimento di agenti patogeni.
- Output quantitativo: La PCR in tempo reale basata su sonde fluorogeniche fornisce valori di Ct che permettono la determinazione del limite di rilevabilità (fino a 100 copie) per l'ottimizzazione del saggio.
- Trasferibilità della piattaforma: La compatibilità del protocollo con strumenti portatili supporta flussi di lavoro di screening decentralizzati in siti sperimentali geograficamente diversi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Sistema Rilevante per la Malattia: Utilizza Spongospora subterranea in matrici di suolo per modellare le sfide reali della rilevazione di patogeni nelle colture di tuberi.
- Continuità Translazionale: Collega lo sviluppo di saggi in laboratorio a diagnosi utilizzabili sul campo, riducendo il rischio di traduzione nella biotecnologia agricola.
- De-risking Meccanicistico: Permette il monitoraggio della dinamica del carico patogeno per valutare il meccanismo d'azione di biologici o protettori chimici applicati al suolo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla traduzione, consentendo la quantificazione precoce di patogeni nella validazione di bersagli, supportando la standardizzazione di saggi nella selezione e fornendo informazioni per decisioni di proseguimento/cessazione nello sviluppo preclinico di agenti per la protezione delle colture.
- Biologia della scoperta: Permette l'analisi guidata da ipotesi delle interazioni tra patogeni e ospiti attraverso la quantificazione precisa del DNA bersaglio in ambienti naturali del suolo.
- Screening: Fornisce risultati standardizzati e quantitativi di rilevamento dei patogeni, adatti alla valutazione di librerie di composti in saggi basati sul suolo.
- Analisi: Genera valori di Ct e curve di amplificazione riproducibili, che consentono il confronto statistico degli effetti dei trattamenti in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dagli saggi in laboratorio controllati a studi di validazione sul campo, mantenendo le prestazioni del saggio attraverso diversi tipi di campioni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma portatile e riproducibile per il rilevamento dei patogeni, applicabile a diversi sistemi coltura-patogeno nelle reti globali di ricerca e sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi su piante e patogeni fornendo misurazioni accurate e validate sul campo del carico patogeno.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità del rilevamento dei patogeni in diversi siti di campo attraverso protocolli standardizzati di estrazione e amplificazione.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi precoci di protezione delle colture riducendo i tassi di falsi negativi nel rilevamento dei patogeni.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati principali adeguata al rischio, basata sull'efficacia dimostrata in condizioni reali di pressione patogena.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in diagnostica molecolare e patologia vegetale per la progettazione e l'interpretazione dei saggi.
- È subordinato all'accesso a strumenti portatili di PCR in tempo reale e a set di sonde fluorogeniche compatibili.
- Necessita di una standardizzazione delle procedure di raccolta ed elaborazione dei campioni tra i diversi siti di campionamento per garantire la comparabilità dei dati.
- Deve tenere conto degli inibitori della PCR derivanti dal suolo, attraverso la validazione dell'efficienza di estrazione basata su microsferette magnetiche nelle matrici bersaglio.
- È limitato alla rilevazione basata sugli acidi nucleici; non valuta la vitalità o l'infettività del patogeno senza saggi complementari.
