Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di testare gli effetti di diversi composti sugli organismi modello C.elegans in un saggio ad alto rendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica, della biologia e dell'invecchiamento, ad esempio strutture chimiche specifiche prolungano la durata della vita di C.elegans? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo screening di numerosi composti in modo rapido ed efficiente in termini di tempo.

Per preparare piastre di coltura di massa per la produzione di un gran numero di vermi, in una cappa a flusso laminare, erogare prima 30 millilitri di agar del terreno di crescita dei nematodi a 60 gradi Celsius su piastre di coltura da 10 centimetri per la solidificazione notturna. La mattina successiva, aggiungere due millilitri di E.coli concentrato su ciascuna piastra, inclinando e ruotando la piastra per diffondere completamente i batteri sulla superficie della piastra. Quando le piastre di coltura di massa si sono asciugate, conservarle a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.

Per preparare le piastre di coltura per saggi ad alta produttività per lo screening, utilizzare un dispenser automatizzato a otto canali per aggiungere 0,15 millilitri di agar del terreno di crescita dei nematodi fusi in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Lasciare solidificare l'agar per una notte. Quindi conservare le piastre di analisi ad alta produttività a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.

Per impostare le colture di C. elegans, utilizzare un vermicompost e un microscopio da dissezione per trasferire 20 uova su ciascuna piastra di coltura di massa e incubare le piastre a 20 gradi Celsius per sei giorni. Il settimo giorno, utilizzare un microscopio da dissezione per confermare visivamente la presenza di ovuli nell'utero. Per raccogliere gli adulti gravidi, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere da due a tre millilitri di soluzione basale di S per piastra e far roteare le soluzioni attorno a ciascuna piastra a mano.

Utilizzare la pipetta di vetro per trasferire i vermi in una provetta da 15 millilitri e pellettare i vermi mediante centrifugazione. Risospendere i vermi in 10 millilitri di soluzione di ipoclorito e agitare rapidamente i tubi su e giù per cinque secondi. Quindi, incubare i vermi per cinque minuti a temperatura ambiente agitando ogni 2,5 minuti.

Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente i vermi. I pellet dovrebbero essere di colore marrone giallastro. Sostituire i surnatanti con 10 millilitri di soluzione fresca di ipoclorito e agitare nuovamente energicamente il tubo.

Incubare i vermi per altri uno o tre minuti agitando di tanto in tanto. Quando rimangono solo gli ovuli, centrifugare le provette e aspirare i surnatanti. I pellet devono essere bianchi senza colorazione marrone.

Utilizzando una tecnica sterile, aprire le provette in una cappa a flusso laminare sterile e aggiungere 14 millilitri di soluzione basale S a ciascun pellet. Lavare il pellet tre volte con 14 millilitri di S Basal. Dopo tre lavaggi per centrifugazione, sospendete nuovamente le uova in due o tre millilitri di soluzione basale S fresca.

Per preparare C.elegans larvali allo stadio L1, trasferire i surnatanti in una capsula di Petri di vetro sterile per provetta e utilizzare due o tre millilitri di soluzione basale S per sciacquare le uova rimanenti dalle provette in ciascuna piastra. Aggiungere cinque millilitri di soluzione basale S a ciascun piatto per facilitare l'affollamento e posizionare il piatto su uno shaker orbitale a 20 gradi Celsius e 20 giri/min per 16-24 ore per favorire la schiusa. Tutti i piccoli si arresteranno al primo stadio larvale a causa della mancanza di cibo.

Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le larve L1 in una provetta da 15 millilitri per la loro centrifugazione. Dopo che tutti gli L1 schizzati sono stati consolidati attraverso ripetute centrifugazioni e aspirazioni, risospendere il pellet di larva con 10 millilitri di soluzione basale S sterile. Quindi, trasferire 10 microlitri su una piastra senza semi e contare il numero di larve presenti sulla piastra.

Ripeti l'operazione 10 volte per ottenere la densità media di L1 nella tua soluzione. Con una pipetta sierologica sterile, determinare il volume totale della soluzione contenente gli L1. Quindi, utilizzare il volume della soluzione di L1 e la densità di L1 nella soluzione per calcolare il numero totale di L1 presenti nella soluzione.

Per preparare i vermi in una piastra di saggio ad alta produttività da 96 pozzetti, diluire la sospensione L1 a una larva L1 per microlitro in un flacone sterile e rotondo, dotato di una barra di agitazione a rotazione moderatamente lenta e lasciare che le piastre di saggio si riscaldino a temperatura ambiente. Successivamente, in una cappa a flusso laminare, aggiungere cinque microlitri di E.coli concentrato a ciascun pozzetto, seguiti da 10 microlitri di sospensione L1 per pozzetto per ottenere una media di 10 vermi per pozzetto. Quando tutti i vermi sono stati placcati, copri le piastre e incuba i vermi per due giorni a 25 gradi Celsius, per consentire alle larve di svilupparsi in adulti.

Al termine dell'incubazione, portare le piastre della libreria chimica a temperatura ambiente dal congelamento. Agitare delicatamente le piastre scongelate a 60 giri/min su un agitatore per micropiastre per un minuto immediatamente prima dell'uso. Utilizzando un manipolatore automatico di liquidi a 96 pozzetti, trasferire 0,75 microlitri di composto dalla piastra della libreria alla piastra del saggio.

Quando tutti i pozzetti sono stati trattati, asciugare all'aria il composto dalla superficie delle piastre in una cabina a flusso laminare per quattro-otto ore, rimuovendo le singole piastre non appena sono asciutte. Sigillare i piatti asciutti con pellicola trasparente e coprirli. Quindi centrifugare le piastre per 45 secondi a 1000 G e conservarle in posizione capovolta a 25 gradi Celsius.

Per testare le risposte di C. elegans ai composti di interesse, è possibile utilizzare una piastra di controllo negativa per valutare la sopravvivenza totale fino a quando il 95% degli animali di controllo non è morto, a quel punto è possibile valutare tutte le piastre di prova. Ad esempio, in questo studio, sono stati osservati 57 risultati dalla libreria di retest di 179 composti, dimostrando che il 32% delle sostanze chimiche di retest è risultato positivo in totale. Il binning dei punteggi medi della percentuale di vita per i pozzetti di controllo e di prova negativi ha indicato che i pozzetti di prova hanno sovraperformato i pozzetti di controllo.

Possono essere eseguiti anche screening su piccola scala, come dimostrato in questo test rappresentativo in cui sono state utilizzate concentrazioni di 50 micromolari e 100 micromolari del composto in esame. La rivalutazione di queste piastre di test per piccoli schermi quando più del 99% degli animali trattati con controllo negativo era morto, ha indicato che i pozzetti di controllo positivi hanno superato di gran lunga i pozzetti di controllo negativo e i pozzetti di test in quanto i pozzetti di test hanno ottenuto risultati leggermente migliori rispetto ai controlli negativi. In questo esperimento, quest'ultimo risultato è stato influenzato dall'indicazione che molti dei pozzetti di prova sembravano mostrare tossicità rispetto al trattamento di controllo, confondendo così questa semplice interpretazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due o quattro settimane se eseguita correttamente. Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere l'integrità delle piastre del test, assicurandosi che siano immacolate prima di essere utilizzate. Seguendo questa tecnica, è possibile rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: quale di questi composti induce la mitofagia?

Per un test di miofagia, verrebbe utilizzato un filamento reporter di miofagia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire uno screening chimico ad alto rendimento utilizzando C.elegans come organismo modello.