Etichettatura metabolica e profilatura di RNA di trasferimento utilizzando Macroarrays

Descriviamo un'originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l'osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare simultaneamente i livelli cellulari di tutti gli RNA di trasferimento in campioni biologici combinando la marcatura metabolica in vivo con l'analisi di macroarray. Gli RNA di trasferimento sono stati a lungo considerati come molecole di mantenimento prive di funzioni regolatorie. Tuttavia, un numero crescente di prove indica che i livelli cellulari di tRNA fluttuano in risposta a condizioni variabili come il tipo di cellula, l'ambiente e lo stress.

La fluttuazione dell'espressione del tRNA influenza direttamente la traduzione genica, favorendo o reprimendo l'espressione di particolari proteine. La comprensione delle dinamiche della sintesi proteica richiede metodi in grado di fornire profili di tRNA di alta qualità. Presentiamo qui una tecnica affidabile e semplice che consente una quantificazione rapida e precisa dei livelli di RNA di trasferimento negli organismi coltivati in laboratorio.

Per iniziare, con un ago calibro 18, posizionare un singolo foro al centro del tappo di una provetta sterile per microcentrifuga da 1,5 millilitri per consentire una corretta aerazione. Quindi, con cinque microlitri di Mycobacterium smegmatis da una coltura starter notturna, inoculare 500 microlitri di brodo sterile 7H9 integrato. Seguendo le pratiche standard di radioprotezione, aggiungere al terreno di coltura 20 microcurie per millilitro di ortofosfato marcato con fosforo-32.

Coltiva i batteri a 37 gradi Celsius e 1.200 giri/min, in un incubatore shaker posizionato dietro uno scudo acrilico di nove millimetri di spessore. A metà della fase logaritmica, trasferire l'intera coltura in una provetta da due millilitri con tappo a vite e pellettare i batteri radioattivi a temperatura ambiente centrifugando a 10.000 volte la gravità per due minuti. Raccogliere il surnatante contenente ortofosfato radioattivo non incorporato in un contenitore per rifiuti appropriato.

Per preparare l'RNA totale, aggiungere al pellet un millilitro di reagente per l'estrazione dell'RNA commerciale e circa 200 microlitri di perle di vetro. Tappare saldamente il tubo e disgregare i batteri in un omogeneizzatore alla massima agitazione per due minuti. Centrifugare il campione a 12.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, trasferire il surnatante in un nuovo tubo da due millilitri e scartare opportunamente le perline. Aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio e agitare energicamente il tubo a mano per 15 secondi. Quindi, centrifugare il campione a 12.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Raccogliere la fase acquosa del campione in una nuova provetta inclinando la provetta a 45 gradi. Evitare di disegnare l'interfase o lo strato organico. Aggiungere due microlitri di precipitante colorato e 0,5 millilitri di isopropanolo al 100% alla fase acquosa.

Agitare energicamente la provetta a mano per cinque secondi e centrifugare di nuovo. Rimuovere il surnatante dalla provetta e gettarlo in modo appropriato, poiché la frazione liquida può contenere tracce di radioattività. Quindi, dopo aver asciugato il pellet all'aria per cinque minuti, risospenderlo in 200 microlitri di 2X SSC con 0,1% in peso per volume SDS.

Utilizzando il database genomico di tRNA, è possibile progettare sonde di DNA recuperando prima sequenze di tRNA o geni codificanti per tRNA. Dopo il trimming conservato di CCA a tre estremità prime se codificati e aver generato il complemento inverso, ordinare le sonde in base ai primi 70 nucleotidi. Per eseguire la stampa dell'array, scongelare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente.

Con una penna diamantata, etichettare i vetrini rivestiti di ammina. Quindi, posizionare le diapositive in un'unità di indicizzazione. Dopo il posizionamento della griglia, immergere con cura i perni del replicatore nei pozzetti.

Esercitando una pressione minima, stampare delicatamente l'array sui vetrini. Continuare a stampare senza pulire l'arrayer fino al termine del blocco A.It richiede un po' di pratica per essere in grado di stampare in modo coerente. Si consiglia di stampare non più di 8-10 array per sessione.

Contare da 10 a 15 minuti per array. È facile perdere traccia della sequenza del modello di stampa, quindi dedica tutta la tua attenzione all'attività e disattiva tutte le distrazioni. Quando sei pronto per passare al blocco successivo, immergi il replicatore in candeggina al 5% e agita delicatamente.

Premere il replicatore su carta assorbente. Quindi, immergi il replicatore in acqua distillata, agita delicatamente e premi sulla carta. Ripetere questo passaggio una volta.

Quindi, immergere il replicatore nell'isopropanolo, agitarlo delicatamente e premerlo nella carta. Asciugare il replicatore sulla ventola per circa 20 secondi prima di passare al blocco successivo della piastra a 96 pozzetti. Continuare con il numero di stampe desiderato.

Quindi, lasciare asciugare le diapositive. Posizionare i vetrini essiccati a faccia in su su una superficie pulita in un reticolante UV a 254 nanometri. Impostare il livello di energia su 999, 990 microjoule per centimetro quadrato, quindi premere start.

Trasferire gli array in 450 millilitri di soluzione bloccante e incubarli a temperatura ambiente su un agitatore magnetico, sotto lenta agitazione per una notte. Lavare i vetrini in 500 millilitri di acqua distillata a temperatura ambiente, due volte per cinque minuti ciascuna. Asciugare i vetrini centrifugandoli in una centrifuga microarray a temperatura ambiente per 10 secondi.

Conservare gli array in un luogo asciutto e buio per un massimo di sei mesi. Prima dell'ibridazione, sciacquare i vetrini in acqua bollente e asciugarli mediante centrifugazione. Posizionare l'array all'interno di una cassetta di ibridazione e caricare il campione di RNA radiomarcato.

Eseguire i campioni su una stazione di ibridazione-lavaggio automatizzata per la massima riproducibilità secondo il protocollo di testo. Al termine della corsa, asciugare i vetrini mediante centrifugazione. Avvolgi i vetrini con plastica sottile.

Quindi, utilizzare un contatore Geiger sulla sua impostazione più sensibile per controllare i vetrini per il segnale radioattivo. Esporre i vetrini su uno schermo al fosforo in una cassetta di esposizione a temperatura ambiente per 10-90 ore a seconda della potenza del segnale. Il tempo di esposizione, che può durare da poche ore a pochi giorni, dipende direttamente dal segnale dell'array.

Ci vuole un po' di pratica per essere in grado di tradurre i conteggi sul contatore Geiger in tempo di esposizione. Scansiona il vetrino con una risoluzione di 50 micrometri utilizzando un phosphorimager. Quantifica e sottrai le intensità di radioattività in ogni punto della sonda utilizzando il software gratuito ImageJ aggiornato con un profilatore di microarray.

Genera mappe di calore secondo il protocollo di testo. Qui sono mostrati macroarray batterici, topini e umani scansionati. Gli array di M.smegmatis utilizzano solo 43 sonde invece delle 48 utilizzate per topi e umani.

Di conseguenza, l'array batterico mostra 40 punti vuoti che si fondono con lo sfondo. Tre repliche biologiche indipendenti mostrano che, nelle condizioni di crescita testate, tutti i tRNA di M. smegmatis sono espressi al di sopra del livello di fondo. In questo particolare esperimento, la deviazione standard osservata per ciascuna sonda è compresa tra il 2% di arginina TCT e il 22% di cisteina GCA con la mediana al 5%Inoltre, questo esperimento mostra che l'espressione degli isoaccettori del tRNA non è uniforme.

Ad esempio, tutti gli isoaccettori dell'alanina sono espressi a livelli simili, mentre i tRNA più alti e più bassi che accettano l'arginina differiscono di tre volte. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 24 ore se viene eseguita correttamente e se il segnale spot è adeguato. Il nostro metodo è applicabile a tutti gli organismi il cui genoma è disponibile per la progettazione di sonde.

Gli organismi modello coltivati in vitro sono i candidati ideali per la marcatura metabolica. Il protocollo qui presentato è ottimizzato per Mycobacterium smegmatis, ma è stato anche utilizzato con successo per profilare il tRNA in E.coli, lievito, topi e cellule umane in coltura. La nostra tecnica è riproducibile e specifica.

La sua ampia gamma dinamica e la soglia facilmente regolabile consentono di profilare specie poco abbondanti, come i tRNA associati ai polisomi, semplicemente prolungando i tempi di esposizione dell'array.