Quantificazione di endogeno dell'auxina e citochinina durante la coltura di internodo di Ipecac

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come cambiano i livelli endogeni di fitormone durante la formazione avventizia dei germogli in ipecac. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla rigenerazione dei tessuti nella ruota di coltura dei tessuti vegetali. Il vantaggio principale di questa tecnica è il livello endogeno dell'acido indolo-3-acetico e le citochinine possono essere semplicemente analizzate con elevata sensibilità.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono a tutta l'instaurazione della degenerazione del tessuto vegetale perché i cambiamenti nel livello endogeno del fitormone innescano la formazione accidentale di germogli. Per iniziare, prepara un terreno B5 privo di fitormoni e aggiungi lo 0,2% di gomma di gellano. Quindi, sterilizzare in autoclave il terreno per sterilizzarlo.

Usando un bisturi chirurgico su una lastra acrilica sterile, affetta segmenti internodali di otto millimetri di piantine di ipecac e posizionali sul terreno. Quindi, coltivare i segmenti di ipecac a 24 gradi Celsius sotto 15 micromoli per metro quadrato secondi di luce in un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore per cinque settimane. Dopo aver coltivato i segmenti di ipecac, identificare le regioni da una a quattro in ciascun segmento.

Una volta alla settimana, usa un microscopio per contare il numero di germogli avventizi in ogni regione. Per prima cosa, posizionare una perlina di zirconia da cinque millimetri in quattro provette da due millilitri. Quindi, utilizzare un bisturi chirurgico su una lastra acrilica sterile per tagliare i segmenti di ipecac nelle regioni da I a IV.Quindi raccogliere otto segmenti da ciascuna regione in una provetta per campioni.

Pesare ciascuno dei campioni e congelarli in azoto liquido. Successivamente, utilizzare un omogeneizzatore a base di perline per frantumare i campioni congelati. Utilizzare un miscelatore a vortice per sospendere i campioni in un millilitro di acetonitrile con 500 picogrammi di ogni standard interno di buoi e CK.

A casa i campioni a quattro gradi Celsius per un'ora. Centrifugare i campioni a 3500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare il pellet in acetale nitrile all'80% con acido acetico all'1%.

Quindi ripetere la centrifugazione e utilizzare una provetta monouso per combinare i surnatanti. Aggiungere 600 microlitri di acqua con l'uno per cento di acido acetico al surnatante combinato. Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare l'acetale nitrile.

Caricare le soluzioni campione in singole cartucce HLB bilanciate. E lavare le cartucce con un millilitro d'acqua con l'uno per cento di acido acetico. Quindi alludere a tutti gli ormoni con due millilitri di acetil nitrile all'80% con acido acetico all'1% in un tubo di vetro.

Utilizzando un concentratore sottovuoto, far evaporare l'acetale nitrile per ottenere l'estratto in acqua con l'uno per cento di acido acetico. Caricare le soluzioni campione in singole cartucce MCX bilanciate e lavare le cartucce con un millilitro d'acqua con acido acetico all'uno percento. Quindi alludere all'IAA in un tubo di vetro, con due millilitri di nitrile acetalico al 30% con acido acetico all'1%.

Quindi lavare le cartucce con due millilitri di nitrile acetalico all'80% con acido acetico all'1%. Quindi, lavare le cartucce con due millilitri di acqua e un millilitro di acqua con il cinque percento di ammoniaca acquosa in una camera di pescaggio. Alludere ai CK in un tubo di vetro con due millilitri di nitrile acetalico al 60% con ammoniaca acquosa al 5% in una camera di pescaggio.

Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare il solvente di ciascuna frazione ormonale. Mescolare i campioni a meno trenta gradi Celsius fino all'analisi LCMSMS. Per prima cosa, sciogliere ogni estratto ormonale in un tubo con 600 microlitri di metanolo.

Quindi trasferire la soluzione in una fiala a recupero totale con collo a vite e utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare il solvente. Sciogliere la frazione IAA in 20 microlitri di nitrile acetalico al 30% e le frazioni CK in 20 microlitri di acqua con acido acetico all'1%. Successivamente, utilizzare un sistema MS a triplo quadrupolo dotato di un sistema HPLC per analizzare i campioni in modalità ioni positivi.

Infine, quantificare l'IAA endogeno nei livelli di CK rispetto a una curva standard del rapporto tra standard di etichetta non marcata e deuterio. In questo protocollo, la citochinina ossidante endogena negli scivoli avventizi è stata misurata tramite LCMSMS per cinque settimane. Alla prima settimana, non si erano formati scivoli avventizi e i primi piccoli scivoli sono apparsi durante la seconda settimana.

Durante la terza e la quarta settimana, il numero di scivoli aumentò soprattutto nei reggenti uno e due. Durante la quinta settimana il numero di scivoli è stato di circa sette nella regione uno e cinque nella regione due. Prima della cultura, il livello IAA era leggermente più alto nella regione uno rispetto alle regioni due, tre e quattro.

Durante la prima settimana, il livello di IAA è aumentato notevolmente nella regione quattro ed è diminuito leggermente nelle regioni uno, due e tre. Dopo cinque settimane di coltura è emerso un gradiente di concentrazione IAA. Con livelli che aumentano dalla regione uno alla regione quattro.

Prima della coltura, c'erano solo tracce della maggior parte dei CK. Alla prima settimana, il livello di tZR è aumentato a 13,8 picogrammi per milligrammo nella regione due. E 18,1 picogrammi per milligrammo nella regione tre.

Al contrario, i livelli di tZ, iP e iPR sono cambiati solo leggermente durante la coltura. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che gli ormoni della parte endogena sono stabili. Dopo che l'uomo si è sviluppato, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della coltura di tessuti vegetali.

Per esplorare la formazione avventizia in altri organismi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'acido endogeno indolo-3-acetico e le citochinine.