Name: Quantificazione di endogeno dellauxina e citochinina durante la coltura di internodo di Ipecac (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Scopri come analizzare i livelli endogeni di auxina e citochinina durante la formazione di germogli avventizi in ipecac con LC-MS/MS. Questo metodo ad alta sensibilità migliora la comprensione della rigenerazione dei tessuti vegetali.

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Siamo grati al signor Akira Murakami del dipartimento di scienze biologiche applicate, Università Toyo e signor Koudai Taniguchi del Gunma Agricultural Technology Center per la loro assistenza tecnica. Siamo anche grati al Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University per i loro suggerimenti. Questo studio è stato sostenuto in parte dal centro di ricerca per la vita e scienze ambientali, Università Toyo.

Nota: Ipecac (c. ipecacuanha) è stato utilizzato in questo studio perché facilita l'analisi dei fitormoni endogeni.
1. crescita condizioni per indurre i germogli avventizi di Ipecac
<ol><li>Preparare privo di fitormoni B5 supporto regolata a pH 5.710e aggiungere 0,2% gellano. Sterilizzare in autoclave.</li>
	<li>Versare 25 mL di terreno sterilizzato nell'autoclave in una piastra Petri sterile (90 mm × 20 mm).</li>
	<li>Tagliare 8 mm segmenti internodale piantine di ipecacuana usando un bisturi chirurgico con una lama n. 22 su una lastra di acrilico sterile di e posto sul supporto (Figura 1).</li>
	<li>Cultura il medium di B5 senza fitormoni a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h per 5 settimane.</li>
	<li>Identificare le aree ho (apicale) IV (basale) in ogni segmento (Figura 1B). Contare il numero di germogli avventizi > 0,3 mm di lunghezza in ogni regione sotto un microscopio una volta a settimana.</li>
</ol>2. estrazione e purificazione di fitormoni
<ol><li>Mettere una perlina di zirconia di 5 mm in ciascuna delle quattro provette 2 mL del campione.</li>
	<li>Tagliare i segmenti in regioni I a IV (ogni 2 mm di lunghezza) usando un bisturi chirurgico su una lastra di acrilico sterile.</li>
	<li>Raccogliere otto segmenti di ciascuna regione in provette separate (10-30 mg di peso fresco).</li>
	<li>Pesare e quindi bloccare i campioni in azoto liquido.</li>
	<li>Schiacciare i campioni congelati utilizzando un omogeneizzatore basati sul tallone.</li>
	<li>Sospendere i campioni schiacciati in 1 mL acetonitrile contenente 500 pg di ogni standard interno di auxina e CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) utilizzando un miscelatore vortex.</li>
	<li>Mantenere a 4 ° C per 1 h, quindi centrifugare a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la pallina in acetonitrile 80% (v/v) contenente acido acetico 1% (v/v). Centrifugare nuovamente a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente. Combinare i surnatanti (da punti 2.7 e 2.8) in un tubo di vetro monouso.</li>
	<li>Aggiungere 600 µ l acqua che contengono l'acido acetico 1% (v/v) per ogni surnatante combinato ed evaporare l'acetonitrile utilizzando un concentratore a vuoto.</li>
	<li>Equilibrare le cartucce di colonna (HLB) idrofilo-lipofilo-bilanciato applicando 1 mL ciascuno di acetonitrile, metanolo e l'acqua contenente acido acetico 1% (v/v).</li>
	<li>Applicare una soluzione di esempio per cartuccia HLB equilibrato.</li>
	<li>Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).</li>
	<li>Eluire tutti gli ormoni con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.</li>
	<li>Evaporare l'acetonitrile nell'eluito per ottenere l'estratto in acqua contenente acido acetico 1% (v/v) utilizzando un concentratore a vuoto. Nota: Non si asciughi completamente.</li>
	<li>Equilibrare le cartucce di colonna di scambio cationico misto, forte (MCX) applicando 1 mL di metanolo, acetonitrile 1 mL, 0,5 mL 0.1 M HCl e 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).</li>
	<li>Applicare una soluzione di esempio per cartuccia MCX equilibrato.</li>
	<li>Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).</li>
	<li>Eluire IAA con 2 mL 30% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.</li>
	<li>Lavare le cartucce con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v).</li>
	<li>Lavare le cartucce con 2 mL di acqua e 1 mL di acqua contenente ammoniaca acquosa 5%.</li>
	<li>Eluire il CKs con acetonitrile 60% (v/v) di 2 mL contenente ammoniaca acquosa al 5% in un tubo di vetro.</li>
	<li>Far evaporare il solvente di ogni frazione di ormone utilizzando un concentratore a vuoto e conservare a − 30 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.</li>
</ol>3. LC-MS/MS analisi di IAA e CKs
<ol><li>Sciogliere ogni ormone Estratto in una provetta con 600 µ l di metanolo e trasferire la soluzione in un flaconcino di recupero totale del collo a vite. Far evaporare il solvente utilizzando un concentratore a vuoto.</li>
	<li>Sciogliere la frazione di IAA in 20 µ l 30% (v/v) acetonitrile e le frazioni CK in acqua di 20 µ l contenente acido acetico 1% (v/v) in vite collo recupero totale fiale.</li>
	<li>Analizzare i campioni in modalità ioni positivi su un sistema di MS triplo quadrupolo equipaggiato con un sistema HPLC. Nota: Impostiamo le condizioni HPLC come elencato nella tabella 1.<ol>
<li>Per l'eluizione di IAA, usare un gradiente binario di 5% - 50% solvente B in 7 minuti, quindi aumentare di 98% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a solvente B al 5% per iniezione di nido.</li>
		<li>Per l'eluizione di CK, usare un gradiente binario di 2% - 40% solvente B in 5 minuti, 40% - 70% solvente B in 7 min, poi aumentare da 95% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a 2% solvente B di iniezione del nido.</li>
		<li>Impostare l'ionizzazione electrospray (ESI)-MS parametri di sorgente di ioni come elencato nella tabella 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la reazione più monitoraggio transizione (MRM) per la quantificazione di ciascun analita riportato nella tabella 3.</li>
	<li>Quantificare i livelli endogeni di IAA e CK contro una curva standard del rapporto di adenoide deuterio-etichetta standard.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
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<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
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<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Per identificare la distribuzione dei fitormoni coinvolti nell'organogenesi, è importante utilizzare materiali vegetali in cui organogenesi può essere osservato su medium senza fitormoni, poiché quando fitormoni esogenicamente vengono applicati agli espianti per l'induzione germogli o radici, colpiscono l'espianto intero, rendendo difficile valutare la plasticità intrinseca delle piante nella differenziazione cellulare e l'organogenesi. Germogli avventizi possono essere indotta su terreni di coltura privo di fitormoni in...

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) ha proposto il concetto di "totipotenza", da quale pianta cellule possono dividere, differenziare e rigenerare le piante intere anche dopo la loro prima differenziazione in tipi cellulari specifici in piante mature1. Nella coltura del tessuto, se pianta rigenerazione può essere indotta o non è determinata dalla combinazione e concentrazione di fitormoni esogenicamente applicate nel mezzo di crescita. Skoog e Miller trovato che germogli avventizi potrebbero essere indotto dal callo di tabacco su terreno di coltura contenente un alto rapporto di CKs di auxine, mentre radici avventizie potrebbero essere indotto su terreno contenente un rapporto basso2. Da tale constatazione, la coltura del tessuto è stato ampiamente utilizzata per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche3. Germogli avventizi possono essere indotta da tessuti diversi meristema apicale di sparare, come foglie, radici e internodi. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi nella maggior parte delle specie di piante. Tuttavia, le concentrazioni ottimale e combinazioni differiscono da specie e tra tessuti utilizzati come espianti. Così, molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e le combinazioni di fitormoni per esperimenti.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) è una pianta medicinale che contiene alcaloidi come la emetine e Cefelina, principalmente in radici4. Gli estratti della radice sono utilizzati come espettorante, emetico e un amoebicide5. Anche se ipecacuana cresce spontaneamente nelle foreste pluviali tropicali del Brasile, è riluttante a impostare semi nella cultura, e il tasso di germinazione diminuisce durante la conservazione del seme in Giappone, con il clima più freddo6. Invece, si propaga dalla coltura del tessuto, in cui avventizi spara formazione su internodi è il più efficiente metodo7,8. Interessante, i germogli avventizi possono essere indotta in questa specie senza fitormoni trattamento8.
Germogli avventizi si formano sull'epidermide della regione apicale della internodale segmenti senza forzatura, ma non nella regione basale9. Questa differenza indica la polarità di tessuto nei segmenti internodale, che è probabilmente ai sensi del regolamento phytohormonal. Il sistema di cultura ipecacuana permette un'occasione unica per analizzare i cambiamenti nei livelli endogeni fitormoni durante la formazione di sparo accidentale. Qui vi presentiamo il nostro metodo per l'analisi dei livelli endogeni di uno auxina (acido indolo-3-acetico (IAA)) e quattro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) e trans-zeatin riboside (tZR)) nei segmenti internodale attraverso l'uso di LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5]acido indolo-3-acetico</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>Standard interno per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatin</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>Standard interno per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]trans-zeatin riboside</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>Standard interno per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenil adenina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>Standard interno per LC-MS/MS</td></tr> <tr><td>[2H6]N6-isopentenil adenosina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>Standard interno per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>acido indolo-3-acetico</td><td>Wako</td><td>098 00181</td><td>standard per LC-MS/</td></tr><tr><td>MS trans-zeatina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>standard per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>trans-zeatina riboside</td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>standard per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>standard per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenosina</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>standard per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>acetonitrile ipergrado per LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>solvente per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Acqua per cromatografia LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>solvente per LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Colonna cartuccia Waters</td><td>WAT094225</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Colonna</td><td>cartuccia Waters 186000252</td><td></td></tr><tr><td>collo a vite a recupero totale fiala Waters</td><td></td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>blu, tappo collo a vite 12 x 32 mm e setto in PTFE/silicone</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mm</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>colonna UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>colonna UPLC</td></tr><tr><td>Microscopio digitale</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica</td><td>Feather</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>Manico del bisturi</td><td>Feather</td><td>No. 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Trappola per vapore refregerated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>concentratore sottovuoto</td></tr><tr><td>Tobe in vetro monouso (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri sterile</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione di endogeno dell'auxina e citochinina durante la coltura di internodo di ipecac

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Formazione di sparo accidentale è una tecnica importante per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi in maggior parte delle specie. Se possono essere indotta germogli avventizi è determinata dall'equilibrio tra auxine e citochinine (CK) livelli. Molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e combinazioni di fitormoni in ogni tessuto utilizzato come espianti e in ogni specie di pianta. In ipecac, tuttavia, germogli avventizi possono essere indotto sui segmenti internodale in terreno di coltura senza trattamento di fitormoni. Questo consente la plasticità intrinseca di ipecac per differenziazione delle cellule deve essere valutata. Per indurre i germogli avventizi in ipecac, abbiamo coltivato internodale segmenti a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h il medium di B5 senza fitormoni solidificato con gomma di gellan 0,2% per 5 settimane. Per studiare dinamiche di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato acido di indole-3-acetic endogeno e CKs nei segmenti di liquida cromatografia-spettrometria di massa LC-MS/MS. Questo metodo permette l'analisi di acido di indole-3-acetic endogeno e livelli di CKs in modo semplice. Può essere applicato per studiare le dinamiche di auxina endogena e CK durante l'organogenesi in altre specie vegetali.

A 1 settimana dist , germogli avventizi non avevano formato. Alla settimana 2nd , piccoli germogli apparso. Presso i 3rd e 4 settimane dith , il numero di spara aumentato soprattutto nelle regioni apicale (I e II) (Figura 2A). Presso il 5° settimana, il numero di germogli era circa 7 in regione e 5 nella regione II (Figura 2B). Al contrario, ...

Germogli avventizi possono essere indotta su segmenti internodale di ipecac senza trattamento di fitormoni. Per valutare la dinamica di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato endogeno dell'auxina e citochinina in segmenti internodale mediante LC-MS/MS.

Quantificazione di endogeno dell'auxina e citochinina durante la coltura di internodo di Ipecac

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come cambiano i livelli endogeni di fitormone durante la formazione avventizia dei germogli in ipecac. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla rigenerazione dei tessuti nella ruota di coltura dei tessuti vegetali. Il vantaggio principale di questa tecnica è il livello endogeno dell'acido indolo-3-acetico e le citochinine possono essere semplicemente analizzate con elevata sensibilità.Le implicazioni di questa tecnica si estendono a tutta l'instaurazione della degenerazione del tessuto vegetale perché i cambiamenti nel livello endogeno del fitormone innescano la formazione accidentale di germogli. Per iniziare, prepara un terreno B5 privo di fitormoni e aggiungi lo 0,2% di gomma di gellano. Quindi, sterilizzare in autoclave il terreno per sterilizzarlo.Usando un bisturi chirurgico su una lastra acrilica sterile, affetta segmenti internodali di otto millimetri di piantine di ipecac e posizionali sul terreno. Quindi, coltivare i segmenti di ipecac a 24 gradi Celsius sotto 15 micromoli per metro quadrato secondi di luce in un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore per cinque settimane. Dopo aver coltivato i segmenti di ipecac, identificare le regioni da una a quattro in ciascun segmento.Una volta alla settimana, usa un microscopio per contare il numero di germogli avventizi in ogni regione. Per prima cosa, posizionare una perlina di zirconia da cinque millimetri in quattro provette da due millilitri. Quindi, utilizzare un bisturi chirurgico su una lastra acrilica sterile per tagliare i segmenti di ipecac nelle regioni da I a IV.Quindi raccogliere otto segmenti da ciascuna regione in una provetta per campioni.Pesare ciascuno dei campioni e congelarli in azoto liquido. Successivamente, utilizzare un omogeneizzatore a base di perline per frantumare i campioni congelati. Utilizzare un miscelatore a vortice per sospendere i campioni in un millilitro di acetonitrile con 500 picogrammi di ogni standard interno di buoi e CK.A casa i campioni a quattro gradi Celsius per un'ora. Centrifugare i campioni a 3500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare il pellet in acetale nitrile all'80% con acido acetico all'1%.Quindi ripetere la centrifugazione e utilizzare una provetta monouso per combinare i surnatanti. Aggiungere 600 microlitri di acqua con l'uno per cento di acido acetico al surnatante combinato. Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare l'acetale nitrile.Caricare le soluzioni campione in singole cartucce HLB bilanciate. E lavare le cartucce con un millilitro d'acqua con l'uno per cento di acido acetico. Quindi alludere a tutti gli ormoni con due millilitri di acetil nitrile all'80% con acido acetico all'1% in un tubo di vetro.Utilizzando un concentratore sottovuoto, far evaporare l'acetale nitrile per ottenere l'estratto in acqua con l'uno per cento di acido acetico. Caricare le soluzioni campione in singole cartucce MCX bilanciate e lavare le cartucce con un millilitro d'acqua con acido acetico all'uno percento. Quindi alludere all'IAA in un tubo di vetro, con due millilitri di nitrile acetalico al 30% con acido acetico all'1%.Quindi lavare le cartucce con due millilitri di nitrile acetalico all'80% con acido acetico all'1%. Quindi, lavare le cartucce con due millilitri di acqua e un millilitro di acqua con il cinque percento di ammoniaca acquosa in una camera di pescaggio. Alludere ai CK in un tubo di vetro con due millilitri di nitrile acetalico al 60% con ammoniaca acquosa al 5% in una camera di pescaggio.Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare il solvente di ciascuna frazione ormonale. Mescolare i campioni a meno trenta gradi Celsius fino all'analisi LCMSMS. Per prima cosa, sciogliere ogni estratto ormonale in un tubo con 600 microlitri di metanolo.Quindi trasferire la soluzione in una fiala a recupero totale con collo a vite e utilizzare un concentratore sottovuoto per far evaporare il solvente. Sciogliere la frazione IAA in 20 microlitri di nitrile acetalico al 30% e le frazioni CK in 20 microlitri di acqua con acido acetico all'1%. Successivamente, utilizzare un sistema MS a triplo quadrupolo dotato di un sistema HPLC per analizzare i campioni in modalità ioni positivi.Infine, quantificare l'IAA endogeno nei livelli di CK rispetto a una curva standard del rapporto tra standard di etichetta non marcata e deuterio. In questo protocollo, la citochinina ossidante endogena negli scivoli avventizi è stata misurata tramite LCMSMS per cinque settimane. Alla prima settimana, non si erano formati scivoli avventizi e i primi piccoli scivoli sono apparsi durante la seconda settimana.Durante la terza e la quarta settimana, il numero di scivoli aumentò soprattutto nei reggenti uno e due. Durante la quinta settimana il numero di scivoli è stato di circa sette nella regione uno e cinque nella regione due. Prima della cultura, il livello IAA era leggermente più alto nella regione uno rispetto alle regioni due, tre e quattro.Durante la prima settimana, il livello di IAA è aumentato notevolmente nella regione quattro ed è diminuito leggermente nelle regioni uno, due e tre. Dopo cinque settimane di coltura è emerso un gradiente di concentrazione IAA. Con livelli che aumentano dalla regione uno alla regione quattro.Prima della coltura, c'erano solo tracce della maggior parte dei CK. Alla prima settimana, il livello di tZR è aumentato a 13,8 picogrammi per milligrammo nella regione due. E 18,1 picogrammi per milligrammo nella regione tre.Al contrario, i livelli di tZ, iP e iPR sono cambiati solo leggermente durante la coltura. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che gli ormoni della parte endogena sono stabili. Dopo che l'uomo si è sviluppato, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della coltura di tessuti vegetali.Per esplorare la formazione avventizia in altri organismi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'acido endogeno indolo-3-acetico e le citochinine.

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Questo video mostra il saggio di inibizione della crescita delle piantine nella pianta di Arabidopsis thaliana. Viene determinato l'impatto dell'aumento della concentrazione dell'elicitore del peptide immunitario sulla crescita delle piantine.

Misurazione dell'inibizione immuno-indotta della crescita delle piantine

Il Lateral Root Inducible System (LRIS) consente l'induzione sincrona delle radici laterali ed è presentato per Arabidopsis thaliana e mais.

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

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