Semplice generazione di una cultura ad alto rendimento dei neuroni indotti da fibroblasti umani della pelle adulta

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare una coltura ad alta resa di neuroni indotti da fibroblasti cutanei adulti umani. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei disturbi neurologici in quanto consente la degenerazione di un sistema neurale basato sul paziente che mantiene l'età della cellula. Il vantaggio principale di questo metodo è che consente la generazione di neuroni indotti da persone di qualsiasi età in modo molto standardizzato ed efficiente in soli 25 giorni.

Consente una vasta gamma di applicazioni biomediche, tra cui la modellazione delle malattie, la tossicologia, la diagnostica e i saggi di screening dei farmaci su larga scala. A dimostrare la procedura saranno Shelby, un dottorando all'interno dell'unità in cui si allena il cervello, così come Karlonia, un nel nostro laboratorio. Per iniziare, scongelare i fibroblasti dermici umani adulti utilizzando un sistema automatizzato di scongelamento cellulare.

Dopo aver contato il numero di cellule con un contatore di cellule automatizzato, seminare duecentomila cellule per pallone T-75 contenente 10 millilitri di terreno fibroblastico. Mantenere a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il vecchio terreno con un terreno di coltura fresco per fibroblasti.

Continua a cambiare il terreno dei fibroblasti ogni tre o quattro giorni fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza. Un'ora prima di piastrare i fibroblasti dermici umani adulti dalla riprogrammazione, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 250 microlitri di gelatina allo 0,1%. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Aspirare il terreno fibroblastico dal pallone e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Dopo il lavaggio, lisare le cellule con 1,5 millilitri di tripsina allo 0,05% per pallone T-75 a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere tre millilitri di terreno fibroblastico per neutralizzare la soluzione di tripsina.

Raffreddare le cellule staccate in una provetta da 15 millilitri sciacquando due volte le cellule nel pallone. Quindi, centrifugare le celle a 400 G per cinque minuti. Espellere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno fibroblastico.

Quindi, preparare una sospensione cellulare di 1.320.000 cellule in 13,2 millilitri di terreno di coltura per ottenere 100.000 cellule per millilitro di terreno. Dopo aver aspirato la gelatina dalla piastra, lavare due volte la piastra con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Quindi aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno dei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per una notte.

Scaldare 13,2 millilitri di fibroblasti a 37 gradi Celsius. Quindi, scongelare il vettore lentivirale nella cappa laminare a temperatura ambiente. Aggiungere al mezzo il volume richiesto di lentivirus necessario per infettare i fibroblasti dermici umani adulti con una molteplicità di 20 infezioni senza alcun potenziatore di trasduzione.

Quindi sostituire il terreno con 500 microlitri di terreno per fibroblasti con l'aggiunta del vettore lentivirale. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il terreno contenente lentivirus con un terreno fresco di fibroblasti senza il vettore lentivirale.

Il terzo giorno dopo la trasduzione virale, rimuovere il terreno fibroblastico e aggiungere 500 microlitri di terreno di conversione neuronale precoce. Due o tre volte alla settimana, sostituire 225 microlitri di terreno vecchio da ciascun pozzetto con 250 microlitri di terreno di conversione neuronale precoce fresco. Il 18° giorno dopo la trasduzione virale, rimuovere il terreno di conversione neuronale precoce e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di conversione neuronale tardiva.

Continuare a cambiare il terreno ogni due o tre giorni come prima fino al 25° giorno o al punto finale sperimentale. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per rimuovere il terreno. Quindi aggiungere due 250 microlitri di agente dissociante cellulare a ciascun pozzetto e lasciare la piastra nell'incubatore per 10-20 minuti fino a quando le cellule si staccano e galleggiano come cellule singole.

Nel frattempo, preparare il tampone FACS. Triturare con una pipetta da 1000 microlitri. Incubare un po' più a lungo se rimangono grumi di cellule.

Trasferire la sospensione a cella singola ottenuta in una provetta da 1,5 millilitri. Sciacquare i pozzetti due volte con il mezzo di conversione neuronale tardiva e trasferirli nella stessa provetta da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare a 400 G per cinque minuti ed eliminare il supernatent.

Quindi, risospendere il pellet della cella in 200 microlitri di tampone FACS. Ancora una volta, centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti e scartare il supernatente. Risospendere le celle nel tampone FACS e centrifugare.

Ripeti altre due volte. Quindi, risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di tampone FACS contenente l'anticorpo umano CD56 a una concentrazione da uno a 50 per 15 minuti su ghiaccio, lontano dalla luce. Centrifugare le celle a 400 G per cinque minuti e sciogliere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS per lavare le cellule.

Anche in questo caso, centrifugare le celle a 400 G per cinque minuti. Lavare due volte con tampone FACS seguito da centrifugazione. Infine, risospendere in 200 microlitri di tampone FACS contenente 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio.

Ordinare le cellule positive NCAM e negative allo ioduro di propidio utilizzando il gating sulla base del livello di intensità di fluorescenza dei campioni di controllo che non sono stati colorati con l'anticorpo NCAM o lo ioduro di propidio. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato per contare il numero di cellule e seminare 50.000 cellule per centimetro quadrato su una piastra rivestita di fibronectina e laminina in poli-L-ornitina con mezzo di conversione neuronale tardiva. Continuare a cambiare metà del terreno due o tre volte alla settimana con un mezzo di conversione neuronale tardiva fino al punto finale sperimentale.

Immagini rappresentative a contrasto di fase mostrano i cambiamenti morfologici nelle cellule durante il periodo di conversione. Una trasformazione significativa nella morfologia cellulare è visibile fin dal quinto giorno. Entro il 22° giorno, circa la metà delle cellule si è convertita in neuroni.

Le immagini rappresentative dell'amminofluorescenza mostrano la presenza di marcatori neuronali standard nelle cellule. Entro il 25° giorno, le cellule ottengono la morfologia neuronale ed esprimono marcatori neuronali come MAP2 e TAU. I nuclei sono colorati con DAPI.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare neuroni indotti da fibroblasti umani adulti. E questo include la placcatura delle cellule per la riprogrammazione, la trasduzione virale, la manutenzione delle cellule, nonché lo smistamento FACS per la purificazione. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dei disturbi neurologici per studiare diverse caratteristiche associate alla malattia e potenziali terapie.

E questo può essere fatto in un sistema che non è solo un sistema neurale umano, ma che può essere sia specifico per il paziente che per la malattia.