Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster
12 marzo 2018
Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.
L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la diffusione simile ai prioni di aggregati proteici in vivo. Utilizzo di mosche transgeniche che esprimono una proteina incline all'aggregazione in una versione solubile della stessa proteina in popolazioni cellulari isolate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in una biologia cellulare nei campi della neurodegenerazione, come ad esempio come la mitologia dell'aggregato proteico o altro materiale si trasferisce da una cellula all'altra nel cervello.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging dell'aggregato proteico che si diffonde da un sito cellulare all'altro in un sistema nervoso centrale intatto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono per la terapia della malattia di Huntington e di altre malattie neurodegenerative simili ai prioni. Perché la diffusione degli aggregati sembra essere un meccanismo comune alla base della progressione di questi disturbi fatali.
Utilizzando condizioni di coltura standard, generare linee transgeniche di drosophila melanogaster contenenti driver Gal4 o QF tessuto-specifici. Così come le linee contenenti i geni trans dell'huntingtina wild-type o mutante a valle del Gal4-UAS o QF-QUAS. Raccogli la progenie del genotipo del desiderio e invecchiala fino a quando non è pronta per essere sezionata.
Per prepararsi alla dissezione cerebrale, raccogliere le soluzioni necessarie e raffreddarle con ghiaccio, insieme al piatto multipozzetto in vetro, ai puntali delle pipette e a un paio di pinze. Successivamente, anestetizzare le mosche adulte utilizzando anidride carbonica e trasferirle in un pozzetto del piatto di vetro. Quindi, aggiungere circa mezzo millilitro di PBST al pozzetto con le mosche e a un pozzetto adiacente.
Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, concentrati su una singola mosca e illuminala da entrambi i lati con luci a collo d'oca. Quindi posizionare un fazzoletto piegato sotto il piatto per pulire gli strumenti di dissezione. Ora, usando la pinza numero tre nella mano non dominante, trasferisci una singola mosca nel pozzetto contenente PBST.
Immobilizza la mosca afferrandola per l'addome con il lato ventrale rivolto verso l'alto e immergi completamente la mosca. Ora, inserisci un dente di una pinza numero cinque sotto la cuticola nel piccolo spazio adiacente alla proboscide. Quindi fissare la presa sulla testa pizzicando l'occhio da entrambi i lati e separare la pinza per staccare la testa.
Smaltire il corpo della mosca sul tessuto piegato mantenendo la testa immersa nel PBST. Quindi, inserisci un dente della pinza numero tre nello stesso spazio dall'altra parte della proboscide e separa delicatamente la cuticola della testa per esporre il cervello. Prima di procedere, scartare il residuo della cuticola su un fazzoletto di laboratorio.
Durante la rimozione della cuticola, evitare di toccare direttamente il cervello per non danneggiarlo con una pinza. Ora, rimuovi il cervello sezionato dal PBST, afferrando una trachea attaccata o aspirandola nello spazio tra le punte del forcipe usando l'azione capillare. Quindi, trasferire il cervello di mosca in una provetta da microcentrifuga contenente una soluzione fissativa su ghiaccio.
Osservare attentamente per osservare il rilascio del cervello dal forcipe. Una volta che tutti i cervelli sono stati sezionati, trasferire la provetta di raccolta in un nutatore a temperatura ambiente e avvolgerli per circa cinque minuti. Dopo il periodo di fissazione, rimuovere la maggior parte della soluzione fissativa utilizzando una pipetta p1000 e gettarla, facendo molta attenzione a lasciare il cervello nelle provette.
Ciò richiede un'aspirazione delicata e un'attenta osservazione. Quindi, aggiungi un millilitro di PBST fresco al cervello. Copri il tubo e lascialo oscillare sul nutatore per circa un minuto per lavare via il fissativo rimasto.
Quindi rimuovere la soluzione e ripetere questa breve fase di lavaggio. Seguire i due lavaggi brevi con un lavaggio di cinque minuti, poi tre lavaggi di 20 minuti e infine un singolo lavaggio di un'ora. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con cura la maggior parte del PBST e immergere il cervello in 30 microlitri di reagente antisbiadimento a base di glicerolo.
Quindi incubare il cervello a 4 gradi Celsius al buio senza movimento per una o 24 ore. Successivamente, rimuovere i cervelli dalla provetta di raccolta utilizzando una punta di pipetta smussata e trasferirli su un vetrino da microscopio. Quindi orientare delicatamente il cervello secondo necessità per l'imaging utilizzando il forcipe.
È possibile montare più campioni sullo stesso vetrino in file separate. Quindi, rimuovere il reagente antisbiadimento in eccesso dal vetrino utilizzando l'angolo di un fazzoletto da laboratorio piegato. Non lasciare che il tessuto entri in contatto con il cervello.
Quindi lasciare i campioni al buio per cinque-10 minuti per consentire al cervello di aderire al vetrino. Quindi, prendi piccoli pezzi di vetro di copertura rotto e posizionali attorno al cervello coprendo un'area di circa 19 millimetri quadrati, quindi abbassa delicatamente un vetro di copertura di 22 millimetri quadrati sopra il mosaico di cervelli e vetro per creare un supporto a ponte. Quindi, erogare lentamente il reagente antisbiadimento fresco sotto il vetrino coprioggetti in modo che riempia gli spazi vuoti.
Fallo con molta attenzione in modo che il cervello e il vetro rimangano al loro posto. Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con lo smalto per unghie. Per prima cosa, basta applicarlo agli angoli.
Lasciare asciugare i tamponi angolari da cinque a 10 minuti prima di completare la sigillatura lungo i bordi. Il cervello dovrebbe essere sottoposto a imaging il prima possibile. Visualizzare i cervelli montati utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo ad olio 40X o 63X per raccogliere fette Z nella regione del cervello in cui sono espressi i geni trans.
Quindi analizza i dati quantificando i puncta nelle singole sezioni Z o in alternativa dopo aver renderizzato le sezioni in tre dimensioni. Per quantificare gli aggregati di huntingtina mutante che sono ben separati e hanno poco segnale di fondo, aprire la serie Z confocale nella modalità di visualizzazione 3D. Quindi, utilizzare la procedura guidata di analisi per identificare i singoli punti in un canale selettivo.
Nelle impostazioni, regola la soglia e i filtri per rappresentare accuratamente tutti gli aggregati di dimensioni eterogenee come singoli oggetti nell'immagine. Quindi, abilitare gli oggetti divisi nel prefiltro di elaborazione binaria per separare gli aggregati strettamente associati. Le informazioni quantitative sugli oggetti identificati dal software sono riportate alla voce misurazioni.
Dopo aver contato i puncta, caratterizzarli ulteriormente nel software di analisi delle immagini. Ad esempio, è possibile effettuare misurazioni pertinenti dei punti o delle superfici per ottenere informazioni sul diametro, il volume o l'intensità dell'aggregato. Alcuni aggregati di huntingtina wild-type possono essere quantificati muovendosi manualmente attraverso lo stack Z e contando i punti verdi che sono distinguibili dal segnale diffuso circostante.
Fare attenzione a evitare di contare due volte i singoli aggregati quando compaiono in più di una fetta. Un'altra analisi di interesse è determinare la frequenza di colocalizzazione tra gli aggregati di huntingtina Q25-YFP e huntingtina Q91-mCherry. A tale scopo, utilizzare il conteggio manuale spostando fetta per fetta attraverso una pila Z confocale.
Un'attenta selezione dei driver genetici e delle fusioni geniche transgeniche di proteine fluorescenti consente di rilevare chiaramente le proteine huntingtine mutanti e wild-type in popolazioni cellulari non sovrapposte. La conversione dell'huntingtina wild-type da diffusa a puntata è osservata mediante fluorescenza diretta della proteina di fusione YFP nella glia ricevente come risultato dell'espressione dell'huntingtina Q91-mCherry nei neuroni del recettore olfattivo del donatore. Un'attenta selezione dei driver genetici e delle fusioni geniche transgeniche di proteine fluorescenti consente di rilevare chiaramente le proteine huntingtine mutanti e wild-type in popolazioni cellulari non sovrapposte.
Gli aggregati di huntingtina mutanti e wild-type possono essere quantificati come oggetti punteggiati, manualmente o utilizzando software di analisi delle immagini. Gli aggregati possono essere misurati e ulteriormente caratterizzati come popolazioni e per la loro frequenza di colocalizzazione. I puncta co-localizzati possono essere ulteriormente analizzati mediante trasferimento di risonanza di energia a fluorescenza o FRET per dimostrare la stretta vicinanza delle fusioni di proteine fluorescenti.
Una volta padroneggiata, la dissezione cerebrale e l'imaging possono essere eseguiti dall'inizio alla fine in meno di otto ore, se eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di distinguere attentamente gli oggetti aggregati punteggiati da altre strutture fluorescenti nello stesso tessuto utilizzando controlli appropriati. Questa procedura può essere modificata per includere altri metodi, come il knockdown genico, al fine di determinare i meccanismi molecolari per il trasferimento di aggregati tra diversi tipi di cellule.
Grazie e in bocca al lupo per i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo studio analizza la diffusione da cellula a cellula di aggregati proteici di tipo priopatico utilizzando Drosophila melanogaster transgenica. L'approccio consente una visualizzazione in vivo, affrontando questioni fondamentali relative al trasferimento di proteine patogene nelle malattie neurodegenerative.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurodegenerazione
- Biologia cellulare
Sfondo
- L'aggregazione patogena delle proteine è associata alle malattie neurodegenerative.
- Le proprietà di tipo prione possono facilitare la diffusione di questi aggregati tra le cellule.
- Comprendere il trasferimento intercellulare è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- Drosophila melanogaster rappresenta un organismo modello utile per lo studio di questi processi.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo per monitorare la diffusione in vivo di aggregati di tipo priopatico.
- Approfondire la comprensione dei meccanismi degli aggregati proteici nella neurodegenerazione.
- Esplorare le implicazioni per le terapie relative alla malattia di Huntington.
Metodi Utilizzati
- Il metodo prevede l'utilizzo di Drosophila transgenici che esprimono proteine soggette ad aggregazione.
- La dissezione e l'analisi dell'encefalo della mosca permettono l'osservazione diretta della diffusione dell'aggregazione.
- Le procedure dettagliate includono l'anestetizzazione delle mosche e la preparazione dei campioni cerebrali per la microscopia.
- I tempi di fissazione e dei passaggi di lavaggio sono specificati per garantire l'integrità del campione.
Risultati principali
- La tecnica consente una chiara visualizzazione degli aggregati proteici nel sistema nervoso centrale della mosca.
- L'analisi quantitativa dell'aggregazione mediante imaging supporta approfondimenti meccanicistici sulla diffusione.
- I risultati suggeriscono un meccanismo comune di diffusione degli aggregati nelle condizioni neurodegenerative.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un approccio innovativo per visualizzare l'aggregazione di proteine di tipo prionica.
- La metodologia facilita ulteriori ricerche sui meccanismi neuronali alla base dell'evoluzione della malattia.
- Le implicazioni riguardano lo sviluppo di interventi terapeutici per i disturbi neurodegenerativi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il monitoraggio della trasmissione da cellula a cellula di aggregati proteici di tipo priopatico in vivo colma una lacuna fondamentale nella ricerca sulle malattie neurodegenerative, in cui la diffusione intercellulare di specie patogene guida la progressione della malattia. Questo modello basato su Drosophila permette la visualizzazione diretta e la quantificazione del trasferimento di aggregati, sostenendo la validazione di bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nelle fasi iniziali della scoperta. L'approccio fornisce un sistema scalabile e geneticamente manipolabile per valutare candidati terapeutici volti a bloccare la propagazione intercellulare di aggregati nella malattia di Huntington e in disturbi correlati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della diffusione di aggregati di huntingtina mutante dai neuroni donatori alle cellule gliali riceventi in vivo.
- Valore operativo: Utilizza proteine marcate con fluorofori per rilevare direttamente il trasferimento di tipo priopatico, consentendo un riconoscimento chiaro in popolazioni cellulari non sovrapposte.
- Valore scientifico: Favorisce l'identificazione di geni e vie biologiche che mediatori il trasferimento di aggregati tra diversi tipi cellulari, agevolando la scoperta di nuovi bersagli.
- Valore operativo: Sfrutta gli strumenti genetici di Drosophila per l'espressione specifica nei tessuti, facilitando l'analisi sistematica delle vie biologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sui puntini a partire da Z-stack confocali, consentendo una misurazione oggettiva del carico di aggregati e della frequenza di co-localizzazione.
- Valore operativo: Un protocollo standardizzato di dissezione, fissazione e lavaggio del cervello garantisce una preparazione riproducibile dei campioni per l'analisi mediante imaging.
- Valore scientifico: Permette una caratterizzazione ulteriore degli aggregati mediante analisi di diametro, volume, intensità e FRET per valutare la prossimità molecolare.
- Valore operativo: Compatibile con software di analisi delle immagini per il rilevamento automatico dei puntini e il trattamento binario, utile a separare aggregati strettamente associati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella un meccanismo conservato di diffusione patogena rilevante per l'Alzheimer, il Parkinson, l'Huntington e la SLA, aumentando la rilevanza traslazionale.
- Valore operativo: Permette la valutazione longitudinale della dinamica di aggregazione in moscerini anziani, supportando studi preclinici con analisi temporale.
- Valore scientifico: Facilita l'esplorazione di modificatori genetici (ad esempio, mediante silenziamento genico) per determinare i meccanismi molecolari del trasferimento intercellulare.
- Valore operativo: La procedura di montaggio e sigillatura del cervello consente la preparazione stabile di vetrini per l'analisi confocale entro 8 ore, favorendo l'efficienza del flusso di lavoro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, collegando la validazione del bersaglio attraverso l'osservazione diretta della diffusione degli aggregati all'identificazione di composti promettenti mediante la modulazione dei meccanismi di trasferimento, e fornendo indicazioni per la valutazione preclinica di candidati modificanti la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di trasferimento intercellulare e la chiarificazione di vie specifiche dei tessuti mediante l'uso di promotori specifici per tessuto e reporter fluorescenti.
- Screening: Consente la predisposizione del saggio attraverso la preparazione standardizzata del cervello e l'analisi quantitativa delle puncta per la valutazione di composti o modificatori genetici.
- Analisi: Fornisce misurazioni del numero, dimensione, intensità e frequenza di co-localizzazione degli aggregati per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando un meccanismo condiviso tra le principali malattie neurodegenerative, sostenendo la selezione di bersagli allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio del trasferimento di aggregati attraverso diverse proteine e tipi cellulari mediante modifica di transgeni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva visualizzando direttamente la diffusione di tipo priopatico, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei bersagli della neurodegenerazione.
- Valore operativo: Offre un sistema riproducibile e geneticamente flessibile per lo studio del trasferimento proteico intercellulare in un sistema nervoso centrale integro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando bersagli che bloccano la propagazione degli aggregati, riducendo il rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di modificatori della diffusione intercellulare come candidati modificatori della malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica di Drosophila, neuroanatomia e microscopia confocale per la corretta dissezione e imaging del cervello.
- È dipendente da infrastrutture per la microscopia a fluorescenza, inclusi sistemi confocali con obiettivi a immersione in olio da 40X o 63X e set di filtri appropriati.
- Necessita della standardizzazione degli incroci genetici, dei protocolli di invecchiamento e dei tempi di fissazione/lavaggio tra diversi laboratori per ottenere risultati riproducibili.
- L'adattamento ad altri modelli di malattia o tipi di aggregati richiede la validazione dell'espressione del transgene e della compatibilità del reporter fluorescente.
- È limitato dalla necessità di distinguere aggregati puntiformi veri da fluorescenza diffusa o non specifica, mediante l'uso di controlli appropriati e soglie di rilevamento.
