Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire l'imaging raziometrico del calcio degli effetti del neurone specifico ermafrodita, o attività HSN, sul comportamento di Caenorhabditis elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze comportamentali su come l'attività del circuito neuro produca cambiamenti nel comportamento animale quando gli animali si alternano tra gli stati comportamentali. Questa tecnica consente di registrare i cambiamenti nell'attività intracellulare del calcio con un elevato rapporto segnale/rumore, monitorando contemporaneamente il comportamento e la locomozione degli animali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attività neuronale in C.elegans, può essere applicato anche ad altri sistemi modello trasparenti, tra cui le larve di Drosophila e i pesci zebra. A dimostrare la procedura con me, saranno gli studenti di Collin's Labs: Richard Kopcock, Pravat Dhakal e Layla Nassar. Per montare gli animali, applicare prima il mangime batterico OP50 da una piastra di agar con terreno di crescita per nematodi con semi sul fondo di un piccozza per vermi di platino e utilizzare il plettro per trasferire circa 20 L tardivi quattro L-X 2.000 per animali che esprimono il sensibile reporter di calcio GCaMP5 e mCherry in HSN dal promotore N-L tre P su una piastra di terreno di crescita di nematodi seminata.

Confermare la presenza della vulva in via di sviluppo al microscopio stereoscopico come una macchia scura chiara circondata da una mezzaluna bianca e incubare i vermi a 20 gradi Celsius per 24-40 ore. Al termine dell'incubazione, applicare OP50 su un nuovo plettro e trasferire tre vermi su una piastra media di crescita di nematodi senza semi, lasciando una piccola porzione di cibo sulla nuova piastra per consentire ai vermi di nutrirsi durante l'imaging. Quindi, usa una spatola piatta e arrotondata per tagliare un pezzo di 20 x 20 millimetri dalla piastra senza semi e posiziona il pezzo, con il lato del verme rivolto verso il basso, su un bordo di un vetrino coprioggetti pulito di 24 x 60 millimetri numero 1,5.

Quindi, far scorrere con cautela il pezzo di agar al centro del vetrino coprioggetti e posizionare un vetrino coprioggetti numero uno da 22 x 22 millimetri sopra il pezzo di agar per ridurre l'adesione e l'evaporazione. Per impostare l'imager, posizionare i vermi sul tavolino di un microscopio invertito e selezionare il soggettivo 20x. Utilizzare gli oculari binoculari per selezionare un verme per l'imaging e far scorrere il filtro a infrarossi e posizionarlo sopra il condensatore.

Aprire un programma di analisi video appropriato ed eseguire lo script di comunicazione finale della fase seriale XY. Fare clic su CsvWriter e selezionare una cartella per salvare le informazioni sulle fasi X e Y registrate. Quindi, fare clic sulla freccia verde per inizializzare il dispositivo di acquisizione digitale.

Nel software di registrazione della fotocamera a infrarossi nelle impostazioni, selezionare Attiva/disattiva finestra di dialogo di controllo della fotocamera. Quindi seleziona il menu Modalità video personalizzate e seleziona Modalità 1 e Formato pixel Raw otto. In Corsa trigger, impostare la linea di ingresso trigger su tre, la polarità su alta e la modalità su 14.

Attiva/disattiva Abilita per interrompere l'acquisizione del frame fino a quando il segnale di trigger della tensione non viene ricevuto dalla telecamera fluorescente. Con la finestra di visualizzazione delle immagini aperta, fare clic su Registra e selezionare la cartella per il salvataggio delle sequenze di immagini. Selezionare la modalità di registrazione bufferizzata e salvare le immagini in formato JPEG.

Quindi, fare clic su Avvia registrazione per inizializzare l'acquisizione. Quindi, apri la scheda Cattura nel software di acquisizione Florescence e imposta il tempo di esposizione su 10 millisecondi, il Binning su quattro X e la Profondità immagine su 16 bit. Selezionare un sottoarray della fotocamera centrato di 512 pixel di larghezza per 256 pixel di altezza.

Il programma dividerà automaticamente l'immagine larga a metà per generare i canali di fioritura separati. Fare clic su Mostra opzioni trigger di output e impostare tutti i trigger su positivo. Verificare che il trigger uno e il trigger due siano impostati su Esposizione e che il trigger tre sia impostato su Programmabile con un periodo di 25 millisecondi.

Quindi, nella scheda sequenza, selezionare Time Lapse In Impostazioni scansione, impostare Field Delay di uno su 50 millisecondi per raccogliere immagini a 20 hertz. Selezionare Salva nel buffer temporaneo. Per l'imaging raziometrico del calcio, nella scheda Sequenza, fare clic su Avvia per avviare la registrazione e tracciare il verme con il joystick mantenendo a fuoco le cellule e le sinapsi dell'interesse al centro del campo visivo.

Nel momento in cui viene avviata la registrazione della florescenza, i trigger vengono inviati alla telecamera in attesa e al controller del palco che iniziano a raccogliere le immagini sincronizzate e la posizione del palco. Fai clic sul pulsante Statistiche nella finestra Istogramma per mostrare le statistiche dei pixel per ciascun canale. Regolare la potenza del LED per garantire un singolo pixel massimo di florescenza mCherry al termine presinaptico maggiore o uguale a 8.000 conteggi nel canale rosso, fornendo una gamma dinamica di circa 12 bit sopra lo sfondo.

I segnali del Calcium Reporter all'estremità presinaptica durante il riposo o un basso livello di calcio dovrebbero essere di circa 2.500 conteggi nel canale verde. Registrare il comportamento fino a raggiungere uno stato attivo di deposizione delle uova. Quindi, salva un sottoinsieme di 10 minuti contenente 6.000 fotogrammi prima e 6.001 fotogrammi dopo il primo evento di deposizione delle uova.

Fare attenzione a mantenere lo stesso sottoinsieme di immagini in campo chiaro del comportamento dei vermi e dei punti temporali della posizione dello stadio X-Y, altrimenti la sincronizzazione precisa dei flussi di dati andrà persa. Per la segmentazione delle immagini, importare le sequenze di immagini in un programma software di quantizzazione raziometrica appropriato e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla serie temporale nella scheda della sequenza per impostare la serie temporale su 20 fotogrammi al secondo e 1,25 micrometri per pixel. Nel menu Strumenti, selezionare Rapporto, quindi selezionare mCherry per il canale A e GCaMP5 per il canale B e fare clic su Calcola per sottrarre lo sfondo da ciascuna sequenza di immagini.

Selezionate Applica una tabella di ricerca arcobaleno al canale del rapporto e utilizzate il canale mCherry per generare un canale del rapporto modulato in intensità per mappare il colore del rapporto sulla luminosità del canale mCherry. Fare clic su Rapporto per generare i due canali. Per creare un protocollo di ricerca di oggetti, trascinare lo strumento Trova oggetti utilizzando l'intensità nella scheda delle misurazioni nel riquadro del protocollo e fare clic sull'ingranaggio per impostare la finestra dei valori di intensità di mCherry e per trovare oggetti.

Selezionare valori di intensità maggiori o uguali a due deviazioni standard sopra lo sfondo facendo attenzione che il corpo cellulare e l'estremità presinaptica vengano rilevati. Aggiungi eventuali filtri aggiuntivi mirati al canale mCherry solo se necessario per escludere oggetti indesiderati, come: la testa, la coda o la fioritura dell'intestino. Quindi, aprire il menu Misurazioni e selezionare Crea elemento di misurazione e scegliere tutti i punti temporali per eseguire il protocollo di analisi di quantizzazione dell'immagine.

L'acquisizione simultanea dei segnali di florescenza GCaMP5 e mCherry viene utilizzata per generare un canale di rapporto pixel per pixel che compensa i cambiamenti nel movimento e nella messa a fuoco degli animali. Per ogni animale, i cambiamenti nel calcio intracellulare presinaptico di HSN possono essere correlati con comportamenti evidenti nell'imaging in campo chiaro, tra cui il rilascio delle uova e i cambiamenti nella locomozione. In effetti, si possono osservare differenze significative nella velocità dei vermi prima, durante e dopo lo stato attivo di deposizione delle uova.

Ingrandendo un evento di deposizione delle uova, si scopre un robusto cambiamento nella fioritura di GCaMP5 prima dell'evento di deposizione delle uova. Mentre la flessione di mCherry rimane relativamente invariata. Inoltre, le variazioni misurate nel rapporto GCaMP5:mCherry mostrano chiaramente un transitorio di calcio HSN circa 4 secondi prima del rilascio dell'uovo.

La contrazione muscolare vulvare procede evidente di un netto rallentamento della locomozione del verme che termina con il rilascio dell'uovo. Inoltre, l'imaging e il monitoraggio dei vermi, come appena dimostrato, consentono la visualizzazione dell'organizzazione spaziale del comportamento di deposizione delle uova dal foraggiamento, dai cambiamenti transitori di calcio HSM e dall'attività HSN che si trasforma in sparo a raffica prima della locomozione verso il luogo di deposizione delle uova. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora o due, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere l'attenzione sulle cellule di interesse e sui loro terminali presinaptici durante le fasi di imaging. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'attivazione optogenetica, per rispondere a ulteriori domande su come l'HSN risponde alla stimolazione presinaptica. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare la funzione del circuito di deposizione delle uova in C.elegans.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'Imaging Raziometrico del Calcio di HSN in Caenorhabditis elegans attivo.