Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di consentire ai ricercatori inesperti di PTM di determinare efficacemente se la loro proteina bersaglio è modificata endogenamente da uno o più PTM utilizzando un unico sistema completo. Questo metodo migliorerà l'indagine nel campo delle modificazioni post-traduzionali consentendo il rilevamento di PTM chiave e di potenziali diafonie per qualsiasi proteina bersaglio utilizzando un unico sistema semplificato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli esperti non PTM possono rilevare se una proteina è modificata endogenamente da uno o più PTM nel loro sistema modello.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta mentre studiavamo i meccanismi di regolazione di diverse vie di segnalazione cellulare e abbiamo scoperto che i nostri kit o sistemi di facile utilizzo non erano realmente disponibili per lo studio di PTM non fosfoscopici. Inizia questa procedura con la preparazione di cellule A431, come descritto nel protocollo di testo. Inoltre, preparare la lisi blaster in tamponi di diluizione con inibitori.

Versare il terreno di coltura e posizionare le cellule sul ghiaccio. Quindi lavare le cellule due volte con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato 1x. Rimuovere la maggior quantità possibile di PBS prima di aggiungere il tampone di lisi blaster per massimizzare la lisi cellulare.

Aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi blaster a ciascuna piastra da 150 millimetri. La quantità di tampone si basa sulla resa proteica prevista. Quindi, lisare le cellule usando un raschietto per cellule.

Il lisato diventerà viscoso a causa della lisi nucleare. Utilizzare una punta di pipetta tagliata da un millimetro per trasferire il lisato grezzo in un filtro blaster che è stato inserito in una provetta di raccolta da 15 millilitri. Utilizzare lo stantuffo del filtro in dotazione per comprimere completamente il filtro blaster e raccogliere il flusso di lisato, comprese eventuali bolle, in un tubo da 15 millilitri.

Il filtro blaster, semplice ed efficiente, rimuove il DNA genomico, invece di tranciarlo come si vede in altri metodi comunemente usati. Diluire il lisato chiarificato con tampone di diluizione blaster fino a un volume finale di tre millilitri per ogni piastra da 150 millimetri. Il volume finale si basa sulla resa proteica prevista.

Questo passaggio è importante, poiché la composizione finale del tampone influenzerà il rigore della reazione di precipitazione amminica. Successivamente, preparare il saggio di quantificazione delle proteine, come descritto nel protocollo di testo. Misurare l'assorbanza del campione di lisato a 600 nanometri e calcolare la concentrazione proteica.

Capovolgere più volte la provetta del reagente di serie per assicurarsi che le perle siano completamente risospese nella provetta. Per ogni saggio IP, aliquotare la sospensione del micrometallo in provette separate da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio. Qui, aggiungere 20 microlitri di perle di affinità per l'ubiquitina, 30 microlitri di perle di affinità per la fosfotirosina, 40 microlitri di perle di affinità SUMOilazione 2/3 o 50 microlitri di perle di affinità per acetilazione alle singole provette per microcentrifuga.

Capovolgere più volte le provette reagenti di serie contenenti le perle di controllo IP per l'ubiquitinazione e le perle di controllo IGG per assicurarsi che le perle siano completamente risospese nella provetta. Quindi, aliquotare le perle di controllo per reazione di controllo per determinare il legame non specifico. Qui, aggiungere 20 microlitri di microsfere di controllo dell'ubiquitina, 30 microlitri di microsfere di controllo della fosfotirosina, 40 microlitri di perle di controllo SUMOilazione 2/3 o 50 microlitri di perle di controllo dell'acetilazione a singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio.

Risparmia 20 microlitri di lisato per l'esecuzione come controllo del lisato in ingresso al western blot. Aggiungere cinque microlitri di tampone campione 5x al lisato riservato e far bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aggiungi il lisato a ciascuna provetta IP e controlla la provetta IP.

In questo caso, è stato utilizzato un milligrammo di lisato per IP e reazione di controllo, per un totale di otto reazioni IP. incubare le provette su una piattaforma rotante a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, raccogliere le perle mediante centrifugazione da tre a 5.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius.

Aspirare la maggior quantità possibile di surnatante senza disturbare le perle, quindi lavare le perle in un millilitro di tampone di lavaggio blaster per cinque minuti su una piattaforma rotante di quattro gradi Celsius e raccogliere le perle mediante centrifugazione come prima. Dopo la centrifugazione, aspirare quanto più surnatante possibile senza disturbare le perle e ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Dopo il lavaggio finale e la centrifugazione, aspirare la maggior parte del surnatante tampone, quindi rimuovere il surnatante residuo utilizzando una punta di caricamento delle proteine a foro fine.

È accettabile un'interruzione minima del pellet di perline. Assicurarsi che tutto il tampone di lavaggio sia stato rimosso, riducendo al minimo l'interruzione del pellet di battito per massimizzare il recupero delle proteine PTM. Quindi, aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione delle microsfere e risospendere le perle picchiettando o muovendo delicatamente il lato del tubo.

Non utilizzare una pipetta in questa fase. Incubare le perle risospese a temperatura ambiente per cinque minuti. Tagliare l'estremità del puntale della pipetta di trasferimento e trasferire delicatamente ciascuna sospensione di microsfere in una colonna centrifuga per microcentrifuga da 1,5 millilitri che è stata inserita in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare il campione a una velocità compresa tra nove e 10.000 volte G a partire da un minuto a temperatura ambiente per raccogliere il campione IP, quindi aggiungere due microlitri di 2-mercaptoetanolo a ciascun campione e mescolare bene. Mettere i campioni in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, raccogliere il campione mediante centrifugazione a 10.000 volte G per un minuto a temperatura ambiente.

Infine, procedere all'esecuzione di SDS PAGE, trasferimento e analisi western blot come descritto nel protocollo di testo. Il lisato cellulare A431 non trattato e trattato con EGF è stato aggiunto alle perle di affinità di ubiquitina, fosfotirosina, SUMO 2/3 e acetil lisina. Un anticorpo PD-L1 è stato utilizzato per l'analisi dell'immunoblot occidentale per determinare se la proteina PD-L1 è stata modificata da questi quattro PTM in risposta alla stimolazione dell'EGF.

I risultati rappresentativi mostrati qui indicano che questo metodo identifica efficacemente le modifiche endogene del PTM di PD-L1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o 4 ore e mezza se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare PTM enogeno o diafonia per la tua proteina bersaglio o la via di segnalazione utilizzando questo sistema completo di rilevamento PTM.