Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic
3 aprile 2018
Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.
L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare i bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per migliorare la terapia con virus oncolitici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia con virus oncolitici, ad esempio quali fattori specifici dell'ospite e percorsi cellulari modulano la replicazione del virus oncolitico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di identificare i bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per migliorare la terapia con virus oncolitici in modo completo e imparziale.
Questo protocollo può essere utilizzato anche per identificare i fattori dell'ospite che modulano la replicazione del virus in generale. Dopo aver sviluppato un test di screening ad alto rendimento secondo il protocollo di testo, rimuovere un lotto di piastre per microtitolazione dal congelatore e lasciarle scongelare per 20-30 minuti. Nel frattempo, riempire due bottiglie con etanolo al 70%, quindi riempire due provette coniche da 50 ml con PBS e una con acqua distillata.
Immergere il tubo dell'erogatore di liquidi in una bottiglia di etanolo al 70%, quindi posizionare un pezzo di nastro adesivo attorno al tubo per segnare il punto al di sotto del quale il tubo può essere considerato sterile. Utilizzare circa 25 ml di etanolo al 70% per adescare il tubo. Versare altro etanolo nella bottiglia per sostituire il volume perso, quindi lasciare riposare il tubo nell'etanolo per un minimo di cinque minuti.
Dopo aver preparato la cappa per colture cellulari, centrifugare le piastre sigillate e impostarle a 1026 volte G a temperatura ambiente per due minuti. Quindi, rimuovere i sigilli dalle piastre. Quindi pipettare la quantità necessaria di reagente di trasfezione nelle provette coniche contenenti il diluente del reagente di trasfezione preriscaldato.
Iniziare a tripsinizzare le cellule aspirando il terreno da ciascuna piastra. Utilizzare nove mL di PBS per sciacquare le cellule, quindi pipettare tre mL di tripsina per piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti.
Quindi, utilizzare 22 ml di terreno per risospendere le cellule pipettando su e giù 10 volte. Combinare la sospensione cellulare di ciascuna piastra di coltura tissutale in un flacone sterile e mescolare la sospensione cellulare capovolgendo il flacone. Quindi pipettare un mL di aliquat nella sospensione cellulare in due provette per microfughe separate.
Rimuovere il campione da ciascuna provetta per microfugo e contare le cellule. Quindi calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per la densità richiesta e preparare una quantità sufficiente di sospensione cellulare diluita da erogare in un lotto di piastre. Durante la preparazione delle cellule, svuotare il tubo dell'erogatore del liquido dall'etanolo.
Utilizzare circa 25 ml di PBS per adescare il tubo, quindi svuotare il tubo. Assicurarsi che la parte del tubo che verrà immersa nel reagente di trasfezione, e successivamente nella sospensione cellulare, sia mantenuta sterile. Mettere da parte le piastre che possono essere eseguite in sicurezza con un tubo conico di soluzione reagente per trasfezione.
Pipettare le soluzioni di reagenti di trasfezione su e giù 10 volte. Quindi utilizzare la soluzione per adescare il tubo prima di erogare 5 microlitri per pozzetto. Centrifugare le piastre a 1026 volte G a temperatura ambiente per un minuto.
Quindi incubare le piastre a temperatura ambiente per il tempo prescritto per il reagente di trasfezione utilizzato. Durante l'incubazione, svuotare il tubo della soluzione di reagente di trasfezione e inserirlo in una provetta conica piena da 50 ml contenente PBS. Quindi utilizzare circa 25 ml di PBS per risciacquare il tubo adescandolo e poi svuotandolo.
Miscelare il flacone contenente la sospensione cellulare, quindi posizionare il tubo nella sospensione e adescare il tubo quanto basta per verificare che ogni puntale venga erogato correttamente. Erogare 30 microlitri per pozzetto della sospensione cellulare su tutte le piastre. Svuotare la sospensione cellulare dal tubo, quindi sciacquare il tubo con circa 25 ml di PBS seguiti da circa 50 ml di acqua distillata.
Lasciare riposare le piastre a temperatura ambiente per 45-60 minuti dal momento della semina cellulare. Quindi incubare le piastre in un'incubatrice indisturbata per ottenere la durata desiderata del silenziamento genico. Per risparmiare tempo, il giorno prima dell'infezione delle cellule, pipettare in flaconi sterili la quantità precisa di terreno necessaria per infettare ogni lotto di piastre, compreso il terreno per pozzetti non infetti.
Riscaldare il terreno a 37 gradi Celsius, quindi riempire due bottiglie con etanolo al 70%, due provette coniche da 50 ml con PBS e una con acqua distillata. Sterilizzare il tubo con etanolo al 70% come dimostrato in precedenza. Mentre il tubo è immerso nell'etanolo, prima agitare il virus e poi pipettare il volume preciso di virus richiesto nel flacone del mezzo di infezione.
Quindi sciacquare il tubo utilizzando 25 ml di PBS per adescarlo, quindi svuotarlo. Dopo aver rimosso le piastre dall'incubatore, posizionarle nella cappa di coltura tissutale. Utilizzare il terreno per adescare il tubo, quindi erogare 40 microlitri di terreno nei pozzetti di controllo non infetti.
Svuotare il tubo del terreno e utilizzare 25 ml di PBS per risciacquarlo. Dopo aver miscelato il virus, inserire il tubo nel flacone contenente il virus, erogare 40 microlitri di virus attraverso le piastre. Centrifugare le piastre a 400 volte G a temperatura ambiente per 30 minuti.
Incubare le piastre per il periodo di tempo precedentemente determinato. Il giorno prima del fissaggio, preparare un flacone di soluzione fissante e in piedi contenente il quattro percento di formaldeide e PBS per ogni lotto di lastre, ma omettere la colorazione Hoechst. Conservare la soluzione nell'armadio infiammabile, al riparo dalla luce.
Il giorno seguente, utilizzare etanolo al 70% e PBS per risciacquare il tubo come dimostrato in precedenza. Erogare 30 microlitri di soluzione su tutte le piastre, quindi posizionare le piastre nell'incubatore per 30 minuti. Dopo l'incubazione, applicare i sigilli alle piastre e conservarle a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.
Eseguire l'imaging e l'analisi secondo il protocollo di testo. Qui sono mostrate 786 cellule O colorate con Hoechst 33342 dopo un'incubazione di 72 ore con il solo diluente del reagente di trasfezione. Reagente di trasfezione e diluente, siRNA non mirato e con siRNA mirato a PLK1.
Il grafico di sopravvivenza visto qui indica che il 22% delle cellule trasfettate con siRNA PLK1 è sopravvissuto e il 94% delle cellule trasfettate con siRNA non bersaglio è sopravvissuto. Questo grafico mostra i risultati dell'andamento in tempo reale di 786 cellule O infettate con virus oncolitico vaccinico che esprimono una GFP potenziata a vari MOI. Immagini rappresentative di cellule infettate con un MOI di 0,05 in un corso di tempo reale sono mostrate qui.
Un periodo di incubazione di 21 ore consentirebbe di rilevare aumenti e diminuzioni della diffusione poiché il punto temporale si trova all'interno di un intervallo lineare. A seguito di screening dell'RNAi dell'intero genoma su tre linee cellulari tumorali, sono stati identificati 1008 colpi comuni ad almeno due linee cellulari tumorali su tre utilizzando il metodo MAD. 10 hit all'interno delle vie UPR ed ERAD sono stati selezionati per la validazione secondaria tramite siRNA con diverse sequenze di targeting.
Quando si erogano i reagenti, è fondamentale disporre del lotto corretto di piastre, aver selezionato il volume corretto per l'erogazione e che il tubo sia stato riempito con il reagente corretto e sia sempre completamente immerso nel reagente. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come condurre uno screening RNAi ad alto rendimento per identificare i bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per migliorare la terapia con virus oncolitici o per identificare i fattori dell'ospite che modulano la replicazione del virus in generale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per lo screening ad alto rendimento mediante RNAi per identificare bersagli cellulari dell'ospite in grado di potenziare la terapia con virus oncolitici, in particolare per il virus della rabbia e il virus della vaccinia. È adattabile ad altre piattaforme di virus oncolitici e alla scoperta di geni dell'ospite che influenzano la replicazione virale.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Terapia con virus oncolitici
- Interferenza dell'RNA (RNAi)
- Interazioni ospite-patogeno
Sfondo
- I virus oncolitici sono progettati per infettare e uccidere selettivamente le cellule tumorali.
- La comprensione dei fattori dell'ospite può migliorare l'efficacia delle terapie con virus oncolitici.
- Il sequenziamento ad alto rendimento consente l'identificazione completa di bersagli dell'ospite rilevanti.
- Questo protocollo può essere adattato per diverse piattaforme virali.
Scopo dello studio
- Identificare bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per potenziare la terapia con virus oncolitici.
- Esplorare i fattori dell'ospite e le vie cellulari che modulano la replicazione virale.
- Fornire un metodo completo e privo di bias per l'identificazione dei bersagli.
Metodi Utilizzati
- Sviluppo di un saggio di screening ad alto rendimento.
- Preparazione di piastre microtitolazione per lo screening.
- Uso dell'RNAi per ridurre l'espressione dei geni dell'ospite.
- Analisi della replicazione virale in risposta alla modulazione dei geni bersaglio dell'ospite.
Risultati principali
- Identificazione di specifici fattori cellulari dell'ospite che potenziano la terapia con virus oncolitici.
- Conoscenze sulle vie cellulari che influenzano la replicazione virale.
- Dimostrazione dell'efficacia del sequenziamento ad interferenza dell'RNA ad alto rendimento.
- Potenzialità di applicazioni più ampie nella comprensione delle interazioni virus-ospite.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per potenziare le terapie con virus oncolitici.
- L'identificazione di bersagli ospite può portare a strategie terapeutiche migliorate.
- Questo metodo può essere adattato per diverse applicazioni di ricerca in virologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il sequenziamento genomica mediante RNAi consente l'identificazione senza pregiudizi di fattori cellulari ospiti che modulano la replicazione del virus oncolitico, fornendo un approccio sistematico per ridurre i rischi nella selezione di bersagli terapeutici nelle fasi iniziali della scoperta. Mappando le interazioni ospite-patogeno che influenzano l'infecciosità virale, la quantità di particelle rilasciate e la citotossicità, questo metodo supporta una validazione predittiva dei bersagli e la priorizzazione del portafoglio. Questa capacità migliora la comprensione meccanicistica e orienta le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di sviluppo dei virus oncolitici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche identificando i geni dell'ospite che modulano la replicazione virale nelle cellule tumorali.
- Valore operativo: Fornisce un'analisi completa e imparziale dei fattori dell'ospite lungo tutto il genoma per chiarire il coinvolgimento delle vie metaboliche.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico dei bersagli collegando la modulazione dei fattori dell'ospite a modifiche misurabili dell'attività oncolitica virale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Stabilisce un sistema di saggio standardizzato e riproducibile per quantificare fenotipi di replicazione virale come infettività ed effetto citopatico.
- Valore operativo: Genera dati quantitativi ad alto contenuto informativo, adatti alla selezione di risultati positivi e a flussi di lavoro di convalida successivi.
- Valore scientifico: Facilita la scalabilità del saggio e la sua applicabilità trasversale ad altre piattaforme per virus oncolitici oltre al virus Maraba e al vaccinia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Identifica bersagli dell'ospite con rilevanza per la malattia in linee cellulari tumorali, sostenendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Consente validazioni secondarie e terziarie mediante l'uso di sequenze di siRNA ortogonali per confermare la specificità del bersaglio.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento con aggiustamento del rischio, confermando i risultati positivi in multiple linee cellulari tumorali mediante metodi statistici robusti (MAD).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio fino alla validazione preclinica, consentendo un'analisi basata su ipotesi riguardo i percorsi cellulari dell'ospite che influenzano l'efficacia del virus oncolitico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici collegando l'abbattimento dei geni dell'ospite a modifiche della dinamica di replicazione virale.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e risultati quantitativi (ad esempio, grafici di sopravvivenza, metriche di infezione) che consentono una valutazione affidabile di composti o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Produce risultati statistici (ad esempio, identificazione dei "hit" basata sulla deviazione mediana assoluta, MAD) che permettono il confronto tra diverse condizioni e la selezione dei candidati più promettenti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta a una continuità preclinica mediante la validazione dei "hit" in diversi modelli tumorali e il loro collegamento a percorsi noti (UPR, ERAD).
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di screening riutilizzabile, applicabile a diverse piattaforme di virus oncolitici e a studi generali sulle interazioni virus-ospite.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle interazioni ospite-patogeno.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro per schermate ad alto rendimento di RNAi.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce del rischio associato agli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su obiettivi ospite validati in diversi modelli di cancro.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella trasfezione e nella manipolazione liquida ad alto rendimento.
- Dipende dall'accesso a librerie di RNAi, reagenti per la trasfezione e piattaforme di imaging per la rilevazione della replicazione virale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle condizioni del saggio, alla manipolazione dei reagenti e ai protocolli di analisi dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diverse linee cellulari tumorali e ceppi virali per garantire la rilevanza del saggio.
- I limiti pratici includono la tossicità dei reagenti, effetti fuori bersaglio e la necessità di una validazione ortogonale per confermare la specificità dei risultati positivi.
