Name: Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri come identificare fattori ospite che potenziano la terapia con virus oncolitici mediante screening RNAi ad alto rendimento. Questo metodo permette di analizzare in modo completo e imparziale i geni cellulari che modulano la replicazione virale.

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Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da Ontario Institute per ricerca sul cancro, la Fondazione canadese per l'innovazione, l'Ottawa Regional Cancer Foundation e l'Istituto di ricerca di Terry Fox. K.J.A. è stata sostenuta da un Vanier Canada Graduate Scholarship, un Istituto canadese per la salute-Master di ricerca Award e una borsa di studio laureato di Ontario.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui presentiamo un protocollo per impiegare HTS RNAi per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic. Questo è stato testato con successo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, ma, come osservato, può essere adattato per l'uso con altri virus oncolytic o altri virus in genere per identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus. Il protocollo di screening è inoltre progettato per identificare i geni che aumentano o dimi...

HTS RNAi genoma ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per rivelare intuizioni biologiche in diverse aree di studio tra cui biologia del virus. Nel corso degli ultimi dieci anni o così, numerosi gruppi hanno intrapreso basati su cellule su larga scala lo screening RNAi per estesamente identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus (rivisto1,2,3,,4 , 5 , 6 , 7). interessante, un gran numero di questi schermi è stati condotti in cellule di cancro e diverse con virus che sono attuali candidati dei virus oncolytic compreso vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, stomatite vescicolare virus13,14e Maraba virus15. Mentre l'attenzione della maggior parte di questi studi era sull'individuazione di fattori dell'ospite che influenzano alcuni aspetti della replicazione del virus e non sull'identificazione di bersagli bioterapeutici per migliorare la terapia del virus oncolytic, preziosi dati potrebbero essere Estratto da questi insiemi di dati in questo proposito. È chiaro che il potenziale potente per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic non è stato pienamente sfruttato.
Una pletora di piattaforme virus oncolytic sono attualmente in fase di test in studi preclinici e clinici tra cui herpes simplex virus, reovirus e vaccinia virus, che hanno avuto successo dimostrabile in ritardo-fase di test clinici. Per la maggior parte di queste piattaforme, gli sforzi sono stati diretti verso alterando i genomi di virus per migliorare la terapia. Per esempio, per aumentare la specificità del tumore, geni specifici virus sono stati eliminati o mutati per limitare significativamente la replicazione virale in cellule normali, ma non in cellule del tumore. In alcuni casi, i transgeni sono stati aggiunti come GM-CSF (fattore distimolazione del macrofago del granulocyte) per potenziare la risposta immunitaria o NIS (symporter ioduro di sodio) per attivare in vivo imaging e l'assorbimento cellulare di radioiodide per terapeutico fini. Tuttavia, ci è stato molto poco lavoro incentrata sulla manipolazione dei geni host/tumore ed esplorare l'impatto dei geni ospite/tumore sulla replicazione del virus oncolytic. Con l'avvento della tecnologia high throughput screening, è ora possibile per sondare le interazioni ospite-virus su una scala di genoma e decifrare le opportunità di manipolare il genoma ospite per migliorare la terapia virus oncolytic (recensione a16, 17,18).
Abbiamo segnalato il primo studio che dimostra di prova per l'utilizzo di high throughput screening per identificare bersagli di host che potrebbero essere modificati per migliorare la terapia virus oncolytic genetico. Per scoprire i geni ospitanti che modulano Maraba virus oncolitici, un rhabdovirus oncolytic attualmente in fase di sperimentazione in fase I e studi II, abbiamo condotto schermi RNAi genoma attraverso tre linee cellulari differenti del tumore in duplice copia con un siRNA (breve interferenza RNA) Biblioteca 18.120 geni15di targeting. Analisi dei percorsi dei successi identificato nelle schermate ha rivelato arricchimento dei membri della vie di risposta di sforzo ER (reticolo endoplasmatico). Abbiamo selezionato 10 colpi all'interno di queste vie per la convalida secondario utilizzando siRNA con sequenze di destinazione diversi da quelli della schermata principale. Come parte della convalida terziario, abbiamo condotto un esperimento di salvataggio con IRE1α (inositolo-richiedere alfa enzima 1) per confermare che il colpo era il bersaglio. In vitro e in vivo test utilizzando un inibitore di piccola molecola di IRE1α ha provocato oncolytic drammaticamente maggiore efficacia.
Workenhe et al. 12 ha anche condotto una schermata di RNAi genoma utilizzando un pool lentivirale shRNA (short hairpin RNA) libreria targeting 16.056 geni per identificare fattori ospite limitando il virus di simplex di erpete umano tipo 1 (HSV-1) oncolitici mutante KM100-mediata del seno cellule tumorali. Nella schermata principale, hanno identificato i 343 geni l'atterramento di che conducono alla citotossicità migliorata delle cellule infettate KM100 sopra cellule mock-infettate; hanno selezionato 24 di questi geni per convalida secondario. Fuori i 24 geni, 8 geni sono stati confermati nella schermata secondaria con uno di loro essendo SRSF2 (serina/arginina-ricco splicing factor 2), che successivamente è stata confermata usando un esperimento genetico salvataggio durante la convalida del terziario. Il gruppo proseguì per identificare un inibitore della topoisomerasi del DNA chemioterapico che ridotto la fosforilazione di SRSF2 e ha dimostrato che il trattamento di combinazione di HSV-1 KM100 con questo inibitore ha portato alla sopravvivenza estesa dei topi del tumore-cuscinetto TUBO.
Negli studi di cui sopra, è stato seguito un simile flusso di lavoro. Ciascuno ha cominciato con uno schermo di RNAi genoma primario seguito da una schermata secondaria su un numero selezionato di colpi identificati nella schermata principale. Ciò è stata seguita da studi di validazione terziaria, che comprendeva confermando che il colpo era il bersaglio eseguendo genetica rescue esperimenti in vitro con ultima convalida eseguita manipolando la destinazione gene prodotto in vivo. In questo articolo, forniamo prima un protocollo generale per lo sviluppo e la validazione di un test di siRNA-screening ad alta velocità, che consiste nel determinare le condizioni ottimali di transfezione, quantità di virus e la lunghezza dell'infezione. Offriamo anche un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un primario, uno schermo di alto-rendimento siRNA, nonché una descrizione generale del metodo per l'esecuzione di convalida lo schermo secondario e terziario convalida.

<table><tbody><tr><td>Consumabili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA libreria</td><td>GE Dharmacon</td><td>G-005005-02</td><td></td></tr><tr><td>Corning Piastra a 384 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3985</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Piastra a 384 pozzetti</td><td>Becton Dickinson</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>siGenome SMARTpool PLK1</td><td>GE Dharmacon</td><td>M-003290-01</td><td></td></tr><tr><td>AllStars Controllo negativo siRNA</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>siGenome Pool di siRNA non mirato #2</td><td>GE Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HIGH Glucose</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>F15051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione HEPES (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3535-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 100X soluzione</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778100</td><td></td></tr><tr><td>Oligofectamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1225011</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Resazurina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>R7017-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (37% in peso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-4</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi da 500 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430282</tr><tr><td>Pellicola Sigillante Adesiva Per Micropiastre</td><td>Excel Scientific</td><td>361006007</td><td></td></tr><tr><td>Lamina Termosaldante Pelabile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-3720</td><td></td></tr><tr><td>BioTek MicroFlo Select Dispenser cassetta</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-120-625</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Catalog Numero</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroFlo Select (dispenser di liquidi)</td><td>Fisher Scientific 11120621</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT lettore di piastre</td><td>Biotek</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opera Imaging and Analysis Instrument</td><td>PerkinElmer</td><td>HH10000115</td><td></td></tr><tr><td>KiNEDx Robotic Arm</td><td>Peak Analysis and Automation (precedentemente Peak Robotics)</td><td>KX-300-660</td><td></td></tr><tr><td>Cytomat 24C Series Incubatore automatizzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50080227</td><td></td></tr><tr><td>JANUS Stazione di lavoro automatizzata</td><td>PerkinElmer</td><td>AJI4M01</td><td></td></tr><tr><td>Plate Carousel</td><td>Peak Analysis and Automation (precedentemente Peak Robotics)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alps 3000 sigillatrice</td> <td>per piastreThermo Fisher Scientifico</td><td>AB-3000</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide rnai screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia virus oncolytic

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tecnologia di retinatura di alto-rendimento genoma RNAi (RNA interference) è stato ampiamente utilizzata per scoprire i fattori che influenzano la replicazione del virus. Qui presentiamo l'applicazione di questa tecnologia per scoprire obiettivi di host che specificamente modulano la replica di Maraba virus oncolytic rhabdovirus e un papilloma virus con l'obiettivo di migliorare la terapia. Mentre il protocollo è stato testato per l'utilizzo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, questo approccio è applicabile ad altri virus oncolytic e può essere utilizzato anche per identificare gli obiettivi di host che modulano la replicazione del virus nelle cellule di mammifero in generale. Questo protocollo descrive lo sviluppo e la validazione di un test per HTS RNAi in cellule di mammifero, le considerazioni chiave e importante per lo svolgimento di uno schermo di RNAi ad alta produttività primario e una guida dettagliata per la procedura di preparazione lo svolgimento di uno schermo di RNAi di alto-rendimento primario; Inoltre, largamente descrive i metodi per lo svolgimento di convalida lo schermo secondario e terziario convalida gli studi. Il beneficio del RNAi high throughput screening è che permette di catalogare, in modo ampio e imparziali, fattori dell'ospite che modulano qualsiasi aspetto della replicazione del virus per il quale si può sviluppare un test in vitro quali infettività, dimensione, burst e citotossicità. Ha il potere di scoprire bioterapeutici obiettivi imprevisti sulla base delle attuali conoscenze.

Nella Figura 1viene presentata una panoramica del flusso di lavoro per identificare gli obiettivi di host per migliorare la terapia virus oncolytic.
Come illustrato nella Figura 1, il primo passo importante per lo svolgimento di uno schermo di RNAi di alto-rendimento è sviluppo di analisi. Figura 2A fornisce un esempio di layout di piastra ...

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare i bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per migliorare la terapia con virus oncolitici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia con virus oncolitici, ad esempio quali fattori specifici dell'ospite e percorsi cellulari modulano la replicazione del virus oncolitico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di identificare i bersagli dell'ospite che possono essere manipolati per migliorare la terapia con virus oncolitici in modo completo e imparziale.Questo protocollo può essere utilizzato anche per identificare i fattori dell'ospite che modulano la replicazione del virus in generale. Dopo aver sviluppato un test di screening ad alto rendimento secondo il protocollo di testo, rimuovere un lotto di piastre per microtitolazione dal congelatore e lasciarle scongelare per 20-30 minuti. Nel frattempo, riempire due bottiglie con etanolo al 70%, quindi riempire due provette coniche da 50 ml con PBS e una con acqua distillata.Immergere il tubo dell'erogatore di liquidi in una bottiglia di etanolo al 70%, quindi posizionare un pezzo di nastro adesivo attorno al tubo per

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Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

Qui usiamo una libreria umano LentiPlex raggruppati e tradizionali metodi di sequenziamento per identificare gli obiettivi gene promuovere la sopravvivenza delle cellule. Dimostriamo come impostare e deconvolute uno schermo LentiPlex e convalidare i risultati.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Vengono descritti i metodi per valutare l'efficacia e la tossicità delle molecole di RNA che mirano alle fasi post-integrazione del ciclo di replicazione dell'HIV-1. Questi metodi sono utili per lo screening di nuove molecole e l'ottimizzazione del formato di quelle esistenti.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Vi presentiamo un protocollo per dimostrare un sistema di trasferimento di romanzo genica somatica che utilizza RIP-Tag; RIP-tva modello di topo per studiare la funzione dei geni in metastasi. Il retrovirus aviaria vengono consegnati intracardiacally per garantire il trasferimento genico in lesioni pre-maligne, non invasive delle cellule β del pancreas in topi adulti.

Identificazione e caratterizzazione di fattori metastatici di trasferimento genico nel romanzo RIP-Tag; RIP-tva modello murino

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

Paramyxoviruses per l'immunomodulazione mirata tumore: progettazione e valutazione Ex Vivo

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

La mutagenesi inserzionale è uno strumento essenziale nella genetica avanzata per identificare gli elementi genomici funzionali. Qui, descriviamo l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per rilevare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus.

Identificazione di siti di integrazione di lentivirus funzionalmente rilevanti in una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale

Scopri come identificare fattori ospite che potenziano la terapia con virus oncolitici mediante screening RNAi ad alto rendimento. Questo metodo permette di analizzare in modo completo e imparziale i geni cellulari che modulano la replicazione virale.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

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