Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere la produzione e le possibili applicazioni di vettori lentivirali ottimizzati privi di integrasi, in grado di consegnare transgeni CRISPR/Cas9 a cellule in vivo e in vitro per un'edizione genica rapida ed efficiente. CRISPR/Cas è una piattaforma altamente efficiente per la modifica e manipolazione genica. Di seguito è riportata una panoramica del protocollo per la produzione di vettori lentivirali ottimizzati privi di integrasi, altamente concentrati, per il trasferimento efficiente di strumenti di editing genico CRISPR/Cas.

La tecnica si è dimostrata molto efficace nelle cellule coltivate e nei neuroni post-mitotici. Seminare le cellule HEK-293T un giorno prima della trasfezione in modo che la confluenza raggiunga tra il 70 e l'80% il giorno successivo. Prima della trasfezione, aspirare il vecchio mezzo dai piatti di coltura e aggiungere mezzo appena preparato privo di siero.

In un tubo conico da 15 millilitri, aggiungere tutti e quattro i plasmidi per preparare una miscela di plasmidi da trasfettare in una piastra da 15 centimetri. Successivamente, aggiungere 312,5 microlitri di cloruro di calcio uno molare alla miscela di plasmidi e portare il volume a 1,25 millilitri con acqua sterile doppio-distillata. Continuare ad aggiungere gocce di soluzione tampone BES 2X gradualmente, agitando con un vorticoso.

Quindi, incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere 2,5 millilitri di miscela plasmidica, in gocce, a ciascuna delle piastre da 15 centimetri. Successivamente, agitare delicatamente le piastre e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o tre ore.

Dopo tre ore, aggiungere 2,5 millilitri di siero al 10% in ogni piastra e proseguire con un'incubazione notturna. Utilizzare una pipetta da coltura tissutale da 10 millilitri per aspirare con attenzione il sopranatante dalle cellule transfezionate seminate in ogni piastra. Successivamente, raccogliere tutto il sopranatante in provette da centrifuga da 50 millilitri.

Posizionare il tubo all'interno di una centrifuga da banco e avviare la centrifugazione. Successivamente, filtrare il soprannatante attraverso un'unità di filtrazione a vuoto da 0,45 micrometri. Caricare i tubi conici per ultracentrifugazione con diverse concentrazioni di saccarosio per formare strati con gradiente di saccarosio.

Aggiungere con attenzione il sopranatante contenente il virus al gradiente di saccarosio. Per elaborare l'intero volume di 100 millilitri di sopranatante virale, utilizzare sei provette per ultracentrifuga per ogni centrifugazione. Successivamente, bilanciare le provette per ultracentrifuga con tampone PBS 1X e centrifugare i campioni a 70.000 g per due ore a 17 gradi Celsius.

In tubi puliti, raccogliere le frazioni di saccarosio al 30% e al 60% e aggiungere tampone PBS 1X freddo per portare il volume a 100 millilitri. Mescolare i campioni aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, aggiungere da 20 a 25 millilitri della soluzione virale sopra quattro millilitri di soluzione di saccarosio al 20% in tampone PBS 1X per preparare il cuscino di saccarosio.

Regolare il volume con tampone PBS sterile 1X se i tubi sono pieni meno di 3/4 e bilanciarli. Quindi, centrifugare i campioni per due ore a 17 gradi Celsius. Successivamente, versare il soprannatante e rimuovere il liquido residuo capovolgendo i tubi su carta assorbente.

Dopo aver aspirato le ultime gocce residue, un pellet contenente il virus è appena visibile come una macchia traslucida. Successivamente, risospendere il pellet in 70 microlitri di PBS 1X pipettando accuratamente la sospensione. Trasferire nuovamente la sospensione in un altro tubo e mescolare accuratamente per sciogliere completamente il pellet.

Quindi, risciacquare il tubo con ulteriori 50 microlitri di tampone PBS 1X freddo e mescolare. Mantenere i campioni su una microcentrifuga da banco e centrifugare a 10.000 ×g per 30 secondi. Dopo la centrifugazione, aggiungere aliquote di 10 microlitri del soprannatante in ciascun tubo microcentrifuga nuovo e conservarli a -80 gradi Celsius.

Rivestire una piastra a 96 pozzetti ad alto legame con 100 microlitri di anticorpo monoclonale anti-p24 in una diluizione di uno a 1.500 secondo il programma NIH AIDS per il kit del saggio di cattura dell'antigene HIV-1 p24. Incubare la piastra tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la piastra con 200 microlitri di TWEEN-20 allo 0,05% in PBS freddo per tre volte.

Per evitare il legame non specifico, bloccare la piastra con 200 microlitri di albumina sierica bovina all'1% per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare la piastra con 200 microlitri di TWEEN-20 allo 0,05% in PBS freddo per tre volte. Poi, preparare i campioni di vettore concentrati e non concentrati a una concentrazione finale del 10% diluendo il vettore con acqua bidistillata e Triton X-100.

Successivamente, preparare gli standard di HIV-1 mediante diluizione seriale due volte partendo da cinque nanogrammi per millilitro. Dopo aver diluito i campioni di vettore concentrati e non concentrati, pipettare il campione sulla piastra in triplicato e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare la piastra, quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo policlonale anti-p24 da coniglio su ciascuna piastra e incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Dopo sei lavaggi, incubare la piastra con perossidasi di rafano dolce caprina anti-coniglio a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo numerosi lavaggi, incubare la piastra con il substrato per perossidasi TMB a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere acido cloridrico normale per arrestare la reazione. E leggere l'assorbanza a 450 nanometri con un lettore di piastre per assorbanza.

Sezionare le cellule in una piastra a sei pozzetti. Il giorno successivo, quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%, trasdurre con virus purificato a una molteplicità di infezione predeterminata compresa tra uno e 10.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Monitorare le piastre per registrare le differenze nei segnali GFP a intervalli regolari per uno a sette giorni. Cercare cellule GFP positive al microscopio fluorescente dotato di filtro GFP con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente a 470 e 525 nanometri.

Per differenziare la popolazione di cellule positive e negative per GFP, utilizzare cellule non trasdotte. Un gel di agarosio rappresentativo che mostra la mutante clonata dell'integrasi positiva. Il clone digerito con doppia digestione con enzimi di restrizione EcoRV e SPH1, indicato nel riquadro tratteggiato rosso, rappresenta il clone mutante dell'integrasi.

Il clone è stato ulteriormente sottoposto a sequenziamento per verificare la mutazione dell'acido aspartico in posizione 64 in acido glutammico. È stato mostrato un grafico a barre rappresentativo del saggio p24 ELISA che illustra i titoli virali del vettore lentivirale privo di integrasi SP1-CRISPR/Cas9, indicato con la barra nera, e del vettore lentivirale SP1-CRISPR/Cas9 competente per l'integrazione, indicato con la barra bianca. Il grafico a barre mostra i titoli virali privi e dotati di integrasi nell'ordine di grandezza di uno per dieci alla. I grafici a barre rappresentano il numero di copie di particelle virali per millilitro.

Immagini fluorescenti rappresentative che mostrano l'intensità fluorescente media delle cellule positive per GFP sotto trattamento virale. Le cellule sono state trasdotte con vettori lentivirali competenti per l'integrazione CRISPR o con componenti virali CRISPR di vettori lentivirali difettivi per l'integrasi.

È stata osservata una marcata riduzione del segnale GFP rispettivamente a una multiplicità di infezione pari a uno e a cinque, dopo la trasduzione dei componenti lentivirali con integrasi competente o difettiva rispetto alle cellule di controllo non trasdotte. Il principale vantaggio di questa tecnica deriva dalla capacità dei vettori lentivirali difettivi per l'integrasi di consegnare uno strumento di editing genico in modo transitorio, il che aumenta significativamente la sua specificità e sicurezza. Se eseguiti correttamente, i protocolli dovrebbero richiedere una settimana per essere completati.

Eseguendo questo protocollo, ci si aspetta di generare vettori lentivirali altamente concentrati nell'intervallo da 10 alla nona a 10 alla decima unità genoma virale per mL.