Name: Cella di aggregazione saggi per valutare lassociazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Scopri i saggi di aggregazione cellulare per valutare l'associazione del recettore Notch di Drosophila con ligandi trans e la sua inibizione da ligandi cis. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di segnalazione senza interferenze endogene.

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Gli autori riconoscono supporto da NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) e Mizutani Foundation per Glycoscience (grant #110071 a HJN) e sono grato a Tom V. Lee per discussioni e suggerimenti sui saggi e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) per plasmidi e linee cellulari.

1. preparazione del doppio incagliato RNA (dsRNA) per atterramento di Shams
<ol>
	<li>Amplificazione di PCR dei prodotti
	<ol>
		<li>È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min). 
		Migliorata la proteina fluorescente verde (EGFP) dsRNA primer (5' - 3')- Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG Reverse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA primer (5' - 3')- Forward primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT Reverse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA Nota: EGFP dsRNA viene utilizzato come controllo negativo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gel-purificare i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi utilizzando un kit di purificazione del gel commerciale secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un prodotto commerciale in grado di trascrivere da un promotore T7 secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Purificare il dsRNA utilizzando un kit di purificazione di RNA secondo il protocollo del produttore e conservare a-80 ° C.</li>
	<li>Valutare l'efficienza di shams atterramento utilizzando la seguente procedura (1.5.1-1.5.5).
	<ol>
		<li>Conteggio celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 cellule in ciascun pozzetto di un 6 anche piastra in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Aggiungere 7,5 µ g di EGFP- o dsRNA shams ad ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.</li>
		<li>Raccolto il controllo (EGFP dsRNA-Trattato) e shams dsRNA-Trattato S2 cellule pipettando dolce seguita da cubettatura giù mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 25 ° C e di processo per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo protocollo del produttore.</li>
		<li>Quantificare il RNA usando un spettrofotometro e processo di 100 ng di RNA per passaggio 1 qRT-PCR utilizzando reagenti commerciali qPCR e primer/sonde e il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 15 s) e ricottura/estensione (60 ° C, 1 min). Nota: Vedere la Tabella materiali per informazioni sui set di primer/sonda e lo strumento utilizzato per esperimenti di qRT-PCR shams e controllo in questi studi.</li>
		<li>Calcolare i livelli di mRNA di relativo shams utilizzando 2–ΔΔCT metodo16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. valutazione dell'associazione tra il recettore Notch e Trans-ligandi
<ol>
	<li>Preparare il segnale di ricezione (cellule S2 che esprimono il recettore Notch).
	<ol>
		<li>Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 e cellule S2-tacca stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina. Nota: Per le cellule S2-Notch, che sono disponibili da Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), aggiungere 200 metotrexato nM nei media. Per preparare una soluzione stock di metotrexato 0,5 mM, in primo luogo preparare una soluzione di metotrexato 20 mM a 250 µ l di 1 M NaOH. Successivamente, diluire questa soluzione a 0,5 mM a 1 M fosfato tampone salino e conservare a-20 ° C. In cellule S2-tacca, espressione della proteina Notch è sotto il controllo del promotore della drosofila metallotioneina nel vettore di pMT .</li>
		<li>Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.</li>
		<li>Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e incubare a 25 ° C per 3 giorni. Nota: CuSO4 viene utilizzato per indurre l'espressione di proteine controllato dal promotore metallotioneina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare l'invio segnale celle (cella di S2 esprimendo ligandi Delta o dentellato).
	<ol>
		<li>Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra ~ 5 x 106 S2-Delta o S2-dentellatoTom cellule stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1 mL/pozzetto di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina. Nota: Aggiungere 200 nM methotrexate per cellule S2-Delta e 100 µ g/mL igromicina per S2-dentellatoTom cellule nei media. Espressione di Delta e dentellatoTom— una versione funzionante di dentellato12pomodoro-etichetta — è in Drosophila metallotioneina promotore nel vettore di pMT .</li>
		<li>Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di ligandi e incubare a 25 ° C per 3 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione di segnale.
	<ol>
		<li>Raccogliere la S2 dsRNA-Trattato (controllo) e cellule S2-tacca di pipettaggio delicato e piastra di 2.5 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo il conteggio manuale di un emocitometro.</li>
		<li>Aggiungere cellule stabili 5x105 S2-Delta o S2-dentellatoTom in un volume totale di 200 µ l di terreno di Schneider (supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina). Nota: Tutte le cellule S2 gestione (compreso il trattamento di cromatura, induzione e dsRNA) è stato fatto sotto una cappa di biosicurezza.</li>
		<li>Collocare la piastra su un agitatore orbitale a 150 giri/min (rad 942,48/min).</li>
		<li>Dopo 1 min, mescolare il contenuto di ogni pozzetto e prendere 20 µ l per conteggiare il numero degli aggregati.<ol>
			<li>Allo stesso tempo prendere un'immagine rappresentativa sotto microscopio composto invertito con ingrandimento 10x (obiettivo PLL 10/0.25).</li>
			<li>Contare manualmente le aggregazioni (&#62; 6 celle) utilizzando un emocitometro.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Posizionare la piastra su un agitatore.</li>
		<li>Ripetere l'acquisizione dell'immagine e il conteggio dopo 5 min e 15 min di aggregazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eseguire la quantificazione di trans-associazione.
	<ol>
		<li>Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellatoTom come un controllo di sfondo.</li>
		<li>Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra S2-Notch e cellule S2-Delta o S2-dentellatoTom (magnitudo di trans-associazione).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.Valutazione dell'inibizione del legame tra tacca e Trans-ligandi di Cis-ligandi
<ol>
	<li>Preparare cellule di segnale di ricezione.
	<ol>
		<li>Le cellule di piastra 5x105 S2 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.</li>
		<li>Co-transfect le cellule dsRNA-trattate con pBluescript e PMT-tacca11 (DGRC) da solo o con pMT-Notch e pMT-Delta11 (DGRC) o PMT-dentellato17 per un totale Concentrazione di DNA di 2 µ g/Beh utilizza un reagente di transfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Nota: pBluescript viene utilizzato come un controllo. Le cellule co-trasfettate saranno chiamate S2-tacca &#38; Deltatransitoria o S2-tacca &#38; dentellato celluletransitoria in seguito.</li>
		<li>Incubare le cellule S2 transfected transitoriamente a 25 ° C per 24 h.</li>
		<li>Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e i ligandi e incubare a 25 ° C per 3 giorni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparare l'invio segnale celle come descritto al punto 2.2.</li>
	<li>Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione segnale come descritto nella sezione 2.3.</li>
	<li>Quantificare l'inibizione di trans-associazione di cis-ligandi.
	<ol>
		<li>Calcolare il numero di aggregazioni / mL fra le cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellato celle come un controllo di sfondo.</li>
		<li>Quantificare la grandezza di inibizione di cis-ligandi come segue.<ol>
			<li>Definire A come numero di aggregazioni tra S2-taccatransitoria e cellule S2-Delta.</li>
			<li>Definire B come numero di aggregazioni tra S2 cellule transitoriamente co-trasfettate con tacca e Delta (S2-tacca &#38; Deltatransitoria) e cellule S2-Delta.</li>
			<li>Calcolare la relativa aggregazione C = (B x 100) /A</li>
			<li>Calcolare la grandezza di inibizione di cis- ligando (Delta o dentellato) come 100 – C. Nota: ad esempio, se la relativa aggregazione è 45%, cis-ligandi sono considerati per inibire la trans-associazione del 55%.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li>
<li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate%2FJagged+and+Delta+family+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi5. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l'associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di3,4. Di conseguenza, a decifrar...

Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l'interazione tra recettori Notch e loro ligandi1vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione2. D'altra parte, l'interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all'inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione3. L'equilibrio tra trans- e cis-interazioni è necessaria per garantire l'ottima tacca di ligando-dipendenti di segnalazione4. Drosophila ha un recettore Notch e due ligandi (Delta e dentellato) al contrario di mammiferi, che hanno quattro tacca recettori e cinque ligandi [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-simile 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Avendo questa semplicità, il modello di Drosophila offre la facilità per sezionare/studio gli effetti dei modificatori di percorso su interazioni ligando Notch e successivamente su tacca di segnalazione. In determinati contesti durante lo sviluppo degli animali (tra cui lo sviluppo dell'ala in Drosophila), entrambi cis- e trans-interazioni sono coinvolti per ottenere adeguata tacca di segnalazione e delle cellule a destino1,6 . È importante distinguere gli effetti dei modificatori di pathway di Notch in questi contesti il cis- e trans-interazioni della tacca con suoi ligandi.
Il nostro gruppo ha precedentemente segnalato che l'aggiunta di un residuo di carboidrato chiamato xilosio di Drosophila tacca negativamente regola tacca di segnalazione in determinati contesti, tra cui ala sviluppo7. Perdita di shams (l'enzima che xylosylates tacca) conduce ad un fenotipo di "perdita della vena di ala"7. Più recentemente, gli esperimenti di dosaggio del gene e l'analisi clonale sono stati utilizzati per mostrare che la perdita di shams migliora tacca Delta-mediata individuazione. Distinguere se la tacca di segnalazione avanzata nei mutanti di shams è il risultato di una riduzione cis-inibizione o aumentata trans-attivazione, studi di sovraespressione ectopica di ligandi di Notch in dischi immaginali larvale ala sono state effettuate utilizzando il driver di dpp-GAL4 . Questi esperimenti fornito prova che suggerisce che Shams regola trans-attivazione di tacca da Delta senza intaccare la tacca cis-inibizione di ligandi8. Tuttavia, feed-back regolamenti e gli effetti dei ligandi endogeni potrebbero complicare l'interpretazione di sovraespressione ectopica studi1,6,9.
Per risolvere questo problema, drosofila S2 cellule10 sono stati utilizzati, che fornisce un sistema semplice in vitro per tacca-ligando interazione studi11,12. S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando11 ed esprimere un basso livello di dentellato13, che non influisce tacca-ligando aggregazione esperimenti8. Pertanto, le cellule S2 possono essere stabilmente o transitoriamente transfected di Notch e/o singoli ligandi (Delta o dentellato) per generare le cellule che esprimono esclusivamente il recettore Notch o uno dei suoi ligandi o una loro combinazione. Miscelazione delle cellule che esprimono Notch S2 con ligando-esprimendo risultati di cellule S2 nella formazione degli aggregati eterotipiche mediata da recettore-ligando associazione11,12,14. Quantificazione della formazione aggregata fornisce una misura della trans-associazione tra tacca e suoi ligandi15 (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule S2 possono essere co-trasfettate con ligandi tacca e Delta o Serrate (cioè cis-ligandi). CIS-ligandi in queste cellule che esprimono Notch S2 abrogare l'associazione della tacca con trans-ligandi e risultato in diminuzione formazione aggregata8,12,14. Il relativo calo in formazione aggregata causata da cis-ligandi fornisce una misura dell'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-ligandi (Figura 2). Di conseguenza, le analisi di aggregazione delle cellule sono state utilizzate per esaminare l'effetto di perdita di xylosylation trans- e cis-interazioni tra tacca ed i suoi ligandi.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per saggi di aggregazione cellulare finalizzata a valutare l'associazione della tacca con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi usando le cellule della drosofila S2. Ad esempio, forniamo i dati che ci ha permesso di determinare l'effetto di xylosylation tacca sull'associazione tra tacca e trans-Delta8. Queste analisi semplice forniscono una valutazione semi-quantitativa del tacca-ligando interazioni in vitro e consentono a determinare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di modificatori del pathway di Notch.

<table><tbody><tr><td>BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium,</td><td>Lonza</td> modificata <td>04-351Q</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillina-Streptomicina 100X soluzione</td><td>GE Healthcare lifescience&nbsp;</td><td></td><td></td>SV30010</tr><tr><td>CELLSTAR piastra a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR piastra a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>VWR mini shaker</td><td>Marshell Sceintific</td><td>12520-956</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher Sceintific&nbsp;</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscrip T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep (kit di purificazione dell'RNA)</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision Microscopio invertito</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9MP USB2.0 Fotocamera digitale + Software avanzato</td><td>AmScope</td><td>MU-900</td><td>Acquisizione delle immagini utilizzando il software ToupView</td></tr><tr><td>Kit di estrazione rapida del gel PureLink</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GenDepot</td><td>F0600-050</td><td></td></tr><tr><td>Metotrexato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>Invitrogen</td><td>HY068-L6</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4448-02</td><td></td></tr><tr><td>Cellule S2</td><td>Invitrogen</td><td>R69007</td><td></td></tr><tr><td>S2-SerrateTom cellule</td><td></td><td></td><td>Regalo di R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td></tr><tr><td>Cellule S2-Delta</td><td>DGRC</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Celle S2-Notch</td><td>DGRC</td><td>154</td><td></td></tr><tr><td>vettore pMT-Delta</td><td>DGRC</td><td>1021</td><td>Dono di S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pMT-Serrato vettoriale</td><td></td><td></td><td>Regalo di Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td></tr><tr><td>pMT-Notch vettoriale</td><td>DGRC</td><td>1022</td><td>Dono di S. Artavanis-Tsakonas</td></tr><tr><td>pAc5.1-EGFP</td><td></td><td></td><td>Dono di Hugo Bellen</td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td><td>Biosistema applicato</td><td>1611091</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Saggio di espressione genica per CG9996 (Shams)</td><td>Biosistema applicato</td><td>Dm02144576_g1&nbsp;</td><td>con colorante FAM-MGB</td></tr><tr><td>Saggio di espressione genica TaqMan per CG7939 (RpL32)</td><td>Applied Biosystem</td><td>Dm02151827_g1</td><td>con colorante FAM-MGB</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem</td><td>4351405</td><td>Modulo a blocchi a 96 pozzetti</td></tr></tbody></table>

cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell'adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l'attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l'interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l'esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans- versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell'associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto &#62; 6 celle. Per esaminare l'effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l'inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull'associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.

Le nostre osservazioni in vivo hanno suggerito che la perdita dei risultati di shams xylosyltransferase gene in guadagno di tacca di segnalazione causa di aumentata Delta-mediata trans-attivazione di tacca senza intaccare il cis-inibizione di Tacca di ligandi8. Per testare questo concetto, sono state eseguite analisi di aggregazione in vitro delle cellule. In primo luogo, shams espressione in cellule S2 è stato ...

Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l'attivazione e l'inibizione del recettore Notch di trans- e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l'aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

L'obiettivo generale di questo saggio di aggregazione è valutare il legame del recettore di Notch con i trans-ligandi e la sua inibizione da parte dei cis-ligandi. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave: in che modo il fattore genetico o farmacologico influenzerà il legame del recettore di Notch al suo ligando e altererà la segnalazione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di valutare il legame trans e cis del recettore di Notch con il suo ligando.È interessante notare che non coinvolge l'effetto di sovrapposizione del ligando endogeno. Iniziare la valutazione facendo girare le celle che ricevono il segnale e risospendendole nel mezzo di Schneider. Contare le cellule manualmente utilizzando un ematocitometro.Piastra cinque volte 10 al quinto S2 e celle S2-Notch stabili in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, in un millilitro per pozzetto di terreno di Schneider. Quindi, aggiungi 7,5 microgrammi di RNA a doppio filamento in ciascun pozzetto e incuba le cellule a 25 gradi Celsius per 24 ore. Aggiungere 0,7 millimolari di solfato di rame per indurre l'espressione di Notch e incubare le cellule a 25 gradi Celsius per tre giorni.Dopo

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

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In questo video, dimostriamo la tecnica per misurare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche attraverso il saggio di aggregazione cellulare HEK. In questo saggio, un numero uguale di cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e una proteina fluorescente vengono mescolate con cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare post-sinaptica e un'altra proteina fluorescente. L'interazione tra le...

Saggio di aggregazione cellulare per rilevare le interazioni trans tra le molecole di adesione cellulare

Questo video dimostra la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina alla giunzione neuromuscolare di Drosophila (NMJ) utilizzando il Proximity Ligation Assay (PLA). Dopo aver isolato le pareti corporee, le proteine interagenti vengono sondate con anticorpi primari e anticorpi secondari coniugati con PLA. La vicinanza delle proteine interagenti facilita la legatura delle sonde con oligonucleotidi connettori, formando DNA circolare, che viene poi amplificato dall'amplificazione del...

Rilevamento delle interazioni proteina-proteina nelle larve di Drosophila utilizzando un saggio di legatura di prossimità

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Drosophila è famosa per la sua manipolazione genetica potente, ma non per la sua idoneità di analisi biochimica in profondità. Qui vi presentiamo una procedura basata TAP-per identificare interagiscono partner di qualsiasi proteina di interesse da parte del cervello della mosca. Questa procedura può potenzialmente portare a nuove vie di ricerca.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Qui presentiamo un metodo semplice e rapido per caratterizzare le proprietà adesive intrinseche delle molecole di adesione cellulare putative.  L'ectodominio secreto, marcato con epitopo, di una molecola di adesione cellulare viene catturato dal terreno di coltura su piccole perle funzionalizzate uniformi.  Queste perle possono quindi essere utilizzate immediatamente in semplici saggi di aggregazione delle microsfere.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.

Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in Drosophila Embrioni

Qui descriviamo un'analisi di contrattilità usando cellule di Drosophila S2R +. L'applicazione di un ligando esogeno, piegato gastrulazione (nebbia), conduce all'attivazione della nebbia del signaling pathway e cellular contrattilità. Questa analisi può essere usata per studiare la regolazione delle proteine cellulari contrattilità nella nebbia via di segnalazione.

Un'analisi Cell-based per indagare Non muscolo-miosina II contrattilità tramite la gastrulazione piegato la via di segnalazione in cellule di Drosophila S2R +

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare le interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema di cellule eterologi

Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Scopri i saggi di aggregazione cellulare per valutare l'associazione del recettore Notch di Drosophila con ligandi trans e la sua inibizione da ligandi cis. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di segnalazione senza interferenze endogene.

Cella di aggregazione saggi per valutare lassociazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi (Video) | JoVE Journal

Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

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