Name: Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come attivare macrofagi pro-rigenerativi in co-colture con neuroni DRG usando cAMP. Questo metodo permette di ottenere fattori che promuovono la crescita dei neuriti per studiare meccanismi di rigenerazione nervosa.

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Questo protocollo è supportato da un grant NRF-2015R1A2A1A01003410 dal Ministero della scienza, ICT e pianificazione del futuro, Repubblica di Corea.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparazione del neurone dissociata DRG adulto
<ol><li>Prima di impostare le impostazioni cultura, pre-cappotto una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con 0,01% poli-D-lisina a 37° C per 2 h o a 4° C durante la notte. Quindi, lavare la piastra due volte con acqua distillata.</li>
	<li>Incubare la piastra con laminina soluzione ad una concentrazione di 3 µ g/mL per 2 h a temperatura ambiente e poi lavare la piastra due volte con acqua distillata. Asciugare la piastra a temperatura ambiente almeno per 1 h.</li>
	<li>Eutanasia di un topo in una camera di2 CO trasparente collegato al cilindro del gas compresso CO2 . Incidere la cute sovrastante la colonna vertebrale con una lama chirurgica e sezionare i muscoli paravertebrali bilateralmente per esporre le ossa vertebrali. Rimuovere le ossa vertebrali meticolosamente utilizzando una Pinza ossivora chirurgica con punta stretta fino a quando il DRG sono completamente esposti. Nota: I neuroni DRG adulto sono ottenuti da topi del maschio adulto C57BL6 di età compresa tra 8 settimane a 12 settimane di età.</li>
	<li>Rimuovere il DRGs bilateralmente da S1 tutta la strada fino al livello di C1 utilizzando iridectomy forbici e pinze a punta fine sotto un microscopio per dissezione. Provate a tagliare le radici interamente da DRGs al fine di ridurre al minimo la contaminazione delle cellule di Schwann o nei fibroblasti.</li>
	<li>Memorizzare il DRGs dissecato in una capsula di Petri contenente 5 mL di freddo di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) su ghiaccio fino a quando tutti i DRG sono raccolti di 60 mm. Nota: È fondamentale per sezionare il DRG più rapidamente possibile. La raccolta di tutti i DRG da un mouse non dovrebbe richiedere più di 30 min 30 min dopo l'eutanasia, interrompere la raccolta il DRGs e procedere al passaggio successivo, anche se ci sono ancora DRGs.</li>
	<li>Trasferire il DRGs un 1,5 mL provetta Eppendorf utilizzando un puntale blu (1000 µ l) con un fine di cut-off. Rimuovere il DMEM dopo un giro veloce per alcuni secondi usando una mini centrifuga. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente collagenasi XI di 125 U/mL tipo e incubare la provetta per 90 min con una delicata rotazione (35-40 giri/min) utilizzando un agitatore per twister in un incubatore a 37 ° C. Immobilizzare il tubo al piano di shaker utilizzando il nastro.</li>
	<li>Scartare DMEM contenente collagenasi e aggiungere 1 mL di DMEM fresco. Attendere che il galleggiante DRGs completamente sprofondare verso il basso e quindi rimuovere DMEM con i residui di tessuto. Ripetere questo passaggio di lavaggio almeno sei volte. Nota: Non tentare di eliminare il supernatante completamente. Fare attenzione a non rimuovere qualsiasi DRGs con il surnatante DMEM.</li>
	<li>Trasferire il DRGs in una provetta conica da 15 mL utilizzando un puntale blu (1000 µ l) con un fine di cut-off. Quindi pipettare su e giù delicatamente almeno 15 volte usando una punta di blu (1000 µ l) per fare una sospensione cellulare omogenea. Evitare di fare bolle e cercare di non toccare il fondo della provetta conica con un puntale.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 239 x g per 3 min e attentamente scartare il surnatante con detriti galleggianti. Aggiungere 1 mL di Neurobasal supplementato con B27 (2,0% v/v) e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù per 5 a 10 volte.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 70 µm sovrapposto nella parte superiore una provetta conica da 50 mL. Attendere 2 min e poi versare 27/B-Neurobasal medio sul filtro usando un pipettatore automatico.</li>
	<li>Tutti i neuroni DRG raccolti (un totale di circa 2 x 106 neuroni DRG da un mouse) su due pozzetti della piastra a 6 pozzetti della piastra. Neuroni DRG da un topo adulto coprono due pozzetti in una piastra a 6 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore a CO2 a 37 ° C fino a quando il macrofago co-culture.</li>
</ol>2. co-coltura dei macrofagi peritoneali principa P su un inserto di cultura cellulare
Nota: Stabilire la co-colture 4 h dopo la placcatura iniziale dei neuroni DRG dissociati
<ol><li>Macrofagi peritoneali primari sono preparati da topi del maschio adulto C57BL6 di età compresa tra 8 settimane a 12 settimane di età. Eutanasia di un animale in una camera di CO2 . Incidere la pelle dell'addome delicatamente, esporre il peritoneo ed evitare di tagliare il peritoneo per evitare una fuoriuscita del fluido di lavaggio.</li>
	<li>Perforare il peritoneo usando una siringa con un ago 22G e iniettare 10 mL di salin ghiacciata di tampone fosfato (PBS) nella cavità peritoneale. Massaggiare delicatamente il peritoneo per 1-2 min. Quindi, estrarre l'ago e spremere il PBS attraverso il sito di puntura dell'ago e raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta conica da 50 mL. Nota: Prima dell'uso, mettere la siringa sul ghiaccio per mantenere la freddezza di PBS.</li>
	<li>Centrifugare il fluido di lavaggio a 239 x g per 10 min a 4 ° C per appallottolare le componenti cellulari. Risospendere il pellet con 3 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC) per 3 min a temperatura ambiente. Poi Centrifugare la sospensione cellulare nuovo a 239 x g per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 3 mL di PBS e centrifugare la sospensione cellulare nuovo per rimuovere qualsiasi buffer di lisi RBC rimanenti. Nota: Assicurarsi che il buffer di lisi RBC viene completamente rimosso. In caso contrario buffer di lisi RBC rimanenti possono essere tossici per i macrofagi coltivati.</li>
	<li>Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di terreno Neurobasal/B-27. Piastra metà dei macrofagi raccolti tutti (un totale di 3 × 106 a 6 x 106 cellule) su una coltura cellulare inserire con l'area efficace di 4,2 cm2, che è posto sopra il pozzo di DRG dissociata. Nota: Durante il periodo di co-coltura, i macrofagi sono coltivati in terreno di coltura del neurone Neurobasal/B-27. Sopravvivenza adeguata dei macrofagi in questa circostanza è stata confermata.</li>
</ol>3. trattamento di Db-Camp e raccolta del macrofago CM
Nota: Iniziare il trattamento di db-cAMP 4 h dopo la co-colture di neuroni-macrofago.
<ol><li>Aggiungere 2 µ l di soluzione di db-cAMP 100 µM per il co-colture di neuroni-macrofago. Aggiungere lo stesso volume di PBS per un esperimento di controllo.</li>
	<li>Dopo 24 h, riempire un pozzo vuoto con 1 mL di terreno di coltura del macrofago nello stesso piatto 6 pozzetti. Trasferire l'inserto di cultura delle cellule nelle co-culture neurone-macrofago il pozzo vuoto con terreno di coltura del macrofago. Mantenere le cellule nella stessa circostanza per 72 h senza cambiare mezzo. Nota: Aggiungiamo solo 1 mL di terreno di coltura del macrofago durante CM collezione per rendere concentrato CM. Durante la raccolta di CM, se necessario, abbiamo aggiunto più per coprire completamente i macrofagi all'interno dell'inserto.</li>
	<li>Dopo 72 h, centrifugare il macrofago CM a 239 x g per 5 min rimuovere i componenti cellulari. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 µm per rimuovere eventuali detriti residui cellulari. Conservare i raccolti CM a-70 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>4. neuriti Assay con raccolti CM
<ol><li>Prima di impostare una cultura di neuroni DRG adulta separata, pre-cappotto una diapositiva 8 pozzetti camera seguendo la stessa procedura descritta in 1.1 e 1.2.</li>
	<li>Ottenere neuroni DRG adulti dissociati in Neurobasal supplementato con B27 utilizzando gli stessi metodi descritti da 1,3 a 1.10. 5 x 104 cellule per pozzetto sulla diapositiva prepatinato camera 8 pozzetti della piastra.</li>
	<li>Porre il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C per 2 h, permettendo che le cellule fissare alla parte inferiore. Quindi, sostituire il terreno di coltura con i CM scongelati che viene preriscaldato a 37 ° C. Nota: Fare attenzione a non toccare la parte inferiore della diapositiva 8 pozzetti camera quando si rimuove il terreno di coltura e aggiungendo i raccolti CM.</li>
	<li>15 h dopo la placcatura iniziale, rimuovere il supporto e lavare le cellule con PBS una volta. Quindi, aggiungere 200 µ l di soluzione di paraformaldeide 4% ghiacciata ai pozzetti e incubare le cellule con la soluzione di paraformaldeide per 20 min a 4 ° C Nota: La cultura di neuroni DRG per l'analisi di conseguenza del neurite dovrebbe essere precisamente limitata a 15 h. In questa circostanza, non c'è nessun apprezzabile neuriti.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS ghiacciata e quindi eseguire il blocco con 10% siero di capra normale (NGS) con 0,1% Triton-X per 30 min. Incubare le cellule fisse con soluzione di anticorpo primario (anti-Tuj-1) diluita con 10% NGS (ad una concentrazione di 1 µ g/mL) per 4 h a camera temperatura o durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS e poi incubare le cellule con anticorpo secondario (anti-capra murine) soluzione per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare due volte con PBS, quindi montare il vetrino di cultura con un vetrino coprioggetti (24 × 50 mm) utilizzando la soluzione di montaggio.</li>
	<li>Prendere immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare neuriti.</li>
</ol>

<ol><li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection%2C+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li>
<li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+neuroprotects%2C+reduces+microgliosis%2C+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li>
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<li>Barrette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+myeloid+cells+for+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement of myeloid cells for axon regeneration.</a> J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+macrophages+to+enhanced+regenerative+capacity+of+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+by+conditioning+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury.</a> J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).</li>
<li>Niemi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+near+axotomized+neuronal+cell+bodies+in+stimulating+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration.</a> J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).</li>
<li>Hannila, S. S., Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclic+AMP+signaling+in+promoting+axonal+regeneration+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).</li>
<li>Kwon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+monocyte+chemokine+CCL2+in+dorsal+root+ganglion+neurons+causes+a+conditioning-like+increase+in+neurite+outgrowth+and+does+so+via+a+STAT3+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism.</a> Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).</li>
<li>Cafferty, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li>
<li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici per la generazione di questo sistema di co-coltura. È importante garantire che i neuroni DRG mouse e macrofagi peritoneali sono preparati fresco e sano. Abbiamo sperimentato attività di conseguenza diminuita del neurite del CM quando la dissezione di tutti i DRG ha preso più di 30 min. Inoltre, la contaminazione di emocomponenti in macrofagi peritoneali inoltre ha condotto ad una diminuzione di attività la conseguenza del neurite in CM. Al fine di suscitare l'interazione neurone-macrofago...

Vari studi hanno cercato di migliorare la rigenerazione dell'assone di CNS dopo le lesioni del midollo spinale o del cervello. Reazioni infiammatorie, che inevitabilmente accompagnano le lesioni nel sistema nervoso, sono tradizionalmente pensate di partecipare a processi patologici secondari che conduce ai risultati deleteri1,2. Infatti, il methylprednisolone che possa sopprimere le reazioni infiammatorie è l'unica terapia approvata per acuta del midollo spinale lesioni3. Tuttavia, gli studi più recenti hanno fornito la prova che i macrofagi, un tipo di cellula infiammatoria rappresentative, possano partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso feriti4,5,6. Ad esempio, infiltrazione macrofagi seguendo una molecole pro-rigenerativa del produrre lesioni di lente per promuovere la rigenerazione dei neuroni ganglionari7,8. Inoltre, trapiantati neuroni DRG aumentata crescita assonale nella regione dove sono stati attivati i macrofagi di zymosan9. Inoltre, i macrofagi al luogo della lesione possono creare un ambiente permissivo in crescita per nervi periferici feriti10.
Il nostro lavoro anche fornito la prova ben fondata che i macrofagi possono contribuire alla capacità di rigenerazione dell'assone in neuroni adiacenti. Abbiamo dimostrato che l'attivazione dei macrofagi a livello dei gangli della radice dorsale (DRG) era essenziali per la capacità rigenerativa migliorata delle DRG neuroni sensoriali seguendo un precondizionamento periferico del nervo ferita11. Simile ricerca è stata segnalata in modo indipendente da un altro laboratorio12. Abbiamo anche dimostrato che l'iniezione intragangliari di dibutirrile AMP ciclico (db-cAMP), che è una molecola ben nota per migliorare la capacità di rigenerazione dell'assone13, ha indotto l'attivazione dei macrofagi. La disattivazione dei macrofagi ha abolito gli effetti di db-cAMP sull'attività di conseguenza del neurite. Lavori successivi identificati espressione indotta da lesione di CCL2 nei neuroni come un segnale per stimolare i macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa14,15.
In base ai risultati sperimentali sopra, abbiamo stabilito un modello in vitro simile ad eventi molecolari che si verificano in DRGs seguendo un precondizionamento ferita modello11,14. In questo modello, db-cAMP viene applicato alle co-culture neurone-macrofago suscitando intercellulare segnalazione che conduce all'attivazione dei macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa. Qui, descriviamo protocolli dettagliati mediante il quale possiamo generare i macrofagi che secernono fattori molecolari che promuovono neuriti (Figura 1). Questo modello sperimentale illustra un concetto che i macrofagi possono essere stimolati o indotti a sostenere la rigenerazione assonale dopo le lesioni al sistema nervoso. Il nostro modello sarà anche utile per studiare i meccanismi di segnalazione intercellulare che porta all'attivazione dei macrofagi pro-rigenerativa.

<table><tbody><tr><td>Inserto per colture cellulari membrana in PET trasparente 0,4&mu; m dimensione dei pori</td><td>Corning, Falcon</td><td>353090</td><td>Membrana in PET trasparente con 0,4-&mu; m dimensione dei pori, per piastra a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>70-&mu; m filtro cellulare</td><td>in nylon Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>vetrino di coltura a 8 pozzetti</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>con un'applicazione uniforme di poli-D-lisina tampone per</td></tr><tr><td>lisi dei globuli rossi</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Contenente l'1% di glutamax e l'1% di penicilina-streptomicina</td></tr><tr><td>B-27 integratore, senza siero</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina Bromidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 3', 5'-monofosfato ciclico, N6, O2'-dibutirril-, sale sodico</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% Siero di capra normale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chimico e Metallico Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti & Beta; III tubulina (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Anticorpo monoclonale di topo Anticorpo</td></tr> secondario <tr><td>IgG (H+L) di capra</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare CO2 incubatore</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td> <td>da dissezioneCarl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Twist shaker</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Sorvall</td><td>N/A Microscopio</td><td></td></tr><tr><td>confocale</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Forbici fini in acciaio inossidabile, 14 cm, curve, ad azione articolare singola</td></tr><tr><td>- Carburo di tungsteno e ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td> pinza Dumont #7 <td>affilata e seghettata</td></tr><tr><td></td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, curva</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>dritta, tagliente da 3 mm, affilata</td></tr><tr><td>Microcentrifuga Qualitron DW-41 Artisan Technology</td><td>Group</td><td>DW-41</td><td>Tensione di ingresso: 115VAC</td></tr></tbody></table>

neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

C'è forte evidenza che i macrofagi possono partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso danneggiato. Qui, descriviamo un protocollo in cui i macrofagi sono indotti a produrre condizionata medio (CM) che promuove la conseguenza del neurite. Neuroni gangliari (DRG) adulto radice dorsale sono acutamente dissociati e placcati. Dopo avere collegati stabilmente i neuroni, i macrofagi peritoneali sono co-coltivati su un inserto di cultura cellulare sovrapposto sullo stesso bene. Dibutyryl che amp ciclico (db-accampamento) viene applicato per la co-colture per 24 h, dopo di che la coltura delle cellule ins contenente i macrofagi viene spostato in un altro pozzo di raccogliere CM per 72 h. Il CM da co-colture trattate con db-cAMP, quando applicato a una cultura separata per la neuroni DRG adulta, esibisce l'attività di escrescenza robusto del neurite. Il CM ottenuto dalle colture del db-cAMP-trattati che consiste di tipo singola cella da solo, o neuroni DRG o dei macrofagi peritoneali, non ha esibito del neurite escrescenza attività. Questo indica che l'interazione tra macrofagi e neuroni è indispensabile per l'attivazione dei macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite in CM. Così, il nostro paradigma di co-coltura sarà anche utile per studiare segnalazione intercellulare nell'interazione neurone-macrofago per stimolare i macrofagi di essere dotato di un fenotipo pro-rigenerativa.

Descriviamo un protocollo che può generare i macrofagi in grado di secernere fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite. Il macrofago CM ottenuti da co-colture trattate con db-cAMP ha provocato neuriti robusto quando applicato a una cultura separata di neuroni DRG (Figura 2A). In confronto, CM ottenuti dalle co-culture PBS-trattati non ha indotto la conseguenza del neurite nella nostra durata coltura 15h (Figura 2B</strong...

Il protocollo attuale presenta procedure sperimentali per stimolare macrofagi coltivati a essere dotati di capacità di rilasciare fattori molecolari che promuovono la conseguenza del neurite. Trattamento dell'accampamento per la co-colture di neuroni-macrofago induce i macrofagi a produrre medium condizionato che possiede l'attività la conseguenza del neurite forte.

Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare macrofagi in grado di secernere fattori molecolari che promuovono la crescita dei neuriti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come neuroni e macrofagi interagiscono tra loro per attivare il macrofenotipo pro-rigenerativo per promuovere un'eccellente rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizziamo l'AMP ciclico, una molecola sierica di adenosina, che è un enzima molto più fisiologico, utilizzato in studi precedenti per stimolare i macrofagi con il fenotipo pro-rigenerativo.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che l'attivazione dei macrofagi è essenziale per il miglioramento della capacità di crescita degli assioni e che questi possono produrre eccellenti neuroni dopo la precauzione nella lesione permanente del lobo. Prima di impostare la coltura, precodificare una piastra a sei pozzetti con poli-D Lycine e laminina. Quindi, incubare la piastra a sei pozzetti con 0,01 poli-D Lycine a 37 gradi Celsius per due ore o a quattro gradi Celsius durante la notte.Successivamente, lavare il piatto due volte con acqua distillata. Quindi incubare la piastra con una soluzione di laminina a una concentrazione di tre microgrammi per millilitro per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare la piastra due volte con acqua distillata e asciugare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora.Ora, incidi la pelle sovrastante la colonna vertebrale di un topo soppresso con una lama chirurgica e seziona bilateralmente la coppia di muscoli vertebrali per esporre le ossa vertebrali. Rimuovere meticolosamente le ossa vertebrali utilizzando un rongeur chirurgico a punta stretta fino a quando i DRG non sono completamente esposti. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere il DRG bilateralmente da S1 fino al livello C1 utilizzando forbici per iridectomia e pinze a punta fine.Trasferire il DRG in una provetta eppendorf da 1,5 millilitri utilizzando un puntale per pipetta blu con un'estremità tagliata. Quindi rimuovere il DMEM dopo una centrifuga veloce per alcuni secondi utilizzando una minicentrifuga. Aggiungere un millilitro di DMEM contenente 125 unità per millilitro di collagene di tipo 11 e incubare la provetta per 90 minuti con una leggera rotazione utilizzando un agitatore twister a 37 gradi Celsius.Successivamente, scartare la collagenasi contenente DMEM e aggiungere un millilitro di DMEM fresco. Trasferire il DRG in una provetta conica da 15 millilitri utilizzando un puntale per pipetta blu con un'estremità tagliata. Quindi pipettare delicatamente su e giù almeno 15 volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea.Centrifugare la provetta a 239 G per tre minuti e gettare con cura il surnatante con detriti galleggianti. Aggiungere un millilitro di terreno di neurobasilico integrato con B27 e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù da cinque a dieci volte. Successivamente passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri sovrapposto sopra un tubo conico da 50 millilitri.Quindi piastra tutti i neuroni DRG raccolti su due pozzetti della piastra a sei pozzetti. Per preparare i macrofagi peritoneali primari da un topo adulto, incidere delicatamente la pelle addominale per esporre il peritoneo ed evitare di tagliare il peritoneo per evitare una fuoriuscita di liquido di lavaggio. Successivamente, pungere il peritoneo utilizzando una siringa con un ago calibro 22 e iniettare 10 millilitri di PBS ghiacciato nella cavità peritoneale.Massaggiare delicatamente il peritoneo per uno o due minuti. Quindi estrarre l'ago e spremere il PBS attraverso il sito di puntura dell'ago e raccogliere il liquido di lavaggio in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare il liquido di lavaggio a 239 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i componenti cellulari.Successivamente risospendere il pellet con tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 239 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere le cellule pellettate in un millilitro di terreno di neurobasilico B27.Piastra metà di tutti i macrofagi raccolti su un inserto di coltura cellulare con l'area effettiva di 4,2 centimetri quadrati, che viene posizionato sopra il pozzetto di DRG dissociato. Quattro ore dopo che i macrofagi neuronali sono stati co-coltivati, aggiungere due microlitri di soluzione di amp ciclico DB 100 micromolari alle co-colture di macrofagi neuronali. Dopo 24 ore, riempire un pozzetto vuoto con un millilitro di terreno di coltura per macrofagi nella stessa piastra a sei pozzetti.Trasferire l'inserto di coltura cellulare nella co-coltura di macrofagi neuronali nel pozzetto vuoto con terreno di coltura per macrofagi. Dopo 72 ore, centrifugare il terreno condizionato con macrofagi a 239 volte g per cinque minuti per rimuovere i componenti cellulari. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali detriti cellulari residui.In questa procedura, prerivestire un vetrino a otto pozzetti con poli-D luccina e laminina. Quindi ottenere i neuroni DRG adulti dissociati e il mezzo neurobasilico, integrati con B27 utilizzando gli stessi metodi descritti in precedenza. Piastra cinque volte 10 alle quattro celle per pozzetto su un vetrino a camera a otto pozzetti prerivestito.Quindi, posizionare il vetrino della camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore, consentendo alle cellule di attaccarsi al fondo. Quindi sostituire il terreno di coltura con il terreno scongelato e condizionato che viene preriscaldato a 37 gradi Celsius. 15 ore dopo la placcatura iniziale, rimuovere il terreno e lavare le cellule con PBS una volta, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione di paraformaldeide ghiacciata al 4% nei pozzetti e incubare le cellule con la soluzione di paraformaldeide per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, incubare le cellule fissate con una soluzione di anticorpi primari diluita con siero di capra normale al 10% per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, scatta immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare la crescita dei neuriti. Il terreno condizionato con macrofagi ottenuto dalle co-colture trattate con AMP ciclico DB ha provocato una robusta crescita di neuriti quando applicato a una coltura di neuroni DRG separata.In confronto, il terreno condizionato ottenuto dalle co-colture trattate con PBS non ha indotto la crescita dei neuriti. Quando l'AMP ciclico DB viene trattato con la coltura con il solo macrofago, il terreno condizionato non è risultato efficace nel sostenere la crescita dei neuriti. Ciò suggerisce che l'interazione neurone-macrofagica è indispensabile per stimolare i macrofagi a essere dotati di una capacità pro-rigenerativa.Abbiamo anche testato il terreno condizionato ottenuto da una coltura di soli neuroni trattati con AMP ciclico DB e non abbiamo riscontrato alcuna crescita di neuriti. È importante ricordare che i neuroni e le micropiastre devono essere preparati freschi e sani. Abbiamo sperimentato una diminuzione dell'attività di crescita dei neuriti del mezzo costante quando la dissezione è durata troppo a lungo o i macrofagi del peritoneo sono stati contaminati da componenti del sangue.In questo protocollo, i neuroni DRG dissociati sono stati separati fiscalmente dai macrofagi sull'inserto della coltura cellulare. Pertanto, il nostro sistema di co-coltura consentirà l'identificazione di fattori cellulari responsabili della segnalazione intercellulare che mediano l'attivazione di macrofagi completamente rigenerativi.

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Abbiamo sviluppato un nuovo multi-comparto dei neuroni co-coltura piattaforma microsistema in vitro SNC assone-glia di ricerca interazione. La piattaforma è in grado di condurre fino a sei esperimenti indipendenti, in parallelo ed è stato fabbricato utilizzando una nuova concezione macro / micro metodo ibrido fabbricazione.

Un multi-vano SNC Neuron-glia Co-cultura Microfluidic piattaforma

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo video mostra la co-coltura di neuroni gangliari e macrofagi murini della radice dorsale. I neuroni vengono seminati su una piastra rivestita, mentre i macrofagi vengono raccolti da un topo soppresso, trattati e aggiunti all'inserto di coltura. Il trattamento con db-cAMP attiva i neuroni e spinge i macrofagi ad adottare un fenotipo pro-rigenerativo per supportare la crescita neuronale.

Sviluppo di una cocoltura di neuroni e macrofagi in vitro

Questo video mostra un test per promuovere la crescita delle proiezioni neuronali note come crescita neurite utilizzando il mezzo condizionato dai macrofagi. Co-coltura di neuroni e macrofagi con cAMP e raccolta del terreno condizionato derivato dai macrofagi. La crescita dei neuroni con il mezzo condizionato favorisce l'escrescenza di neuriti. Queste escrescenze vengono marcate in fluorescenza e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Utilizzo di un mezzo condizionato con macrofagi per promuovere le estensioni neuronali

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura di neuroni indotti umani (iNs) e cellule precursori di oligodendrociti indotti (iOPC). Gli iN vengono mescolati con iOPC in una co-coltura e poi incubati per supportare la maturazione di entrambi gli iN in neuroni e degli iOPC in oligodendrociti. I neuroni formano connessioni sinaptiche con altri neuroni e oligodendrociti, mentre gli oligodendrociti sviluppano guaine mieliniche attorno agli assoni dei neuroni.

Un metodo di co-coltura per modellare le interazioni neurone-oligodendrocita

Negli organismi pluricellulari, i fattori solubili secreti suscitano risposte da diversi tipi di cellule come risultato della segnalazione paracrina. I sistemi di co-coltura in insert offrono un modo semplice per valutare i cambiamenti mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Scopri come attivare macrofagi pro-rigenerativi in co-colture con neuroni DRG usando cAMP. Questo metodo permette di ottenere fattori che promuovono la crescita dei neuriti per studiare meccanismi di rigenerazione nervosa.

Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

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