Name: Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri come coltivare enteroidi da intestino neonatale di topo o umano per studiare gli effetti del latte materno sulla proliferazione cellulare intestinale. Questo modello ex vivo aiuta a comprendere malattie gastrointestinali.

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MG è sostenuta da sovvenzioni, K08DK101608 e R03DK111473 il National Institutes of Health, marzo Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, i bambini Discovery Institute di Washington University e St. Louis Children Hospital e il dipartimento di Pediatria presso la Washington University School di medicina, St. Louis. CJL è supportato da R01DK104946 (PI: Silverman), ospedale Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children.

Tutte le procedure di animale in questo studio sono state approvate dall'Università di Washington a St. Louis istituzionale Animal Care e uso Comitato (protocollo 20160187) o uso Comitato (protocollo 14103918) e Università di Pittsburgh istituzionali cura degli animali. Intestino tenue umano fetale a meno di 24 settimane di gestazione è stata ottenuta in conformità degli orientamenti di appalti tessuto anatomico Università di Pittsburgh dopo approvazione Institutional Review Board (protocollo PRO14100537) presso l'Università di Banca di tessuti di Pittsburgh salute Scienze attraverso un sistema onesto mediatore. De-identificati latte umano o latte materno pastorizzato donatore è stato ottenuto con una rinuncia di consenso da parte dell'Università di Pittsburgh Institutional Review Board.
1. cripta isolamento e istituzione di Enteroids da topi neonatali o intestino tenue umano precoce
<ol><li>Preparazione dei terreni Nota: Media dovrebbe essere preparato nella cappa il giorno prima isolamento cripta.<ol>
<li>Preparare terreni di coltura L 1,11. Iniziare con 1 L esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosio e L-Glutammina e aggiungere 110 mL siero bovino fetale (FBS) (concentrazione finale 10%), 11 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale) e 1,1 mL sterile insulina (finale concentrazione 0,1%).</li>
		<li>Preparare 500 mL di miscela di PBS-antibiotico. Iniziare con 500 mL 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 10% FBS e aggiungere 5 mL di gentamicina (concentrazione finale 1%), amfotericina B (concentrazione finale 0,2%), da 1 mL e 5 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale).</li>
		<li>Preparare 30 mL cella perturbazione Media #1. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere acido di 600 µ l 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).</li>
		<li>Preparare 30 mL cella perturbazione Media #2. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere 300 µ l 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).</li>
		<li>Preparare terreni di coltura 50ml cripta senza fattori di crescita. Misurare 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e aggiungere 10 mL FBS (concentrazione finale 20%).<ol>
<li>Aggiungere 500 µ l penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 supplemento, 1 mL 50 x privo di siero supplemento (ad esempio, B-27) meno vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 1 mL di coltura di cripta con fattori di crescita. In primo luogo preparare 1 mL della cripta di coltura senza fattori di crescita. Aggiungere 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentrazione finale 500 ng/mL) ed EGF di 0,5 µ l 100 µ g/mL (concentrazione finale di 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento della cripta
	<ol>
<li>Posto solubilizzato Estratto di membrana dello scantinato (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio per scongelare prima di iniziare. Nota: Polimerizzerà della membrana dello scantinato di tenere il ghiaccio o si.</li>
		<li>In conformità con il protocollo istituzionale Animal Care e uso Comitato per topi superiori a 14 giorni di età, eutanasia topi con due metodi di eutanasia con la seconda essendo una procedura per garantire la morte fisica. Nota: Per i topi sotto i 14 giorni di età, decapitazione è la procedura standard, usando le forbici.</li>
		<li>Con delle forbici, pinze, praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per tutta la lunghezza dell'addome. Asportare il piccolo intestino dallo stomaco all'intestino cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le pinzette. Nota: Due-settimana-vecchio maschio e femmina C57BL/6J mouse pups, ogni peso di 5,5-7 g, sono stati utilizzati per l'isolamento di cripta. Qualsiasi età o dimensione del mouse può essere utilizzato per l'isolamento di cripta.</li>
		<li>Preparare appena raccolte nell'intestino tenue per l'isolamento di cripta, intestino posizione diritta, e tagliare l'intestino longitudinalmente lungo tutta la sua lunghezza usando le forbici. Nota: Mouse e intestino umano possono essere preparati allo stesso modo.</li>
		<li>Sgabello pulito fuori intestino agitando delicatamente l'intestino in avanti e indietro in una capsula Petri miscela di PBS-antibiotico-riempito usando il forcipe.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di cella perturbazione Media n. 1 a una provetta conica da 50 mL. Tagliare l'intestino in pezzi di lunghezza di 0,5 cm direttamente nella provetta. Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.</li>
		<li>Mentre i tessuti sono sull'agitatore, ottenere 24 o 48 pozzetti piastre per crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per l'isolamento di proteine, DNA o RNA. Uso camera 8 pozzetti diapositive a crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per intero montare imaging confocale.</li>
		<li>Nella cappa, aggiungere 15 µ l della membrana dello scantinato nella parte inferiore di ciascun pozzetto della piastra 24 o 48 pozzetti. Se utilizzando camera diapositive, aggiungere 9 µ l della membrana dello scantinato alla parte inferiore di ogni camera. Nota: Regolare il volume della membrana dello scantinato in base alle dimensioni della piastra se necessario.</li>
		<li>Si diffuse rapidamente la membrana dello scantinato con la punta della pipetta in modo che la membrana dello scantinato forma uno strato sottile sul fondo del pozzo. Posizionare la piastra a 37 ° C in incubatrice per 30 minuti consentire la membrana dello scantinato polimerizzare. Nota: Le cripte non verranno collegato se non uno strato sottile della membrana dello scantinato è o se membrana basale contiene bolle d'aria.</li>
		<li>Dopo 15 minuti su un agitatore, filtrare il tessuto attraverso un colino di 100 µm. Scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL cella perturbazione Media n. 2 una nuova provetta conica 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta.</li>
		<li>Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.</li>
		<li>Dopo 15 minuti sull'agitatore, filtro tessuto attraverso un colino di 100 µm. Mantenere il flusso attraverso a questo punto, nel caso in cui il rendimento è basso nei passaggi successivi. Nota: Tutto il flusso attraverso i tubi dovrà essere tenuto al ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosio e L-glutammina ad un nuovo tubo conico di 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta. Vigorosamente agitare il tubo a mano per 10 s. filtro attraverso un colino di 100 µm e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere fino a quando il flusso attraverso non contiene particolato.</li>
		<li>Nella cappa, filtrare il flusso attraverso il passaggio precedente in una nuova provetta conica 50 mL utilizzando 70 µm colini per mouse tessuto o 100 µm colini per tessuto umano. Nota: Avere filtri supplementari in standby e versare lentamente come filtri si intasano con detriti.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 200 x g per 8 min a 4 ° C e posto direttamente in un secchio di ghiaccio nella cappa. Eliminare il surnatante mediante pipetta senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet con totale quantità desiderata di cripta cultura Media senza fattori di crescita. Nota: Le cripte arricchite sono lo strato 'sabbioso' del pellet. Ognuno richiede ben 250 µ l di cripta cultura Media senza fattori di crescita.</li>
	</ol></li>
	<li>Stabilimento di enteroids
	<ol>
<li>La miscela di media cripta direttamente sulla membrana basale della piastra.</li>
		<li>Verifica cripte con un microscopio per garantire isolamento processo è stato completato. Nota: Sfere delle cellule e le cellule sono desiderate. Circa 100 singoli cripte sono placcati per pozzetto.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h per consentire cripte di aderire alla membrana basale. Nota: al termine dell'incubazione è con cripta cultura Media senza fattori di crescita.</li>
		<li>Rimuovere lentamente il media e cripte in eccesso che non è riuscito a collegare utilizzando una pipetta P-200. Nota: Non disturbare la membrana basale come le cripte associate possono diventare sloggiate.</li>
		<li>Lentamente aggiungere 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita ad ogni pozzetto. Nota: Per 24-48 pozzetti, o camera scivoli, 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita è sufficiente.</li>
		<li>Sostituire i media ogni 2 giorni con fresco cripta cultura Media con fattori di crescita per 5 giorni prima trattamenti per consentire per la crescita e fissaggio ottima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mouse raccolta per latte materno
<ol><li>Separare una diga che allattano C57BL/6J al post-partum 7-12 giorni da suoi cuccioli per 6 h prima della mungitura.</li>
	<li>Anestetizzare la diga in allattamento con isoflurano tramite un cono di naso e somministrare un'iniezione sottocutanea di ossitocina a 0,15 UI/kg di peso corporeo. Aspettare 3 minuti prima di tentare la procedura di mungitura.</li>
	<li>Pulire le tettarelle con etanolo al 70% prima della procedura di mungitura e lasciare asciugare.</li>
	<li>Estrarre il latte dal tettarelle uno alla volta utilizzando una pompa di seno umano con tubazione del silicone ridimensionata di tettarelle del mouse in una provetta di raccolta di 5 mL. Nota: Ottimale del seno pompe hanno due impostazioni, uno per la velocità e uno per l'aspirazione. Si consiglia di iniziare con le impostazioni più basse di ciascuno e aumentare entrambi lentamente fino a quando il latte viene estratto. Idealmente, la resa totale sarà ~ 500 µ l - 1 mL di latte materno del mouse per diga durante l'allattamento.</li>
	<li>Latte materno immediatamente aliquotare e conservare a-80 ° C. Nota: Evitare di gelo/disgelo cicli.</li>
	<li>Trattare enteroids il giorno 5 con 50 µ l/mL di latte materno del mouse / mL di terreni di coltura di cripta con fattori di crescita per 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. tutto montare macchiatura di Enteroids
<ol><li>
Preparazione dei reagenti
	<ol>
<li>Preparare 16 mL di PBS 1X a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 4% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 0,1% Triton X-100 in 1X PBS a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 24 mL PBS Tween (PBST è 0.1% Tween 20 in 1X PBS) a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 10% donkey normale siero (NDS) in 0,1% PBST (10% NDS/PBST) a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 4 mL 1% NDS nello 0,1% PBST (1% NDS/PBST) a 8 pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 ° giorno di colorazione
	<ol>
<li>Aspirare i trattamenti e lavare enteroids con PBS. Aggiungere 250 µ l 4% PFA per pozzetto. Posizionare il rotatore per 1-2 ore a 4 ° C. Rimuovere i 4% PFA con pipetta.</li>
		<li>Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 10 min a temperatura ambiente (TA). Nota: È possibile memorizzare piastra per 1-2 giorni a 4 ° C se necessario.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto 0.1% Triton X-100. Incubare per 1 h a RT. Remove 0.1% Triton X-100 con pipetta.</li>
		<li>Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto 10% NDS/PBST. Incubare per 45 min a RT. Remove 10% NDS/PBST con pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto primaria dell'anticorpo, diluito 1/250 a 1% NDS/PBST e incubare per una notte a 4 ° C. Nota: La diluizione di anticorpo ottimale varia a seconda del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Giorno 2 di colorazione
	<ol>
<li>Lavare almeno 5 volte per 4-5 h con 250 µ l/pozzetto PBST. Mettere sull'agitatore a 4 ° C tra ogni lavaggio.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto secondaria dell'anticorpo, diluito 1/1.000 a 1% NDS/PBST. Avvolgere la piastra in un foglio e incubare per una notte a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 ° giorno di colorazione
	<ol>
<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto nucleare macchia 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per 15 min. Nota: Tenere la piastra al buio.</li>
		<li>Lavare 6 volte con 250 µ l/pozzetto PBST. Posizionare il rotatore per 10 min a 4 ° C tra ogni lavaggio.</li>
		<li>Vetrino coprioggetti Mount sulla camera slide con supporti di montaggio.</li>
		<li>Prendere le immagini con un 40x microscopio confocale oggettivo e ugualmente il rendering in un editor di grafica raster (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori hanno nulla da divulgare e senza conflitti di interesse.

L'epitelio intestinale è composto di molti sottotipi cellulari che sono responsabili per fornire la difesa ospite contro gli agenti patogeni, mantenendo l'integrità della barriera dell'intestino e possono essere violati nella patogenesi di diverse malattie. Mentre modelli animali possono ricapitolare alcuni aspetti della malattia, il modello ex vivo di enteroids derivato dall'intestino tenue dei topi e gli esseri umani fornisce una piattaforma per testare gli effetti dei vari trattamenti. Il significato del mode...

Enterocolite necrotizzante (NEC) è la principale causa di morte per malattie gastrointestinali in bambini prematuri, che interessano quasi 1 in 10 neonati nati prima delle 29 settimane gestazione1,2,3. Metà degli infanti con progresso NEC per la forma più grave, dove la sopravvivenza è solo 10-30%4,5. Negli Stati Uniti, circa 2 miliardi di USD/anno sono spesi nel trattamento di neonati con NEC6,7, eppure terapia né il tasso di sopravvivenza è cambiato nel corso degli ultimi 30 anni. La patogenesi di NEC è caratterizzata dalla lesione intestinale e alterata mucosa guarigione8,9,10,11, tuttavia, le vie di segnalazione che portano a un esacerbato meccanismi per invertire l'infiammazione e la risposta infiammatoria rimangono in modo incompleto capiti.
La somministrazione di latte materno umano è stata trovata per essere la strategia solo protettiva contro NEC per bambini prematuri. Precedentemente abbiamo indicato che il latte materno protegge dallo sviluppo di NEC attraverso l'inibizione del recettore toll-like receptor immune innata 4 (TLR4) nell'epitelio intestinale attraverso il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) signaling pathway11. Il completamento del latte materno per una formula sperimentale di NEC ha attenuato la risposta infiammatoria vista in NEC come dimostrato dall'inibizione dell'apoptosi degli enterociti e restauro di proliferazione degli enterociti in un modo che era dipendente da sviluppo epidermico Factor (EGF) ed EGFR11. In un altro studio, è stato dimostrato che nitrato, un altro componente del latte materno, contribuisce alla sua natura protettiva modulando l'aspersione intestinale, rispetto al latte artificiale, che è carente di nitrato e può contribuire alla frequenza aumentata di NEC in Formula infanti alimentati12,13. Altri composti presenti nel latte materno che sono stati indicati per essere coinvolti nella protezione contro NEC includono gli oligosaccaridi del latte umano, L-arginina, glutamina e lattoferrina14,15,16, 17,18,19. Questi elementi benefici del latte materno rivelano la necessità del suo utilizzo nella prevenzione del NEC, ma anche sottolineano l'importanza di studiare i meccanismi, i percorsi e gli effetti cellulari coinvolte nel come il latte materno è mediare la protezione contro il NEC di segnalazione .
In ordine per studiare ulteriormente le proprietà protettive del latte materno in un modello murino di NEC, abbiamo sviluppato una tecnica di romanzo, facile da usare di mouse che il latte materno può essere estratta da una diga anestetizzata usando un seno umano elettrica pompa11,12 . Questa strategia di acquisizione di latte materno del mouse è vantaggiosa, non solo perché pompe del seno umano sono prontamente disponibili ed efficienti nell'approvvigionamento di latte materno, ma anche perché permette questo metodo di analisi del latte al seno specie-specifici. Di conseguenza, abbiamo possibile confrontare gli effetti del latte materno del mouse con quelle del latte materno umano espresso così come donatore umano latte pastorizzato di una banca del latte nei modelli specifici della specie. Questa tecnica consente lo studio dei componenti di latte del seno in relazione al loro contributo alla prevenzione di NEC. Altri ricercatori hanno sviluppato metodi di estrazione del latte materno, tuttavia, queste tecniche sono manuali e in genere richiedono più di un laboratorio membri20,21,22. Qui è presentata una tecnica semplice che può essere utilizzata modificando un tiralatte elettrico umano per raccogliere il latte da un mouse. Questa tecnica può essere applicata anche ad altre specie.
Per interrogare adeguatamente le vie di segnalazione coinvolte con NEC, sono necessari sistemi di modello per valutare tutti i tipi differenti delle cellule, noti per essere interessati nel processo di malattia. Qui, discutiamo uno tale sistema modello - enteroids - e della loro istituzione da mouse e intestino tenue umano. Enteroids intestinale umano (HIEs) forniscono in particolare promessa significativa, perché offrono un innovativo, geneticamente vario ex vivo modello umano per aiutare nello studio dei processi patofisiologici che avvengono nel tratto gastrointestinale 23. Enteroids sono stati trovati per essere coltivato a lungo termine e può essere congelato per più tardi uso23, e a differenza di Organoids intestinale umano (HIOs), cui culture sono sviluppate da cellule staminali pluripotenti inducibile, enteroids vengono generati da cellule staminali all'interno di cripte intestinali isolato24. Enteroids richiede meno manutenzione, può essere infettato rapidamente25e possono essere create facilmente poiché cripte intestinali sono più differenziati oltre HIOs23. Di conseguenza, HIEs offrono molti vantaggi rispetto alle tecniche esistenti perché possono essere sviluppati per esporre le proprietà specifiche dell'area compositiva e funzionale dell' epitelio gastrointestinale umano23. L'uso di enteroids è una scelta altamente efficace quando hanno bisogno di un modello umano dell'intestino, con l'osservanza delle limitazioni di regione-specific e facilità d'uso. Qui dimostriamo la tecnica di isolare e mantenere primari derivati da cellule staminali piccolo intestinale enteroids da topi e bambini prematuri umani.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (insulina)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano sulfonato acido (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Integratore meno vitamina A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inibitore Y-27632, dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Wnt3a di topo ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Noggin murino</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico murino ricombinante (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita Matrigel Matrice di membrana basale ridotta</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Piastra di Petri per colture cellulari</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>Cella a 48 pozzetti Piastra di coltura</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di vetrini a camera Nunc Lab-Tek II a 8 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M Filtro per cellule sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Filtro per cellule sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide (PFA)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Asino normale Siero (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G Ago da 1,5 pollici</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Ossitocina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Tiralatte elettrico doppio umano</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a fondo tondo da 5 ml</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>tappi in gomma</td><td>Frey</td><td>Scientific 560761</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Umano Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

latte materno aumenta la crescita di enteroids: un modello ex vivo di proliferazione delle cellule

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Enteroids intestinale piccolo umano sono derivate dalle cripte e quando coltivate in una nicchia staminale contengono tutti i tipi delle cellule epiteliali. La capacità di stabilire sistemi di coltura ex vivo enteroid umano sono importanti di patofisiologia intestinale di modello e di studiare il particolare risposte cellulari coinvolti. Negli ultimi anni, enteroids da topi e gli esseri umani sono in coltura, secondarie e sopraelevate distanza per un utilizzo futuro in diversi laboratori in tutto il mondo. Questa piattaforma di enteroid può essere utilizzata per testare gli effetti di vari trattamenti e farmaci e quali effetti sono esercitati sui tipi differenti delle cellule nell'intestino. Qui, un protocollo per stabilire primari derivati da cellule staminali piccolo enteroids intestinale derivato dai topi neonatali e prematuro intestino umano è fornito. Inoltre, questo sistema di coltura di enteroid è stato utilizzato per testare gli effetti del latte materno specie-specifici. Latte materno del mouse può essere ottenuto in modo efficiente utilizzando una pompa di seno umano modificate e latte espresso del mouse può essere utilizzato quindi per ulteriori esperimenti di ricerca. Ora dimostriamo gli effetti del mouse espresso, umano, e latte materno donato sulla crescita e sulla proliferazione di enteroids derivati da topi neonatali o intestino tenue umano precoce.

Abbiamo innanzitutto cercato di indagare se espresso latte materno o latte materno pastorizzato donatore ha avuto un effetto sul piccolo enteroids intestinale. Infatti, latte materno e latte materno donato ha aumentato la crescita del mouse neonatale (Figura 1A) e prematuro umana derivata enteroids (Figura 1B).
Dal momento che il latte materno ha aumentato la crescita d...

Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.

Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare in laboratorio budelli in miniatura, chiamati enteroidi. Gli enteroidi vengono trattati con latte materno di topo estratto in laboratorio per chiarire gli effetti del latte materno sulla proliferazione in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative a varie malattie gastrointestinali, come l'enterocolite necrotizzante, che colpisce i neonati prematuri.Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli enteroidi richiedono poca manutenzione, possono essere stabiliti rapidamente e mostrano molte delle proprietà funzionali dell'epitelio gastrointestinale. Questa tecnica di stabilire gli enteroidi è un modello molto efficace dell'intestino tenue umano. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'intestino tenue, può anche essere applicato ad altri sistemi di organi in altre regioni del tratto gastrointestinale.Per iniziare, scongelare l'estratto solubilizzato della membrana basale su ghiaccio. Quindi, usa forbici e pinze per praticare un'incisione verticale lungo l'intera linea mediana addominale di un topo soppresso. Usando una pinza, asportare l'intestino tenue e rimuovere il mesentere.Per preparare l'intestino tenue per l'isolamento della cripta e la creazione di enteroidi, posizionare l'intestino dritto e utilizzare le forbici per tagliare longitudinalmente per tutta la sua lunghezza. Rimuovere le feci scuotendo delicatamente l'intestino con una pinza in una capsula di Petri riempita con una miscela di antibiotici PBS. Quindi, aggiungere 30 millilitri di terreno di disgregazione cellulare numero uno a una provetta conica da 50 millilitri.Metti i segmenti di intestino di mezzo centimetro nel tubo e metti il tubo in un secchiello del ghiaccio su uno shaker. In una cappa, aggiungere 9 microlitri di membrana basamentale sul fondo di ciascun pozzetto in un vetrino a camera a otto pozzetti. Stendere rapidamente la membrana con la punta di una pipetta e lasciare che la membrana del basamento polimerizzi in un incubatore.È importante stendere rapidamente la membrana basale in modo che formi uno strato sottile sul fondo del pozzo. Le cripte non si attaccheranno se sono presenti bolle d'aria o se la membrana del basamento è troppo spessa. Dopo aver agitato il tubo conico, utilizzare un colino da 100 micrometri per filtrare il tessuto della membrana ed eliminare il flusso.Aggiungere 30 millilitri di terreno di disgregazione cellulare numero due a una nuova provetta conica da 50 millilitri, quindi aggiungere il tessuto intestinale alla provetta. Dopo aver agitato la provetta per 15 minuti, filtrare il tessuto attraverso un colino da 100 micrometri. Mantenere il flusso da questo passaggio.Aggiungere 15 millilitri di TMEM con 4,5 grammi per litro di glucosio e L-glutammina a un nuovo tubo conico. Rimuovere il tessuto dal colino da 100 micrometri e aggiungerlo al nuovo tubo conico. Quindi, agitare manualmente la provetta per 10 secondi e filtrare con un colino da 100 micrometri.Nella cappa, utilizzare un colino da 70 micrometri per filtrare il tessuto in un nuovo tubo conico. Dopo aver centrifugato la provetta per 8 minuti, metterla in un secchiello per il ghiaccio nella cappa. Utilizzare una pipetta per rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet formato.Risospendere il pellet con una quantità appropriata di terreno di coltura per cripta senza fattori di crescita. Dopo aver incubato il vetrino della camera per 30 minuti, impiattare la miscela di terreno della cripta direttamente sulla membrana del basamento e incubare a 37 gradi Celsius per 3 ore mentre le cripte aderiscono. Dopo il periodo di incubazione, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere con cura qualsiasi terreno e cripte non attaccate.Un altro passaggio fondamentale consiste nell'assicurarsi di rimuovere lentamente i terreni e le cripte in eccesso che non sono riusciti ad attaccarsi utilizzando una pipetta P200. Non disturbare la membrana del seminterrato, poiché le cripte annesse possono staccarsi. Aggiungere lentamente 250 microlitri di terreno di coltura criptata con fattori di crescita a ciascun pozzetto.Anestetizzare una madre in allattamento con isoflurano erogato attraverso il cono nasale e somministrare la dose appropriata di ossitocina sottocutanea. Pulire i capezzoli con etanolo al 70% e lasciarli asciugare prima di iniziare la procedura di mungitura. Utilizzando un tiralatte elettrico umano dotato di un tubo in silicone dimensionato per adattarsi ai topi e un tubo da 5 millilitri, estrarre il latte dai capezzoli uno alla volta.Infine, aliquotare immediatamente il latte e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Trattare gli enteroidi il quinto giorno con latte materno di topo conservato per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il primo giorno di colorazione, utilizzare la PBS per rimuovere i trattamenti sperimentali e lavare gli enteroidi.Aggiungere 250 microlitri di PFA al 4% in ogni pozzetto e posizionare il vetrino su un rotatore per 1 o 2 ore a 4 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta per rimuovere il PFA e poi lavare delicatamente ogni pozzetto quattro volte con 250 microlitri di PBS. Posizionare il vetrino della camera su un rotatore per 10 minuti a temperatura ambiente.Aggiungere 250 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% in ogni pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere il Triton X-100 con una pipetta e lavare quattro volte con 250 microlitri di PBS in ogni pozzetto. Posizionare il vetrino su un rotatore per 15 minuti a temperatura ambiente.Aggiungere 250 microlitri di 10% NDS/PBST in ogni pozzetto e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere l'NDS/PBST con una pipetta. Infine, aggiungere 250 microlitri di anticorpi primari diluiti a ciascun pozzetto e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.Il secondo giorno di colorazione, lavare ogni pozzetto almeno cinque volte con 250 microlitri di PBST e posizionare il vetrino su un rotatore a 4 gradi Celsius tra un lavaggio e l'altro. Aggiungere 250 microlitri di anticorpo secondario diluito in NDS/PBST all'1% in ciascun pozzetto. Avvolgere il vetrino in un foglio e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.L'ultimo giorno di colorazione, aggiungere 250 microlitri di DAPI colorato con nucleare a ciascun pozzetto e lasciarlo riposare per 15 minuti. Quindi, lavare ogni pozzetto sei volte con 250 microlitri di PBST. Posizionare il vetrino su un rotatore per 10 minuti a 4 gradi Celsius tra un lavaggio e l'altro.Infine, preparare il vetrino per l'imaging microscopico montando un vetrino coprioggetto sul vetrino da camera con il supporto di montaggio e lasciandolo asciugare per 24 ore. In questo studio, gli enteroidi dell'intestino tenue derivati da topi neonati sono stati trattati con latte materno raccolto da topi in allattamento. Come mostrato in questa figura, il latte materno di topo ha aumentato la proliferazione negli enteroidi di topo.Per studiare gli effetti specie-specifici del latte materno, il latte materno umano e il latte materno pastorizzato di donatrice sono stati applicati anche agli enteroidi di topo. Come mostrato in questa figura, il latte materno umano e pastorizzato di donatrice ha aumentato la proliferazione di enteroidi di topo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cripte in ghiaccio durante le fasi di isolamento.Eseguire lentamente e delicatamente tutti i metodi dopo che gli enteroidi sono in coltura. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come trattamenti con cellule immunitarie, microbiota o vari farmaci per rispondere a ulteriori domande per ricapitolare meglio il microambiente dell'intestino. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, trattare ed eseguire l'immunofluorescenza sugli enteroidi.Inoltre, dovresti essere in grado di estrarre in modo efficiente il latte materno da un topo che allatta. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani e fluidi corporei può essere estremamente pericoloso e che i dispositivi di protezione individuale devono essere sempre indossati durante l'esecuzione di queste procedure.

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Descriviamo un metodo per stabilire enteroidi umani da cripte intestinali tenue e colonoidi da cripte del colon raccolte sia da tessuto chirurgico che da biopsie. In questo articolo metodologico, presentiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Il protocollo presentato utilizza la citometria di flusso per quantificare il numero di cellule proliferatie e morte negli enteroidi dei topi coltivati. Questo metodo è utile per valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione e la sopravvivenza degli organiidi.

Quantificazione delle cellule morte e proliferanti negli enteroidi

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Gli enteroidi stanno emergendo come un nuovo modello per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia dei tessuti, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. Qui, descriviamo un sistema di coltura derivato da enteroidi 2D di cellule primarie bovine che consente la co-coltura con i tipi di cellule tissutali rilevanti. Questo modello offre un vantaggio traslazionale per la modellazione della ricerca gastrointestinale.

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

Scopri come coltivare enteroidi da intestino neonatale di topo o umano per studiare gli effetti del latte materno sulla proliferazione cellulare intestinale. Questo modello ex vivo aiuta a comprendere malattie gastrointestinali.

Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule

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