Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici
26 marzo 2018
Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche delle cellule. Descriviamo un metodo di esclusione fluorescente che permette di pieno-campo misura di volume di un neurone in vitro con sub-micrometrica risoluzione assiale richiesto per l'analisi dei neuriti e strutture dinamiche implicite nella crescita neuronale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire la misurazione a campo pieno del volume neuronale in vitro con risoluzione assiale submicrometrica necessaria per l'analisi dei neuriti in strutture dinamiche implicate nella crescita neuronale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze cellulari riguardanti la dinamica delle variazioni di volume su scala subsidia durante la non crescita o la degenerazione degli assoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una risoluzione assiale submicrometrica combinata con l'osservazione completa dell'adattamento e la scala temporale in ore o giorni.
Per iniziare la procedura, sformare il blocco PDMS sotto una cappa chimica versando su di esso isopropanolo. Quindi, posizionalo sulla panca in acciaio inossidabile della cappa. Tagliare intorno al wafer di silicone e sformare la replica PDMS.
Quindi, taglia intorno alla patatina e lascia un margine di due millimetri usando un bisturi o una lama di rasoio. Punzonare l'ingresso premendo con decisione il perforatore di 1,5 millimetri di diametro e azionarlo per tagliare e intagliare il foro dell'ingresso. Fai lo stesso nelle quattro zone dedicate del chip dove verrà iniettato il liquido.
Successivamente, pulisci il chip incollando e staccando il nastro adesivo sul lato microstrutturato. Cospargere di isopropanolo su entrambi i lati. Quindi, asciugare il truciolo con azoto pressurizzato utilizzando una pistola ad aria compressa.
In questa procedura, posizionare ciascun vetrino coprioggetti su una centrifuga situata in una camera bianca. Applicare una goccia di fotoresist positivo per coprire circa il 75% del vetrino coprioggetti e centrifugare a 4000 giri/min per 30 secondi fino a raggiungere uno spessore finale di 0,45 micrometri. Posizionare i vetrini coprioggetti su una piastra riscaldante con una temperatura superficiale di 115 gradi Celsius per un minuto.
Utilizzando un allineatore per maschera, esporre ogni vetrino coprioggetti a una lunghezza d'onda di 435 nanometri attraverso la maschera dedicata in base ai parametri del fabbricante. Successivamente, preparare due piastre di cristallizzazione in vetro, una contenente lo sviluppatore senza diluizione, l'altra contenente acqua deionizzata. Immergere i vetrini coprioggetti uno ad uno nello sviluppatore per un minuto, mescolando continuamente e delicatamente il piatto di cristallizzazione.
Quindi, immergere il wafer in acqua deionizzata per circa cinque secondi. Trasferire il wafer su una carta assorbente e asciugarlo con azoto pressurizzato utilizzando una pistola ad aria compressa. Posizionare sia il chip PDMS che il piatto di vetro su cui verrà incollato nella camera al plasma per l'attivazione della superficie.
Successivamente, depositare una goccia d'acqua su un vetrino da microscopio rettangolare spesso e incollare il vetrino coprioggetti sul vetrino per capillarità. Al microscopio, segnare la posizione delle strisce di fotoresist sul retro del vetrino. Posizionare il vetrino coprioggetto in vetro decorato sul supporto della maschera dell'allineatore della maschera.
Affidarsi al segno fatto per centrare gli oggetti di riferimento del fotoresist. Per aumentare il contrasto ottico, posizionare un wafer di silicio sotto il chip PDMS. Il wafer di silicone deve rimanere saldamente attaccato al mandrino durante il processo di allineamento.
Quindi, posizionare il chip PDMS sul supporto mobile del substrato dell'allineatore della maschera. Successivamente, sollevare il mandrino quanto basta per visualizzare sia il chip che la serie di strisce di fotoresist situate sul vetrino coprioggetti rimanendo dietro il contatto meccanico. Eseguire l'allineamento e ottenere il contatto meccanico tra il truciolo e il vetrino coprioggetti sollevando il mandrino fino a quando la superficie dei montanti PDMS tocca il vetrino coprioggetti.
Dopodiché, abbassare il mandrino. Rimuovere il vetrino coprioggetti incollato al chip dal supporto della maschera. Quindi, posiziona il dispositivo in una capsula di Petri da 35 millimetri e trasferisci tutto nel forno per cinque-dieci minuti per aumentare la forza di adesione.
Trenta minuti dopo l'incollaggio, posizionare all'ingresso un puntale per pipetta da dieci microlitri riempito con soluzione di PLO. Quindi, caricare il liquido fino a formare una goccia sopra. Ripetere la stessa operazione all'uscita e ai serbatoi.
Successivamente, aggiungi PBS nella capsula di Petri tutto intorno al chip. Sigillare la capsula di Petri con una pellicola di paraffina e incubare a temperatura ambiente con un minimo di cinque ore. Quindi, premere leggermente un cono da dieci microlitri in ciascun foro di iniezione e aspirare il liquido in eccesso.
Quindi, sostituire il PLO e il PBS che circonda il chip con il terreno di coltura. Successivamente, posizionare il chip nell'incubatore regolato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a quando i neuroni non si seminano con un tempo di incubazione minimo di cinque ore. In questa procedura, prelevare il terreno di coltura dal chip.
Raccogliere due o tre microlitri della soluzione cellulare appena risospesa e iniettarla all'ingresso. Ripetere immediatamente la stessa operazione alla presa. Iniettare circa lo stesso volume di terreno di coltura in ciascun serbatoio.
Osservare rapidamente il chip al microscopio per verificare la densità delle cellule. L'ordine di grandezza della densità cellulare ottimale corrisponde a circa cinque-dieci celle all'interno della superficie quadrata delimitata da quattro pilastri. Ripetere la procedura di iniezione di 0,5-1 microlitro di sospensione cellulare per raggiungere la densità cellulare desiderata.
Per l'imaging, sostituire il terreno di coltura con il mezzo di imaging. Quindi, posiziona il chip sotto un microscopio a epifluorescenza. Acquisizione di immagini di cellule da una o più immagini successive in caso di esperimenti time-lapse.
Qui sono mostrate le osservazioni rappresentative di una striscia di fotoresist di calibrazione e dei neuroni. Le immagini con ingrandimento maggiore e le sezioni trasversali di questi oggetti vengono visualizzate a destra. Qui sono mostrati i neuriti rappresentativi e una camera centrale alta tre micrometri.
Il volume della fetta di neurite può essere calcolato in funzione della larghezza del neurite. Ed ecco i coni di crescita rappresentativi e una camera centrale alta tre micrometri. Le loro sottostrutture emergono chiaramente da un rumore di fondo ottico di circa 20 nanometri.
Le osservazioni in time-lapse della vita agiscono neuroni seminati in una camera alta 12 micrometri per seguire il ciclo di restringimento e riattivazione del cono di crescita entro una scala temporale di poche decine di minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante avere accesso a un'apparecchiatura di incisione ionica profonda per fabbricare il fango siliconico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allineare un vetrino coprioggetti strutturato con un chip PDMS.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata in modo riproducibile alla quantificazione della neurologia in 3D. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia per esplorare l'effetto di vari farmaci con calibro reale, tutti a forma di cono chiuso. Non dimenticare che lavorare con i neuroni primari richiede molta cura per evitare contaminazioni e frantumi.
Sii sempre gentile e veloce quando cambi il supporto per limitare il tempo che trascorrono fuori dall'incubatrice.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di esclusione fluorescente per la misurazione su campo completo del volume neuronale in vitro con risoluzione assiale sub-micrometrica. La tecnica è essenziale per analizzare i neuriti e le strutture dinamiche associate alla crescita neuronale, consentendo una profonda comprensione della fisiologia e della patologia cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Ricerca neurologica
Sfondo
- Il volume neuronale è fondamentale per comprendere le caratteristiche cellulari.
- Le variazioni di volume a scala subcellulare sono importanti durante i processi fisiologici.
- Il metodo mira a migliorare la risoluzione nel monitoraggio della dinamica dei neuriti.
- Permette di soddisfare la necessità di misurazioni volumetriche ad alta precisione negli studi neuronali.
Scopo dello studio
- Per consentire l'imaging a campo completo del volume neuronale con alta risoluzione.
- Per facilitare l'analisi dei neuriti e della loro dinamica strutturale.
- Per fornire informazioni sui processi di crescita e degenerazione neuronale.
Metodi Utilizzati
- Questo studio ha utilizzato un chip microfluidico in PDMS per le misurazioni volumetriche.
- Il modello biologico si concentra principalmente su neuroni in coltura per un'osservazione dettagliata.
- Nessun flusso di lavoro multi-omico è stato impiegato in questo studio.
- Il metodo prevede una precisa fabbricazione e assemblaggio del dispositivo microfluidico, seguiti da imaging mediante microscopio a epifluorescenza.
- I passaggi importanti includono i processi di rivestimento, legatura e semina cellulare.
Risultati principali
- Il metodo fornisce una risoluzione assiale submicrometrica, essenziale per l'osservazione delle strutture neuronali.
- I cambiamenti dinamici dei neuriti sono stati efficacemente monitorati nel tempo.
- L'imaging ad alta risoluzione ha rivelato dettagli sfumati dei coni di crescita neuronali e delle modifiche strutturali.
- L'approccio consente calcoli precisi del volume delle sezioni dei neuriti.
Conclusioni
- Lo studio dimostra una tecnica robusta per misurazioni ad alta risoluzione del volume neuronale.
- Questo approccio è fondamentale per approfondire la conoscenza dei meccanismi neuronali e della plasticità.
- Ha implicazioni significative per la ricerca futura sulle dinamiche cellulari e la neurobiologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La quantificazione accurata della dinamica del volume neuronale è fondamentale per la valutazione di composti neuroattivi nella fase iniziale della scoperta, in particolare per analizzare l'integrità dei neuriti e il comportamento dei coni di crescita. Il metodo di esclusione della fluorescenza (FXm) combinato con la modellizzazione microfluidica fornisce una risoluzione assiale sub-micrometrica e un'immagine su tutto il campo, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica per i composti che mirano alla plasticità strutturale neuronale. Questo approccio supporta una maggiore affidabilità predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, collegando le variazioni del volume subcellulare a risultati funzionali in modelli in vitro pertinenti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando le variazioni locali di volume nei neuriti e nei coni di crescita come parametri funzionali dello stato di salute neuronale.
- Valore operativo: Fornisce dati morfologici quantitativi e riproducibili per ridurre i rischi associati a bersagli coinvolti nei percorsi di degenerazione o rigenerazione dei neuriti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera letture volumetriche standardizzate ad alta risoluzione adatte alla miniaturizzazione dei saggi e allo screening di composti in formati microfluidici.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio attraverso misurazioni volumetriche precise e senza marcatura, riducendo la variabilità nelle valutazioni della risposta ai composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre metriche strutturali rilevanti per le malattie che collegano i risultati in vitro a modelli preclinici di lesione neuronale o neurodegenerazione.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale della dinamica dei neuriti, supportando decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio nei percorsi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo endpoint strutturali quantitativi che guidano l'ottimizzazione del composto leader e la continuità preclinica, in particolare per composti che modulano la morfologia neuronale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'integrità dei neuriti e sulla dinamica dei coni di crescita mediante misurazione volumetrica diretta di strutture subcellulari.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso immagini volumetriche riproducibili su tutto il campo con risoluzione submicrometrica per la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce dati volumetrici quantitativi che consentono il confronto tra cambiamenti strutturali indotti da composti in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni della fase iniziale della scoperta a rilevanze precliniche quantificando biomarcatori strutturali della crescita e degenerazione neuronale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging microfluidica riutilizzabile applicabile a diversi modelli neuronali e classi di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle risposte strutturali neuronali a perturbazioni farmacologiche.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e scalabilità attraverso la fabbricazione di dispositivi microfluidici e flussi di lavoro di imaging compatibili con l'epifluorescenza.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo biomarcatori morfologici precoci dell'efficacia del composto e della neurotossicità.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base a effetti validati sul volume dei neuriti e sulla dinamica dei coni di crescita, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di microfluidica, nella fotolitografia e nelle tecniche di legame superficiale per l'assemblaggio del dispositivo.
- Richiede l'accesso a sistemi di allineamento della maschera, a trattamenti al plasma e a strumentazioni per la manipolazione precisa dei fluidi per la preparazione del chip.
- Necessita della standardizzazione della densità di semina cellulare e dei protocolli di imaging tra diversi gruppi per garantire la comparabilità dei dati.
- Richiede considerazioni di adattamento per diversi sottotipi neuronali o modelli di malattia, mediante modifiche della geometria microfluidica e del patterning superficiale.
- È limitato dalla necessità di accesso a laboratori puliti specializzati e di competenze tecniche nella manipolazione del PDMS e nell'integrazione microfluidica, fattori che potrebbero ostacolarne l'ampia diffusione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Fabrication of PDMS Chip
1:51
Fabrication of Patterned Coverslips
3:13
Chip Assembling and Final Implementation
6:03
Neuron Culture and Imaging
7:14
Results: Calibration of Fluorescence eXclusion Method Using a Photoresist Stripe as the Object of Interest and Neuronal Structures Volume Imaging
8:17
Conclusion
