Name: Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nellesclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri l'imaging volumetrico ad alta risoluzione di neuroni in vitro mediante esclusione di fluorescenza con chip microfluidici in PDMS. Questo metodo offre risoluzione assiale submicrometrica per analizzare dinamiche di neuriti e coni di crescita.

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Gli autori vogliono riconoscere ChiLab, materiali e microsistemi laboratorio - Politecnico di Torino - DISAT, nella persona del Prof C F Pirri, Dr. M Cocuzza e Dr. S L Marasso, per il loro prezioso aiuto nel processo di sviluppo e fabbricazione di dispositivi. Ringraziamo Victor Racine da Quantacell di discussione e supporto nella elaborazione delle immagini. Siamo grati a Isabelle Grandjean e Manon Chartier da Animal Facility del Institut Curie per il loro sostegno per i topi e Pablo Vargas e Ana-Maria Lennon (Institut Curie) per averci fornito i topi GFP LifeAct. Siamo grati a Olivier Thouvenin dal Institut Langevin e Clotilde Cadart, Larisa Venkova e Matthieu Piel dall'Institut Curie - UMR 144, per il loro aiuto nella comprensione dell'esclusione fluorescenza metodo. Infine, ringraziamo la piattaforma tecnologica del Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) per il loro sostegno nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dall'europeo ricerca Consiglio Advanced Grant No. 321107 "Violoncello", Université PSL (progetto SwithNeuroTrails), ANR Investissement Avenir e la IPGG Labex ed Equipex.

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</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Imaging con volumi di neuroni costituisce una sfida per la tecnica di FXm dovuto le estensioni lunghe e sottili di queste cellule. Questo protocollo descrive varianti dello stesso tipo di dispositivo microfluidico dedicata all'imaging del neurone.
Al lato degli aspetti della progettazione microfluidica, la scelta dell'obiettivo è fondamentale per l'imaging di fluorescenza esclusione e implica un compromesso tra la risoluzione laterale e la chiarezza di immagine. È stato dimostrato in 13 che un NA alta che porta ad una profondità di messa a fuoco più piccolo dell'altezza della camera non era dannoso per la precisione di misurazione di volume se imaging è stata eseguita a fuoco e se viene lasciato un margine sufficiente tra il contorno dell'oggetto di i nterest e i limiti della superficie di integrazione. Tuttavia, l'uso di una camera molto più alta rispetto alla profondità di messa a fuoco altera la chiarezza di immagine a causa della diffusione del fotone, che smussa i bordi degli oggetti di interesse. La realizzazione di una camera alta di 3 µm ridotto questo offuscamento laterale e fornito immagini eccezionalmente ben definita esclusione fluorescente anche utilizzando alta NA (0,8) 40 X obiettivi per visualizzare un neurone rami con elevata risoluzione laterale.
Chip di montaggio è un passo fondamentale, in particolare nel caso di 3 µm alta chambers, ma la manipolazione attenta come descritto al punto 4.1.2 evita il crollo del tetto. L'alta superficie in rapporto al volume associato a questi alloggiamenti sottili anche sollevato la questione della stabilità della concentrazione di destrano nel corso del tempo. Abbiamo controllato che l'assorbimento superficiale del destrano dopo una notte di incubazione era trascurabile: dopo la sostituzione del dextrano di PBS, la differenza di intensità tra il pilastro e lo sfondo era circa 1 / 1000 del contrasto tra intensità iniziale Queste due regioni in presenza di destrano. Si noti che i neuroni possono aderire il coprioggetto di fondo sia sul tetto PDMS. Questo effetto scomparirà quando usando fantasia coprioggetti (cioè quando noi non Incubare molecole adesive all'interno della camera PDMS), come il rivestimento è pertanto strettamente localizzato sul fondo della camera.
Oltre alla loro morfologia impegnativo, i neuroni sono piuttosto adatti a FXm dovuto al fatto che una delle principali limitazioni del metodo, cioè endocitosi di destrano, è molto limitata in queste cellule. Scegliamo un 10 kDa formulazione per sopprimere nel lungo intervallo (ore) eventuali fenomeni di endocitosi visibile.
In conclusione, la semplicità concettuale del FXm è bilanciata da un insieme di problemi sperimentali che sono stati risolti dal presente protocollo, ad esempio nanometriche PDMS rugosità e altezza della camera micrometrica o correzione del fondo per correggere le irregolarità del il soffitto di PDMS tra pilastri. Tuttavia, l'uso di una camera stretta microfluidici per confinare il mezzo fluorescente produce pochi vincoli specifici come la necessità di pilastri di sostegno, che abbassa la superficie efficace disponibile per adesione delle cellule, o la necessità di escludere soma dalla centrale Camera per osservare un neurone estensioni con la massima chiarezza, che limita le regioni della cellula accessibile all'osservazione ad alta risoluzione. Una possibile evoluzione di questo metodo sarebbe quello di sbarazzarsi di questo contenimento fisico, per essere sostituita da un ottico. Il nuovo sviluppo della microscopia foglio leggero potrebbe essere abbinato vantaggiosamente FXm in futuro.

La conoscenza precisa del volume cellulare ha attirato l'attenzione aumentata negli ultimi anni, guidato dall'emissione di omeostasi di dimensione delle cellule in microrganismi unicellulari 1 e, più in generale, in cellule mitotiche 2. Tuttavia, la questione del volume delle cellule è pertinente anche per cellule post-mitotiche, per il quale i neuroni costituiscono un esempio paradigmatico.
Volume è infatti una firma importante degli eventi fisiologici e patologici alle diverse scale e intervalli di tempo in vita neuronale, da transitoria deformazione assonale associata alla attività elettrica (scala di millisecondo) 3 per l'irreversibile un neurone gonfiore che si verificano durante la fase asintomatica di neurodegenerative malattie (negli anni in esseri umani) 4. Tuttavia, la più grande variazione di volume si verifica in una scala di tempo intermedio di giorni o settimane (a seconda del microrganismo considerato) durante lo sviluppo neuronale. L'estesa e complessa morfologia dei neuroni solleva problemi multipli, tra cui la regolazione della dimensione della cella. Diametro e lunghezza assonale sono infatti strettamente regolato in vivo, con valori specifici per ogni tipo di un neurone 5,6.
Queste questioni, complessi da affrontare in vivo, anche possono essere affrontate in modo semplificato in vitro. A tale scopo, un metodo dedicato alla misurazione del volume veloce basta seguire il tasso di crescita (cioè in una scala di tempo di minuti) e compatibile con l'osservazione nel corso di ore o giorni è richiesto. Diversi metodi sono stati sviluppati nel corso degli anni per fornire un accesso diretto o indiretto a volume cellulare in vitro. Ricostruzione delle cellule da imaging confocale è uno di loro, ma questo metodo implica d'etichettatura e ripetute esposizioni alla luce pur mostrando una limitata risoluzione assiale di circa 500 nm 7. Si noti che questi due ultimi inconvenienti sono parzialmente superati mediante un metodo più recente e sofisticato denominato reticolo microscopia luce-foglio 8. Microscopia a forza atomica è stato usato 9 ma questo metodo di scansione è di essenza lento e noioso. Inoltre, il contatto fisico che richiede con la cella potrebbe interferire con la misurazione considerando l'estrema morbidezza di neuroni 10. Metodo indiretto tramite impedenza o risonanza sono state impiegate per cellulari differenti tipi di 11, ma sono insufficienti per esteso adesive cellule come i neuroni.
Uno dei metodi più promettenti si basa sulla misura del volume escluso delle cellule in una camera stretta, piena di una tintura fluorescente. Il metodo di esclusione di fluorescenza (FXm) è semplice nel suo principio in quanto non richiede alcuna etichettatura ed è adatto per l'imaging ottico veloce, a lungo termine delle popolazioni di cellule con una risoluzione assiale potenzialmente Sub-ottica. Più precisamente, la risoluzione in z dipende l'intensità della fluorescenza massima nella camera di coltura (cioè nella regione privo di cellule) divisa per la gamma dinamica della fotocamera, anche se diverse fonti di rumore limitano questa risoluzione definitiva. Questo metodo è stato molto potente per seguire il volume di migrazione delle cellule aderenti 12 o per studiare la variazione di volume durante la mitosi delle cellule di mammiferi, come accuratamente descritto in 13. Tuttavia, i neuroni costituiscano una sfida metodologica per FXm considerando la loro ampia ramificazione nei processi sub-micrometrici.
Presentiamo qui un metodo che conduce alla realizzazione di strutture liscia FXm alloggiamenti per accedere con alta precisione il volume e l'altezza di un neurone filiali e strutture dinamiche coinvolte nella crescita neuronale come coni di crescita.
Chambers dovrebbe avere altezze simili rispetto all'oggetto da misurare al fine di ottimizzare la risoluzione assiale. Pertanto, abbiamo progettato diversi dispositivi FXm caratterizzati da sezioni di misura centrale di tre diverse altezze. Il più sottile (3 µm in altezza) è dedicato alla misurazione del neurite: questa bassa altezza esclude soma, che rimangono nella camera intermedia alta, vicino 15 µm. Camere centrali più spesse (10 e 12 µm) sono sufficientemente elevate per seguire la crescita di cellule intere. Il dispositivo include anche due serbatoi situati su entrambi i lati della camera centrale. Quattro fori di iniezione (IH) così vengono implementate e sono designati come segue: l'ingresso e l'uscita servono ad introdurre le sospensioni cellulari nel chip, mentre gli altri due alimentare i serbatoi.
Abbiamo prima calibrazione fabbricato coprioggetti per le misurazioni di altezza con photoresist strutture geometriche conosciute. Abbiamo quindi abbiamo ripreso neuroni crescenti gratis, ma i neuroni anche morfologicamente vincolati in microfantasie di adesione.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Per eseguire</td></tr><tr><td>l'allineatore di maschere DRIE MJB4</td><td>Fotolitografia SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Allineatore di maschere</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Fotolitografia associata al pulitore al plasma DRIE</td></tr><tr><td></td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per colture cellulari</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore 37 gradi C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubatore</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Forno tra 65 e 80 gradi C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometro meccanico</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Profilometro ottico</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diametro 200 mm</td></tr><tr><td>Sonicatore a ultrasuoni</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volume del bagno: 0,8 litri</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr><tr><td>Su8 Maschera 1</td><td></td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr><tr><td>Su8 Maschera 2</td><td></td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr><tr><td>Su8 Maschera 3</td><td></td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr><tr><td>Calibrazione S1805 </td><td></td><td></td> dati <td>supplementari</td></tr><tr><td><forte>Piccola attrezzatura da laboratorio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perforatrice da 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (riferimento USA)</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi o lama</td><td></td><td></td><td></td>di rasoio</tr><tr><td>Spatola piatta da 9" in acciaio inossidabile con cucchiaio</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Per sformare il PDMS</td></tr><tr><td>Manipolazione di wafer a labbro superiore</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta curva</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Pinze - Standard / Dumoxel</td><td>Per manipolare vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td><forti>Substrati</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>Fotoresist e sviluppatori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 fotoresist positivo</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Prima del processo DRIE, spessori 1,8 &; m</td></tr><tr><td>AZ 351B sviluppatore</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Per sviluppare positivo AZ 1518 fotoresist</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA sviluppatore</td><td>Technic</td><td></td><td>Per sviluppare SU-8 fotoresist negativo</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resist</td><td>Chimie Servizi</td><td></td> tecnici <td>Fotoresist positivo utilizzato per ottenere 0,5&micro; m strutture alte</td></tr><tr><td>MF 26A sviluppatore</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Per sviluppare positivo S1805 fotoresist</td></tr><tr><td><forte>Materiali di consumo da laboratorio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso in plastica 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Piastre di Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td><td></td>adesivo trasparente</tr><tr><td>Salviette quadrate</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Film plastico di paraffina</td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td>(</tr><tr><td>3-Metacrilossipropil)triclorosilano</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS e agente indurente Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanolo</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poli-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>3-metacrilossipropil-trimetossisilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>acido</td> <td>aceticoSigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Destrano 10kW coniugato con Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Assorbimento a 488 nm</td></tr><tr><td>Destrano 10kW coniugato con Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Assorbimento a 647 nm</td></tr><tr><td><forte>Terreno di coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasale senza rosso fenolo</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab per la normalizzazione dello sfondo</td><td>Quantacell</td><td>Contatta Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Per selezionare un ROI specifico per analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Routine</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr><tr><td>Routine</td><td>Matlab</td><td></td><td>Dati supplementari</td></tr></tbody></table>

alta risoluzione volume imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche dei neuroni alle diverse scale temporali. I neuroni sono cellule piuttosto uniche per quanto riguarda la loro estese morfologie ramificate e conseguenza genera diverse sfide metodologiche per la misurazione del volume. Nel caso particolare di in vitro la crescita neuronale, la metodologia scelta dovrebbe includere sub-micrometrica risoluzione assiale combinato con osservazione di pieno campo su scale temporali da minuti a ore o giorni. A differenza di altri metodi come la cellula forma ricostruzione usando la formazione immagine confocal, misure basate su elettricamente o microscopia a forza atomica, il metodo di esclusione di fluorescenza (FXm) recentemente sviluppato ha il potenziale per soddisfare queste sfide. Tuttavia, pur essendo semplice nel suo principio, l'implementazione di un FXm ad alta risoluzione per i neuroni richiede regolazioni multiple e una metodologia dedicata. Presentiamo qui un metodo basato sulla combinazione di esclusione di fluorescenza, dispositivi microfluidici multi-compartimenti bassa rugosità e infine micropatterning per ottenere misurazioni in vitro del volume locale di un neurone. L'alta risoluzione fornita dal dispositivo ci ha permesso di misurare il volume locale di processi neuronali (neuriti) e il volume di alcune strutture specifici coinvolti nella crescita neuronale, come coni di crescita (GCs).

Il risultato del processo di fabbricazione descritto nelle sezioni 1 e 2 è illustrato dalle immagini di Figura 1A-1B e la curva di Figura 1. La tabella di Figura 1 Visualizza i valori di rugosità di due diverse aree rappresentative del chip PDMS, cioè nella parte centrale e la camera intermedia successiva alta 20 µm. Una diminuzione della rugosità di un fattore di circa 7 è stata ottenuta utilizzando wafer Si acidato anziché SU-8 photoresist. Quindi, FXm in primo luogo è stato applicato su una striscia di photoresist della geometria noto (Figura 2A) all'interno di una camera alta di 10 µm. Dopo l'elaborazione delle immagini e intensità alla conversione di altezza (Vedi il grafico della Figura 2B), profili FXm eseguiti su sezioni trasversali lungo questa striscia (Figura 2) forniscono i profili di altezza desiderata (Figura 2D). Figura 2D Mostra il confronto tra profili ottenuti utilizzando profilometria meccanica e metodi FXm. Questi profili, incluso il valore dei margini e plateau, sono molto simili, il metodo di convalida. Si noti che la dispersione dei dati FXm non è rappresentativa della risoluzione finale del metodo, come ulteriormente valutato nella Figura 3 e Figura 4, ma i risultati di bassa intensità impiegate per evitare un possibile effetto di molto debole auto-fluorescenza di photoresist nel canale di GFP.
Quindi, abbiamo osservato i neurites a 3 µm e 10 µm alta chambers (Figura 3). La deviazione standard del rumore di fondo è circa 18 nm dopo intensità alla correzione di conversione e sfondo di altezza. Questo valore è leggermente superiore il fisico rugosità delle superfici PDMS castate su superfici di silicio (12 nm, vedere la tabella di Figura 1) ma molto più basso di quanto la rugosità misurata su PDMS ottenuti da stampi SU-8. Questi risultati evidenziano il valore aggiunto di perforazione di pozzi in wafer di silicio, anziché aprire fori in SU-8 photoresist eseguire il cast di pilastri. Un basso valore permette un alto segnale rumore e immagini molto chiare nel volume come quello mostrato in Figura 3A. Come esempio dei dati che possono essere recuperati da tali immagini, abbiamo calcolato il volume di 1,6 µm (cioè 10 pixel) del neurite ampia fetta (Vedi il grafico della Figura 3B). Utilizzo in prima approssimazione una misura lineare di questi dati fornisce un valore di altezza media del neurite di circa 400 nm, da confrontare con per esempio il diametro assonale 500 nm trovato in 10 giorni vecchi cuccioli all'interno del corpo calloso 5. Abbiamo anche combinato FXm con microfantasie di adesione consistente in serie intestati 2 µm e 6 µm strisce di larghezza di 30 µm di lunghezza. Il nostro scopo era di studiare l'influenza della larghezza del neurite sulla sua forma 3D. Figura 3 Mostra una rappresentazione 3D in falsi colori di un'immagine di intero neurone ottenuta in una camera alta di 10 µm. Neurites stanno diffondendo su 2 µm e strisce di larghezza 6 µm, mentre il soma è situato all'estremità della striscia più grande. Profili di altezza sono stati disegnati in tre diverse sezioni trasversali. In coerenza con il grafico visualizzato in Figura 3A, la superficie integrata per l'aumento di sezioni trasversali con la larghezza del neurite (Figura 3D).
Ci siamo concentrati anche su strutture 3D di crescita cono (GC). Figura 4 A-B consente di visualizzare due diversi profili GC ottenuti in una camera alta di 3 µm, che mettono in evidenza loro sub-struttura ramificata. Inoltre, abbiamo effettuato esperimenti di time-lapse per seguire la dinamica del volume di GCs in una camera alta di 12 µm. Figura 4 Mostra un ciclo di compattazione e riattivazione di un GC specificato all'interno di una scala di tempo di poche decine di minuti. Grazie all'utilizzo di topi GFP-lifeact, coni di crescita sono stati localizzati nella lunghezza d'onda di emissione di GFP (510 nm) da loro concentrazione alta actina. La superficie identificata nella lunghezza d'onda è stata utilizzata per integrare sopra la lunghezza d'onda emissione dextrano a 647 nm per calcolare il volume di GC. Figura 4 Mostra infine la distribuzione del volume di GC ad intervalli di tempo differenti e posizione su tre diversi neuroni, centrati su un valore di circa 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figura 1: chambers FXm PDMS. (A) schemi delle quattro fasi principali differenti di microfabbricazione che conduce allo stampo finale. La posizione dell'entrata, uscita e serbatoi sono indicati. Scala bar: 1 mm. (B) immagine della camera PDMS FXm ottenuta con un profilometro ottico. Questa immagine mostra la camera centrale contenente 3 file di 10 µm alti pilastri e gli alloggiamenti intermedi di µm 20, 50 e 90 di altezza. Barra della scala: 500 µm. (C) vista di sezione trasversale del chip lungo le due linee tratteggiate disegnate in (B). Giallo/oro: sezione trasversale lungo pilastri, blu: sezione trasversale tra i pilastri. (D) significa valori della rugosità PDMS misurati su 50 × 50 µm2 aree modellate su silicio e su 20 µm alta SU-8 camera intermedia (vedi frecce per la posizione di queste zone). I valori medi sono stati ottenuti dalle misurazioni di tre diverse aree. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figura 2: calibrazione del metodo FXm utilizzando una striscia di photoresist come oggetto di interesse. (A) immagine di fluorescenza GFP presi in una camera alta di 10 µm riempito con 10.000 destrano MW assorbente a 488 nm a 1 mg/mL. (B: sfondo, p: pilastro). Osservazione con un obiettivo di NA X 0,8 40 asciutto. Barra della scala: 50 µm. (B) diritto di taratura lineare ottenuta dall'intensità media dei due rettangoli colorati mostrato nel profilo di intensità a. (C) fluorescenza ottenuto a livello della linea tratteggiata blu visualizzato in (A), attraversando il photoresist striscia (0,45 µm alta photoresist positivo). (D) confronto tra i profili ottenuti da profilometro meccanico (punti neri) e FXm dopo intensità alla conversione di altezza dei dati di (B) (punti blu). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figura 3: imaging con volumi del Neurite. (A) dei neuriti che si estende nella camera alta 3 µm centrale da soma situato nella camera intermedia prossimi 15 µm. Formazione immagine effettuata utilizzando 10.000 destrano MW assorbente a 488 nm e 40 X, NA 0.8 a secco obiettivo. L'inserto ottenuti dopo l'utilizzo della routine sfondo riduzione evidenzia i due neurites e scelto di tracciare il grafico sulla destra. Scala bar: 30 µm. (B) del Neurite fetta volume in funzione della larghezza del neurite ottenuti dai 22 profili (media su 10 pixel, cioè su un 1,6 µm "neurite fetta") mostrati in (A). La linea continua rappresenta una misura lineare di pendenza 0,4 µm passando attraverso l'origine. (C) falso colore immagine di un neurone modellato su una striscia adesiva in successivi 2 µm e il µm 6 ceppi ampia (rappresentati in bianco). Le misure sono state effettuate in una camera alta di 10 µm piena di 10.000 destrano MW assorbente a 647 nm e utilizzando un NA 40 x 0,8 a secco obiettivo. (D) profili di altezza corrispondente per le colorate righe tratteggiate in (C), mantenendo lo stesso codice di colore. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figura 4: formazione immagine statica e dinamica crescita cono. (A-B) Profili di altezza cono crescita ottenuti in una camera alta di 3 µm dopo intensità alla conversione di altezza lungo le linee gialle visualizzati in immagini associate. Osservazione eseguita utilizzando un riempimento con 10.000 destrano MW assorbente a 488 nm e 40 X, NA 0.8 a secco obiettivo. (C) formazione immagine intero neurone in una camera alta 12 µm riempito con 10.000 destrano MW assorbente a 647 nm. Sono state fatte osservazioni in due canali fluorescente: GFP per la localizzazione di cono di crescita (linee gialle tratteggiate) e CY5 per calcolare il volume di GC dall'esclusione di fluorescenza. La superficie inclusa da linee gialle tratteggiate è stata utilizzata per calcolare il volume di GC. Il grafico mostra la variazione del volume di GC nel tempo e morfologie associate nei canali sia GFP e CY5 in due diversi momenti rappresentativi. Tutti i dati sono stati acquisiti utilizzando un NA 40 x 0,8 a secco obiettivo barre della scala ogni 3 min: 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Maschera 1:8 µm strato</td>
			<td>Maschera 02:30 µm strato</td>
			<td>Maschera 03:40 µm strato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 giri/min</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 giri/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere morbido</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia di esposizione</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere post-esposizione</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sviluppo</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difficile cuocere (opzionale)</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: fotolitografia passaggi eseguiti per costruire un dispositivo contenente una camera centrale di 12 μm in altezza. Altezze delle sezioni intermedie: µm 20, 50 e 90.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Maschera 01:10 µm strato</td>
			<td>Maschera 02:30 µm strato</td>
			<td>Maschera 03:40 µm strato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 1500 giri/min</td>
			<td>30 s @ 3050 rpm</td>
			<td>30 s @ 3250 giri/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere morbido</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Energia di esposizione</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere post-esposizione</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 6 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sviluppo</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difficile cuocere (opzionale)</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: fotolitografia passaggi eseguiti per costruire un dispositivo contenente una camera centrale di 10 μm in altezza. Altezze delle sezioni intermedie: µm 20, 50 e 90.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Maschera 01:12 µm strato</td>
			<td>Maschera 02:32 µm strato</td>
			<td>Maschera 03:40 µm strato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 3250 giri/min</td>
			<td>30 s @ 2500 giri/min</td>
			<td>30 s @ 3250 giri/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere morbido</td>
			<td>3 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 5 min a 95 ° C</td>
			<td>3 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di esposizione</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 di mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuocere post-esposizione</td>
			<td>4 min a 95 ° C</td>
			<td>1 min a 65 ° C + 5 min a 95 ° C</td>
			<td>2 min @ 65 ° C + 7 min a 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sviluppo</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Difficile cuocere (opzionale)</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
			<td>3-5 min a 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: fotolitografia passaggi eseguiti per costruire un dispositivo contenente una camera centrale di 3 μm in altezza. Altezze delle sezioni intermedie: 18, 50 e 90 µm.
Dati supplementari 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. Rappresentazione schematica delle maschere usate per fabbricare il dispositivo PDMS (DRIE maschera e maschere 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Dati supplementari 2: file "masks_neuron_volume_chips.dxf". File elettronici che permette di fabbricare la maschera di DRIE e maschere 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Dati supplementari 3: "Mask_Photoresist-stripes.dxf". File elettronici che permette di fabbricare la maschera utilizzata per la fotolitografia di strisce di photoresist. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Dati supplementari 4: file conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Dati supplementari 5: file importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Il volume è un parametro importante per quanto riguarda le caratteristiche fisiologiche e patologiche delle cellule. Descriviamo un metodo di esclusione fluorescente che permette di pieno-campo misura di volume di un neurone in vitro con sub-micrometrica risoluzione assiale richiesto per l'analisi dei neuriti e strutture dinamiche implicite nella crescita neuronale.

Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire la misurazione a campo pieno del volume neuronale in vitro con risoluzione assiale submicrometrica necessaria per l'analisi dei neuriti in strutture dinamiche implicate nella crescita neuronale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze cellulari riguardanti la dinamica delle variazioni di volume su scala subsidia durante la non crescita o la degenerazione degli assoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una risoluzione assiale submicrometrica combinata con l'osservazione completa dell'adattamento e la scala temporale in ore o giorni.Per iniziare la procedura, sformare il blocco PDMS sotto una cappa chimica versando su di esso isopropanolo. Quindi, posizionalo sulla panca in acciaio inossidabile della cappa. Tagliare intorno al wafer di silicone e sformare la replica PDMS.Quindi, taglia intorno alla patatina e lascia un margine di due millimetri usando un bisturi o una lama di rasoio. Punzonare l'ingresso premendo con decisione il perforatore di 1,5 millimetri di diametro e azionarlo per tagliare e intagliare il foro dell'ingresso. Fai lo stesso nelle quattro zone dedicate del chip dove verrà iniettato il liquido.Successivamente, pulisci il chip incollando e staccando il nastro adesivo sul lato microstrutturato. Cospargere di isopropanolo su entrambi i lati. Quindi, asciugare il truciolo con azoto pressurizzato utilizzando una pistola ad aria compressa.In questa procedura, posizionare ciascun vetrino coprioggetti su una centrifuga situata in una camera bianca. Applicare una goccia di fotoresist positivo per coprire circa il 75% del vetrino coprioggetti e centrifugare a 4000 giri/min per 30 secondi fino a raggiungere uno spessore finale di 0,45 micrometri. Posizionare i vetrini coprioggetti su una piastra riscaldante con una temperatura superficiale di 115 gradi Celsius per un minuto.Utilizzando un allineatore per maschera, esporre ogni vetrino coprioggetti a una lunghezza d'onda di 435 nanometri attraverso la maschera dedicata in base ai parametri del fabbricante. Successivamente, preparare due piastre di cristallizzazione in vetro, una contenente lo sviluppatore senza diluizione, l'altra contenente acqua deionizzata. Immergere i vetrini coprioggetti uno ad uno nello sviluppatore per un minuto, mescolando continuamente e delicatamente il piatto di cristallizzazione.Quindi, immergere il wafer in acqua deionizzata per circa cinque secondi. Trasferire il wafer su una carta assorbente e asciugarlo con azoto pressurizzato utilizzando una pistola ad aria compressa. Posizionare sia il chip PDMS che il piatto di vetro su cui verrà incollato nella camera al plasma per l'attivazione della superficie.Successivamente, depositare una goccia d'acqua su un vetrino da microscopio rettangolare spesso e incollare il vetrino coprioggetti sul vetrino per capillarità. Al microscopio, segnare la posizione delle strisce di fotoresist sul retro del vetrino. Posizionare il vetrino coprioggetto in vetro decorato sul supporto della maschera dell'allineatore della maschera.Affidarsi al segno fatto per centrare gli oggetti di riferimento del fotoresist. Per aumentare il contrasto ottico, posizionare un wafer di silicio sotto il chip PDMS. Il wafer di silicone deve rimanere saldamente attaccato al mandrino durante il processo di allineamento.Quindi, posizionare il chip PDMS sul supporto mobile del substrato dell'allineatore della maschera. Successivamente, sollevare il mandrino quanto basta per visualizzare sia il chip che la serie di strisce di fotoresist situate sul vetrino coprioggetti rimanendo dietro il contatto meccanico. Eseguire l'allineamento e ottenere il contatto meccanico tra il truciolo e il vetrino coprioggetti sollevando il mandrino fino a quando la superficie dei montanti PDMS tocca il vetrino coprioggetti.Dopodiché, abbassare il mandrino. Rimuovere il vetrino coprioggetti incollato al chip dal supporto della maschera. Quindi, posiziona il dispositivo in una capsula di Petri da 35 millimetri e trasferisci tutto nel forno per cinque-dieci minuti per aumentare la forza di adesione.Trenta minuti dopo l'incollaggio, posizionare all'ingresso un puntale per pipetta da dieci microlitri riempito con soluzione di PLO. Quindi, caricare il liquido fino a formare una goccia sopra. Ripetere la stessa operazione all'uscita e ai serbatoi.Successivamente, aggiungi PBS nella capsula di Petri tutto intorno al chip. Sigillare la capsula di Petri con una pellicola di paraffina e incubare a temperatura ambiente con un minimo di cinque ore. Quindi, premere leggermente un cono da dieci microlitri in ciascun foro di iniezione e aspirare il liquido in eccesso.Quindi, sostituire il PLO e il PBS che circonda il chip con il terreno di coltura. Successivamente, posizionare il chip nell'incubatore regolato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a quando i neuroni non si seminano con un tempo di incubazione minimo di cinque ore. In questa procedura, prelevare il terreno di coltura dal chip.Raccogliere due o tre microlitri della soluzione cellulare appena risospesa e iniettarla all'ingresso. Ripetere immediatamente la stessa operazione alla presa. Iniettare circa lo stesso volume di terreno di coltura in ciascun serbatoio.Osservare rapidamente il chip al microscopio per verificare la densità delle cellule. L'ordine di grandezza della densità cellulare ottimale corrisponde a circa cinque-dieci celle all'interno della superficie quadrata delimitata da quattro pilastri. Ripetere la procedura di iniezione di 0,5-1 microlitro di sospensione cellulare per raggiungere la densità cellulare desiderata.Per l'imaging, sostituire il terreno di coltura con il mezzo di imaging. Quindi, posiziona il chip sotto un microscopio a epifluorescenza. Acquisizione di immagini di cellule da una o più immagini successive in caso di esperimenti time-lapse.Qui sono mostrate le osservazioni rappresentative di una striscia di fotoresist di calibrazione e dei neuroni. Le immagini con ingrandimento maggiore e le sezioni trasversali di questi oggetti vengono visualizzate a destra. Qui sono mostrati i neuriti rappresentativi e una camera centrale alta tre micrometri.Il volume della fetta di neurite può essere calcolato in funzione della larghezza del neurite. Ed ecco i coni di crescita rappresentativi e una camera centrale alta tre micrometri. Le loro sottostrutture emergono chiaramente da un rumore di fondo ottico di circa 20 nanometri.Le osservazioni in time-lapse della vita agiscono neuroni seminati in una camera alta 12 micrometri per seguire il ciclo di restringimento e riattivazione del cono di crescita entro una scala temporale di poche decine di minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante avere accesso a un'apparecchiatura di incisione ionica profonda per fabbricare il fango siliconico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allineare un vetrino coprioggetti strutturato con un chip PDMS.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata in modo riproducibile alla quantificazione della neurologia in 3D. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia per esplorare l'effetto di vari farmaci con calibro reale, tutti a forma di cono chiuso. Non dimenticare che lavorare con i neuroni primari richiede molta cura per evitare contaminazioni e frantumi.Sii sempre gentile e veloce quando cambi il supporto per limitare il tempo che trascorrono fuori dall'incubatrice.

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L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati...

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Questo video dimostra come le vescicole neuronali siano marcate con specifiche proteine fluorescenti per visualizzare il loro movimento. In primo luogo, un plasmide codificante per una proteina fluorescente viene incubato con un agente di trasfezione e quindi introdotto in una coltura di neuroni. Successivamente, le immagini dei neuroni vengono acquisite e analizzate per tracciare il movimento delle vescicole.

Visualizzazione delle motilità delle vescicole nei neuroni mediante imaging a fluorescenza

Si descrive come implementare fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) a base di studi di vescicole in fissi, neuroni in coltura. I componenti chiave del nostro protocollo includono etichettatura vescicole con chimere fotoconvertibile, la raccolta di immagini crude scarsamente campionate con un sistema di microscopia super-risoluzione, e l'elaborazione delle immagini crude per produrre un'immagine super-risoluzione.

Super-Resolution Imaging di vescicole neuronali Dense-core

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Qui presentiamo un protocollo basato su microscopia per imaging ad alta risoluzione e una ricostruzione tridimensionale del mouse unità neurovascolare e barriera emato - encefalica utilizzando sezioni digalleggiante del cervello. Questo metodo consente la visualizzazione, analisi e quantificazione degli organelli intracellulari a BBB.

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

Questo protocollo descrive l'uso di chip di plastica per cultura e compartimenti stagni di neuroni primari murini. Questi chip sono preassemblati, facile da usare e compatibile con alta risoluzione, dal vivo e l'imaging di fluorescenza. Questo protocollo descrive come piastra di neuroni ippocampali di ratto all'interno di questi chip ed eseguire immunostaining, assotomia e fluidico isolamento.

Uso di chip microfluidici plastica pre-assemblato per divisione in compartimenti neuroni primari murini

Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.

Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa

Scopri l'imaging volumetrico ad alta risoluzione di neuroni in vitro mediante esclusione di fluorescenza con chip microfluidici in PDMS. Questo metodo offre risoluzione assiale submicrometrica per analizzare dinamiche di neuriti e coni di crescita.

Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici

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