Name: Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri la decellularizzazione comparata di cuori fetali e adulti di topo per analizzare le proprietà della matrice extracellulare cardiaca in 3D. Questo metodo standardizzato facilita la ricerca cardiovascolare.

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Gli autori sono in debito con tutti i membri del laboratorio di Pinto--Ó per discussione critica pertinente. Questo lavoro è stato supportato da MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) nell'ambito del progetto "CARDIOSTEM-Engineered tessuti cardiaci e terapie basate sulle cellule staminali per applicazioni cardiovascolari" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.c.s. è un destinatario di una borsa di studio FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. è un collega di FCT (FCT-investigatore 2012).

Tutte le metodologie descritte sono state approvate dalla i3S Comitato di etica animale e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e sono in conformità con il Parlamento europeo direttiva 2010/63/UE.
1. preparazione delle soluzioni di decellularizzazione
Nota: Decellularizzazione tutte le soluzioni dovrebbero essere filtrate attraverso un filtro a membrana 0.22 μm e conservati per un massimo di 3 mesi, salvo specificato diversamente.
<ol><li>Per 1x PBS: Mix 8 g di NaCl, 1,01 g di Na2HPO4 200 mg di KCl e 200 mg di KH2PO4 con 900 mL di acqua deionizzata (acqua deionizzata). Regolare la soluzione pH a 7,5 e il volume di soluzione finale fino a 1 L. filtro, autoclave e store la soluzione a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Per Buffer ipotonico (10 mM Tris, 0.1% EDTA): sciogliere 1,21 g di TrisBASE e 1g di EDTA in 900 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH della soluzione a 7,8 con NaOH/HCl e il volume di soluzione finale per 1 L. filtro, sterilizzare in autoclave e archiviare a TA.</li>
	<li>Per la soluzione di 0,2% SDS (0,2% SDS, 10 mM Tris): aggiungere 0,6 g di TrisBASE e 1 g di sodio dodecil solfato (SDS) in 400 mL di acqua deionizzata e mescolare a 60 ° C fino al completo scioglimento soluto. Lasciate che la soluzione di raffreddarsi per RT. Adjust soluzione pH a 7,8 e il volume di soluzione finale a 500 mL. Sterilizzare la soluzione per filtrazione. Nota: La soluzione di SDS deve essere preparata prima dell'uso. Filtro soluzione solo dopo completa dissoluzione di SDS, altrimenti le particelle insolubili SDS saturerà il filtro, cambiando la concentrazione finale di SDS e di conseguenza che influenzano l'efficienza di decellularizzazione di tessuto.</li>
	<li>Per il tampone ipotonico (10 mM Tris): Mix 1,21 g di TrisBASE in 900 mL di acqua. Regolare il pH della soluzione a 7,8 e il volume finale di 1 L. filtro, sterilizzare in autoclave e memorizzare a TA.</li>
	<li>Per il trattamento della dnasi (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNasi): sciogliere 2,42 g di TrisBASE e 2 mL di 1 M MgCl2 in 900 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,8 e il volume di soluzione finale per 1 L. filtro e sterilizzare la soluzione in autoclave. Conservare la soluzione a RT. aggiungere dnasi I (50 U/mL) prima dell'uso.</li>
	<li>Per dnasi stock soluzione: preparare un tampone di dnasi contenente glicerolo al 50%, 20 mM Tris-HCl a pH 7.5, 1 mM MgCl2e regolare a un volume di soluzione finale di 10 mL con acqua deionizzata. In una cappa a flusso laminare, aggiungere la dnasi I polvere nel buffer di DNasi e mescolare delicatamente fino al completo scioglimento. Sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 μm. Aliquote di 1ml di preparare e conservare a-20 ° C.</li>
</ol>2. tessuto raccolta e crioconservazione
<ol><li>Eutanasia adulte femmine gravide a 18 giorni di gestazione (E18 feti) via CO2 asfissia. Eseguire un taglio cesareo nelle femmine con una forbice chirurgica e raccogliere i corni uterini cuscinetto topi fetali di una capsula di Petri con PBS 1X ghiacciata con due pinzette seghettate con punte curve (una pinzetta a ciascuna estremità del corno).<ol>
<li>Aprire i corni uterini e il sacco amniotico per isolare i feti. Trasferire i feti una nuova capsula Petri con PBS 1X ghiacciata per anestetizzare li e decapita con una forbice.</li>
		<li>Eutanasia topi maschii C57BL/6-7-8 settimane vecchio usando CO2 asfissia. Eseguire un'incisione su ogni petto di mouse e raccogliere il cuore.</li>
		<li>Risciacquare brevemente cuori fetali ed adulti con PBS 1X freddo di ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere gli atrii del cuore adulto con l'aiuto di un bisturi. Eseguire un'incisione il ventricolo di destra e rimuoverlo utilizzando direttamente piccole forbici. Esporre la parete interna del ventricolo sinistro mediante la rimozione del setto. In un nuovo piatto di Petri, dividere il libero-parete del ventricolo sinistro in strisce longitudinali con 2 mm di spessore e rimuovere il muscolo papillare usando un bisturi e pinzette seghettate con punte curve.<ol>
<li>Accise espianti piccolo tessuto con l'aiuto di un bisturi utilizzando una griglia di 2 x 2 mm (descrizione dettagliata supplementare 1 di figura5). Risciacquare brevemente espianti di tessuto con PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungi ~ 250 µ l della temperatura ottimale di taglio (OCT) composta per provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterilizzato nell'autoclave. Trasferire tutto fetali cuori ed espianti cardiaci adulti ai tubi con 250 µ l di OCT e congelarli con isopentano raffreddato a ghiaccio secco e conservare a-80 ° C (per un massimo di 6 mesi). Nota: È possibile che l'uso di espianti di tessuto cardiaco crioconservati per più di 6 mesi ridurrà significativamente l'efficienza di decellularizzazione, soprattutto in espianti di tessuto del cuore adulto.</li>
</ol>3. decellularizzazione tessuto
Nota: Decellularizzazione di tessuto cardiaco viene eseguita in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti con un campione per pozzetto. 1 mL di ciascuna soluzione di decellularizzazione viene aggiunto ad ogni singolo bene. Tutti decellularizzazione procedura deve essere eseguita con agitazione a 165 giri/min (Agitatore incubatore orbitale di diametro di 20 mm) e a 25 ° C, se non specificato diversamente. Per maggiori dettagli, si prega di consultare lo schema nella Figura 1A. Amfotericina B (per esempio fungizone) e gentamicina sono appena aggiunto a tutte le soluzioni di decellularizzazione prima dell'uso per una concentrazione finale di 2,5 μg/mL e 0,01 μg/mL, rispettivamente. Per quantificare la quantità di DNA conservato all'interno di tessuti decellularizzati, le esigenze di massa del campione deve essere determinato prima di iniziare il protocollo di decellularizzazione. Il protocollo di quantificazione del DNA è ulteriormente dettagliati nel paragrafo 5.1.
<ol><li>
1 ° GIORNO
	<ol>
<li>Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore-80 ° C. Lasciare il 1,5 mL microcentrifuga RT fino a OCT diventa parzialmente fuso. Trasferimento del blocco di tessuto cardiaco di personalizzazione di Office ancora congelati in una capsula di Petri con PBS 1X.</li>
		<li>Dopo l'OCT si scioglie, spostare il tessuto cardiaco una nuova capsula Petri con PBS 1X. Campioni di lavaggio in 1X PBS e a 60 rpm con un agitatore per 10-15 minuti ripetere almeno due volte.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di lavoro Buffer ipotonico per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti sterili per coltura. Trasferire un campione per bene con l'aiuto di pinze.</li>
		<li>Spostare la piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti con i campioni in un agitatore incubatore a 25 ° C e iniziare l'incubazione di 18 h con Buffer ipotonico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 ° GIORNO
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di SDS di 0,2% come descritto nella sezione 1.3.</li>
		<li>Aspirare il Buffer ipotonico e lavare i campioni con PBS 1X per volte di 1 h. 3 ripetere. Nota: Punto di pausa: tessuto sotto decellularizzazione possa essere tenuto in 1X PBS a 4 ° C per 18 h in condizioni statiche.</li>
		<li>Rimuovere il PBS 1X, aggiungere 1 mL di soluzione SDS appena fatte (punto 1.3) ogni pozzetto e incubare i campioni per 24 h. Nota: Incubazione SDS Post (CHECK POINT), assicurarsi che i campioni mostrare un bianco di aspetto traslucido. A questo punto, SDS trattati campioni sono inzuppati nel DNA, mostrando una gelatina-come consistenza. Rimuovere la soluzione di SDS lentamente per evitare l'adesione del campione per la punta della pipetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 ° GIORNO
	<ol>
<li>Lavare i campioni con tampone ipotonico lavare (1 mL per pozzetto) per 20 min., ripetere 3 volte. Nota: In questa fase, è normale osservare una diminuzione della dimensione del campione a causa della rimozione dei resti delle cellule. PUNTO di pausa: Tessuto sotto decellularizzazione può mantenersi nel tampone di lavaggio ipotonica a 4 ° C per 18 h in condizioni statiche.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione per il trattamento della dnasi per pozzetto e incubare i campioni per 3 h a 37 ° C.</li>
		<li>Aspirare la soluzione di trattamento della dnasi e lavare i campioni con PBS 1X (1 mL per pozzetto) per 20 min., ripetere 3 volte. Eseguire un lavaggio finale con PBS 1X (1 mL per pozzetto) durante la notte a RT e scuotendo a 60 giri/min.</li>
		<li>(Check point) Dopo il trattamento della dnasi, garantire che i campioni decellularizzati hanno perso la consistenza gelatina. Nota: Dopo il trattamento della dnasi, rimuovere e aggiungere 1X PBS delicatamente dal campioni possono essere facilmente intrappolati e attaccati per la punta della pipetta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. valutazione di rimozione delle cellule dei tessuti decellularizzati
<ol><li>Difficoltà i campioni in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti, 1 campione per pozzetto, aggiungendo 1 mL di appena fatte Formalina 10% neutra tampone con eosina acquosa 0,03% per 2.5-3 h a TA. Nota: Eosina viene aggiunto il fissativo per macchiare il tessuto decellularizzato e per facilitare la visualizzazione del campione durante il sezionamento e la macchiatura istologici. L'aggiunta di eosina che né interferisce con le macchie istologiche né con tecniche di immunofluorescenza. In alternativa, la fissazione può essere eseguita durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione fissante e aggiungere 1 mL di PBS 1X per lavare il campione.</li>
	<li>Incapsulare il bioscaffolds fisso in elaborazione di istologia gel utilizzando uno stampo di esemplare di vinile monouso secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Con il campione incorporato dalla muffa e trasferimento a biopsia elaborazione/Embedding cassette con coperchio, rimuovere il gel di istologia. Nota: Un'alternativa al tessuto incorporamento in istologia e gel di elaborazione è per elaborare ciascun campione in due spugne di biopsia con pori piccoli. I campioni devono essere localizzati al centro delle spugne biopsia per attivare il rilevamento. Di nota, alcuni campioni possono essere difficili da localizzare utilizzando questo approccio.</li>
	<li>Trattare i campioni per paraffina incorporamento attraverso successive incubazioni (30 min per ogni soluzione) in serie di concentrazioni di alcool (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), soluzione di isoparaffina idrocarburo alifatico (2 stazioni di incubazione) e paraffina (incubazione 2 stazioni) a 56 ° C.</li>
	<li>Montare i campioni in un blocco di paraffina.</li>
	<li>Tagliare 3 μm di spessore paraffina sezioni su un microtomo e raccogliere le sezioni su vetrini microscopio.</li>
	<li>Sezioni della paraffina asciutto durante la notte a 37 ° C. Nota: Sezioni di paraffina (pausa punto) vengono memorizzate a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore.</li>
	<li>Per verificare l'efficienza del protocollo, eseguire ematossilina ed eosina (H & E) e Trichrome di Masson (MT) di colorazione delle sezioni decellularizzati campione e alle sezioni di tessuto non manipolati secondo le istruzioni del produttore. Nota: H & E macchie di colorazione delle cellule i nuclei blu/viola, citoplasma rosa/rosso scuro e collagene pallido rosa e MT macchie nuclei neri, rosso, citoplasma e collagene e mucina blu. Decellularizzazione efficiente è raggiunto quando un rosa chiaro poroso (H & E, MT) e blu della rete (MT) è osservato, in assenza di una macchia nucleare.</li>
</ol>5. valutazione dell'asportazione di materiale nucleare decellularizzati tessuto
Nota: La quantificazione del contenuto di DNA sul tessuto decellularizzato deve essere eseguita in confronto il rispettivo tessuto non manipolato.
<ol><li>Prima di decellularizzazione, pesare una microcentrifuga da 1,5 mL su una bilancia digitale di alta precisione. Trasferire il tessuto cardiaco al tubo, rimuovere l'importo supplementare di PBS 1X e pesare il tubo con i campioni. Calcolare il peso bagnato dei campioni: Peso bagnato del campione = peso tubo con campioni – peso tubo vuoto
</li>
	<li>Decellularize i campioni come descritto nel passaggio 3.</li>
	<li>Dopo decellularizzazione, raccogliere i tessuti decellularizzati in una microcentrifuga.<ol>
<li>Grazie alle piccole dimensioni e massa dei singoli campioni cardiaci e kit specifiche, piscina decellularizzazione tessuti di ciascuna condizione di campione (cuore fetale: 5 cuori interi; adulto LV espianti: 15 espianti). Eseguire la stessa procedura con il tessuto non manipolato. Nota: (Punto di pausa) i campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a DNA estrazione e quantificazione vengono eseguite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare non manipolato e decellularized tessuti in piccoli espianti con l'aiuto di un bisturi in una capsula Petri pulita. Nota: Utilizzare un bisturi individuali e capsula di Petri per ogni campione. Rottura meccanica dei campioni con un bisturi facilita la loro digestione enzimatica posteriore e la successiva estrazione del DNA.</li>
	<li>Per l'estrazione del DNA, utilizzare un metodo di estrazione del DNA di spin-colonna basata secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Raccogliere i campioni meccanicamente dissociati dalla capsula di Petri con il buffer di digestione master (buffer di digestione e proteinasi K) secondo le istruzioni del produttore utilizzando un puntale ampia orifizio. Nota: Lisi del tessuto con proteinasi K digestione sono più veloce nei campioni decellularizzati. Per elaborare i campioni distinti allo stesso tempo, mantenere i campioni lisati sul ghiaccio, fino a quando tutti i campioni vengono lisati per minimizzare la degradazione. Esempi completi Lisi viene raggiunto tra 4-6 h.</li>
		<li>Procedere con il protocollo secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Per aumentare le rese di DNA Estratto del campionario tessuti decellularizzati e non-decellularized, eluire il DNA il 25-50 μL e 100 μL di tampone di eluizione, rispettivamente. Raccogliere il DNA eluito e caricare la spin-colonna. Incubare per 1 min a RT. Centrifugare i campioni secondo le istruzioni del produttore. Nota: (Pausa punto) il DNA estratto dai campioni può essere conservare a-20 ° C fino a ulteriore uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare il DNA estratto dai campioni con un kit di rilevazione fluorescente dsDNA seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Normalizzare il contenuto di DNA come nanogrammi di DNA per milligrammo di peso bagnato di campione iniziale (prima di decellularizzazione).</li>
</ol>6. semina di cellulare decellularizzati ponteggi
Nota: Tutte le soluzioni/reagenti devono essere sterili e l'intera procedura effettuata alle condizioni di sterilità.
<ol><li>Preparare 1 x DPBS 2,5 μg/ml di amfotericina B e 1% di P/S (penicillina, 100 U.I.; streptomicina 100 µ g/mL).</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di PBS 1X dall'ultimo passaggio di lavaggio di decellularizzazione (punto 3.3.3) e aggiungere 500 μL per pozzetto del preparata 1 x DPBS/2,5 μg/mL di soluzione di amfotericina B/1% P/S. Conservare i campioni a 4 ° C da 1-7 giorni. Nota: La conservazione di campioni a 4 ° C è importante per mantenere la sterilità.</li>
	<li>Aggiungi P/S alla cella media basale (senza FBS e integratori) a una concentrazione finale dell'1%.</li>
	<li>1 x DPBS/2,5 μg/mL di soluzione B/1% P/S di anfotericina dai campioni di decellularizzazione di aspirare. Aggiungere 500 μL per pozzetto di cellula basale media/1% P/S e lasciare che i campioni equilibrare per 1h a 37 ° C, o a 4 ° C per più di 1 h.</li>
	<li>Dividere le celle di interesse e preparare piccole aliquote delle cellule presso la densità cellulare desiderato. Nota: La semina di decellularizzazione tessuto deve essere eseguita sotto un microscopio stereoscopico e in condizioni di sterilità. Terreni di coltura delle cellule deve contenere 1% P/S.</li>
	<li>Aggiungere 3-4 μL di DPBS al centro di un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Con una pinzetta sottile e diritta, trasferire i ponteggi decellularizzati alla goccia DPBS, rimuovere il DPBS supplementare dall'aspirazione e assicurarsi che il campione non è piegato o rugoso. Lascia che diventi secco ai bordi di aderire alla superficie del bene. Nota: Ponteggi Detached hanno minore efficienza di semina.</li>
	<li>Aggiungere celle al patibolo pipettando la cella singola soluzione lentamente contro i bordi del pozzo. Nota: ad esempio, cardiomiociti neonatali del ratto sono seminati con una densità di 7.500 cellule/mm2 e mouse immortalizzato Lin− Sca-1+ cardiaco del progenitor (iCPCSca-1) ad una densità di 60-1.500 cellule/mm2. Regolare la densità delle cellule secondo la logica sperimentale.</li>
	<li>Aggiungere DPBS pozzetti adiacenti per evitare l'evaporazione veloce media.</li>
	<li>24 ore post semina delle cellule, se il tipo di cella utilizzato rispettate le lastre di polistirene di coltura tissutale (TCPS), trasferimento bioscaffolds a un nuovo pozzo. In caso contrario, sostituire il mezzo per rimuovere cellule non aderenti.</li>
	<li>Modificare attentamente i media secondo i requisiti specifici del tipo di cella.</li>
</ol>

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<li>Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant+activity+of+degradation+products+of+fetal+and+adult+skin+extracellular+matrix+for+keratinocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).</li>
<li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La matrice extracellulare (ECM) è un reticolo altamente dinamico e complesso delle glicoproteine fibrose e adesivi, costituito da un serbatoio di numerosi peptidi bioattivi e fattori di crescita intrappolati. Come il modulatore principale di adesione delle cellule, dinamica del citoscheletro, motilità/migrazione, proliferazione, differenziazione e apoptosi, ECM regola attivamente comportamento e funzione cellulare. Sapendo che il comportamento cellulare è diverso nelle culture 2D e 3D, ci sono stati gli sforzi per svilup...

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The fourth&#160;affiliation&#160;was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
to:
Gladstone Institute&#160;of Cardiovascular Disease
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University of California San Francisco

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Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

La matrice extracellulare (ECM) è una rete dinamica di molecole che regolano importanti processi cellulari, vale a dire destino-decisione, proliferazione e differenziazione di1,2. L'indagine sulle interazioni cellula-ECM è stata eseguita principalmente in bidimensionale (2D) in vitro culture rivestito con componenti della MEC, che costituiscono una semplificazione di nativo ECM oggetti trovati in vivo. Decellularizzazione genera acellulare 3D-come ECM bioscaffolds che conservano in gran parte l'architettura extracellulare e la composizione dei tessuti e organi3,4. Oltre a servire come scaffold bioattivi per ingegneria tissutale, decellularizzati biomateriali di ECM 3D stanno emergendo come romanzo piattaforme per valutare la biologia delle cellule-ECM quello parallelo dell'ambiente in vivo.
Valutazione del ruolo del differenziale dei componenti ECM di diversi tessuti, organi ed età potranno beneficiare con l'uso di protocolli simili di generare bioscaffolds nativo. Nel cuore, abbiamo sviluppato un protocollo versatile per decellularizzazione di campioni fetali e adulto-derivati, come metodo alternativo per eseguire studi comparativi del microambiente dell'organo. Utilizzando questa metodologia, abbiamo catturato il microambiente cardiaco nativo e ha mostrato che l'ECM fetale promuove rendimenti più elevati di ripopolazione di cellule cardiache5. Decellularizzazione fornito ulteriormente l'identificazione delle differenze strutturali residente tra ECM fetali ed adulti al livello del seminterrato lamina e pericellulari arrangiamento di maglia matrice e fibra composizione5. Prima di iniziare questo lavoro, confronto testa a testa dei tessuti nelle diverse fasi ontogenic utilizzando lo stesso approccio di decellularizzazione è stata segnalata solo per roditori cuori e reni di scimmia rhesus. Inoltre, un numero limitato di studi segnala tessuto/organo fetale decellularizzazione per sé5,6,7. Questo è stato realizzato usando SDS come agente unico decellularizzati; Tuttavia, le concentrazioni di SDS distinte sono state utilizzate per decellularizzazione di tessuto cardiaco fetali ed adulti7,8. SDS è uno dei più efficaci detergenti ionici per lo sdoganamento di citoplasmatici e nucleari e ampiamente usato in decellularizzazione di diversi tessuti e campioni9,10. Soluzioni contenenti alte concentrazioni di SDS e lunghi periodi di esposizione sono stati correlati con denaturazione proteica, perdita di glicosaminoglicani (gag) e la rottura del collagene fibrille10,11e quindi un equilibrio tra rimozione di conservazione e delle cellule di ECM è necessario. Per applicare la stessa procedura al tessuto del cuore fetale e adulto, il protocollo descritto nel presente documento è diviso in tre fasi sequenziali: lisi della cellula da shock osmotico (tampone ipotonico); solubilizzazione delle interazioni lipido-proteina, DNA-proteina e proteina-proteina (0,2% SDS); e rimozione di materiale nucleare (trattamento della dnasi).
Nostro protocollo presenta diversi vantaggi: i) la possibilità di decellularizzazione equivalente di età-specifici tessuti cardiaci applicando la stessa strategia di decellularizzazione; II) nessun requisito per metodi specializzati o attrezzature; III) pronto adattamento ad altri tessuti e specie come è stato applicato con successo con alterazioni minori in biopsie dell'intestino umano12 e mouse polmone13; e, soprattutto, iv) può indirizzare le proprietà biomeccaniche ECM consentendo il montaggio di colture organotipiche di tipo 3D che più strettamente imitare le caratteristiche molecolari del microambiente tissutale nativa.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Benchtop Shaker</td><td>Agitatori orbitali</td><td>IKA:3510001</td><td>Fluorimetro consigliato</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura disponibile</td></tr><tr>--<td>Bilancia digitale</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura disponibile</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura disponibile</td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td> <td>-</td><td></td> <td>Attrezzature disponibili</td></tr><tr><td>Frigorifero (4&ordm; C)</td><td>-</td><td>-Attrezzature</td> <td>disponibili</td></tr><tr><td>Congelatore (-80&ordm; C)</td><td>-</td><td>-Attrezzatura</td> <td>disponibile</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura disponibile</td></tr><tr><td>Strumenti cirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici a molla - 2,5 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>5000-08</td><td>Consigliato</td></tr><tr><td>Dumont 5 Pinze fini - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Consigliato</td></tr><tr><td>Dumont 7 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione consigliate, diritte</td> <td>-</td><td></td> <td>Strumento disponibile</td></tr><tr><td>Pinze, seghettate, curve</td> <td>-</td><td></td> <td>Strumento disponibile</td></tr> <tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti, confezionate singolarmente</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td>-</td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti, confezionate singolarmente</td><td>VWR</td><td>71000-078-Steriflip-GV</td><td></td></tr><tr><td>, 0,22&micro; m, PVDF, Millipore radio-sterilizzato</td><td></td><td></td> <td>SE1M179M6-Eppendorff</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Materiale disponibile</td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td> Provette <td>Falcon Fisher Scientific</td><td></td> <td>430791-50</td></tr> <tr><td>mL</td> Cassette <td>Fisher Scientific</td> <td>430829-Four-Compartment</td><td></td></tr> <tr><td>Biopsy Processing/Embedding con coperchio</td><td>Microscopia elettronica Science</td><td>70075-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>-</td></tr><tr><td>Crioconservazione tissutale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon Resina per inclusione Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>6769006-2-METILBUTANO ANIDRO 99+% (isopentano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258-1L-Ghiaccio</td><td></td></tr> <tr><td>secco</td><td>- </td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td><forte>Decellularizzazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Prolabo</td><td>27810.364-Na</td><td></td></tr><tr><td>2</sotto>HPO<sotto>4</sotto></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-31264-KH</td><td></td></tr><tr><td>2</sotto>PO<sotto>4</sotto></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100g-KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041-1KG-TrisBASE</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G-Sodio</td><td></td></tr> <tr><td>dodecil solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390-MgCl</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>MERCK</td><td>1.05833.1000-DNAse</td><td></td></tr> <tr><td>I</td><td>AplliChem</td><td>A3778,0050-Gentamicin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Acqua</td><td></td></tr> <tr><td>deionizzata (acqua deionizzata)</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td><forte>Istologia</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % tampone neutro in formalina</td><td>Prolabo</td><td>361387P-eosina</td><td></td></tr> <tr><td>Y AQUEOUS</td><td>Surgipath</td><td>01592E</td><td>Può essere sostituito da eosina alcolica</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific HistoGel Gel per la lavorazione dei campioni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012-Etanolo</td><td></td></tr> <tr><td>alcool etilico 99,5% anydrous</td><td>Aga</td><td>4,006,02,02,00-Acqua</td><td></td></tr> <tr><td>deionizzata (acqua deionizzata)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Clear Rite 3</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>6915-Shandon</td><td></td></tr> <tr><td>Histoplast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RAS.6774006</td><td>-</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>K182001-Quant-iT PicoGreen&nbsp; Kit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>-</td></tr><tr><td>Coltura cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR</td><td>45000-434-Penicillina-Streptomicina</td><td></td></tr> <tr><td>Soluzione 100X</td><td>Labclinics</td><td>L0022-100-Fungizone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Terreni</td><td></td></tr> <tr><td>di coltura cellulare della cellula di interesse</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3d-come le piattaforme per studi in vitro

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Conoscenze attuali della matrice extracellulare (ECM)-comunicazione cellulare si traduce in studi di grande bidimensionale (2D) coltura in vitro dove componenti dell'ECM sono presentati come un rivestimento superficiale. Questi sistemi di cultura costituiscano una semplificazione della natura complessa del tessuto ECM che racchiude la composizione biochimica, struttura e proprietà meccaniche. Per meglio emulare la comunicazione ECM-cellula che modella il microambiente cardiaco, abbiamo sviluppato un protocollo che consente di decellularizzazione del cuore intero fetale e tessuto adulto ventricolo sinistro espianti simultaneamente per studi comparativi. Il protocollo combina l'uso di un buffer ipotonico, un detergente di proprietà di tensioattivo anionico e trattamento della dnasi senza alcun requisito per competenze specialistiche o attrezzature. L'applicazione della stessa strategia di decellularizzazione attraverso campioni di tessuto da soggetti di età diverse è un approccio alternativo per eseguire studi comparativi. Il presente protocollo permette l'identificazione delle differenze strutturali uniche attraverso fetali ed adulte cardiaco ECM mesh e biologico delle risposte cellulari. Inoltre, la presente metodologia viene illustrata un'applicazione più ampia essere applicata con successo in altri tessuti e specie con piccoli aggiustamenti, come ad esempio nelle biopsie dell'intestino umane e polmone del topo.

L'efficienza di decellularizzazione dovrebbe essere valutato attraverso tre principali tecniche: osservazione macroscopica, istologia e quantificazione del DNA. L'apparenza macroscopica del trattamento post-SDS campioni colpisce indirettamente l'efficacia di rimozione delle cellule. Dopo l'incubazione di SDS, campioni dovrebbero apparire come traslucidi al biancastro (Figura 1). Fetale (E18) decellularizzazione tessuti sono caratterizzati da una struttura alt...

Cardiaca matrice extracellulare (ECM) è una complessa rete di molecole che orchestrano processi chiave in tessuti e organi pur sopportando fisiologico rimodellamento per tutta la vita. Decellularizzazione standardizzata dei cuori fetali ed adulti permette studi comparativi sperimentali di entrambi i tessuti in un contesto 3D mediante l'acquisizione di architettura nativa e proprietà biomeccaniche.

Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare importanti domande in campo cardiovascolare sull'impatto che la matrice extracellulare ha durante diverse fasi fisiologiche e di sviluppo del cuore. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi comparativa tra matrici extracellulari fetali e adulte applicando un metodo di decellularizzazione simile a entrambi i tipi di tessuto. Quindi questo metodo è stato applicato con successo ad altri organi come le resezioni chirurgiche dei pazienti oncologici che facilitano lo studio della matrice extracellulare in diversi contesti.Inizia risciacquando brevemente il cuore fetale e adulto del topo con PBS ghiacciato. Quindi posizionare i tessuti sotto un microscopio sezionante e utilizzare piccole forbici dritte per rimuovere gli atri, il ventricolo destro e il setto dai cuori adulti del topo. Trasferire il ventricolo sinistro in una nuova piastra di Petri e dividere la parete libera del ventricolo sinistro in strisce longitudinali spesse due millimetri.L'uso di espianto ventricolo sinistro del topo adulto di dimensioni omogenee è essenziale per una costante efficienza di decellularizzazione. Utilizzare il bisturi e le pinzette segh

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Questo video mostra un metodo per produrre matrice extracellulare decellularizzata o scaffold ECM applicando la perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare. Gli scaffold strutturali della ECM possono quindi essere utilizzati per analizzare il rimodellamento della ECM associato alla malattia cardiopolmonare.

Decellularizzazione del complesso cardiopolmonare: una tecnica per la decellularizzazione di cuore e polmoni da un modello murino

Un metodo per rimuovere rapidamente e completamente componenti cellulari da un cuore suino intatta attraverso perfusione retrograda viene descritto. Questo metodo fornisce uno specifico sito cardiaca matrice extracellulare ponteggio che ha il potenziale per l'utilizzo in molteplici applicazioni cliniche.

Procedura per decellularizzazione del Cuore di suino da retrograda perfusione coronarica

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

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Lavorazione di tessuto cardiaco umano verso la matrice extracellulare autoassemblanti idrogel per In Vitro e In Vivo applicazioni

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Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito

Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

In questo lavoro, un protocollo di decellularizzazione è stato ottimizzato per ottenere matrici decellularizzate del muscolo scheletrico fetale del topo. I mioblasti C2C12 possono colonizzare queste matrici, proliferare e differenziarsi. Questo modello in vitro può essere utilizzato per studiare il comportamento cellulare nel contesto di malattie del muscolo scheletrico come le distrofie muscolari.

Preparazione di matrici decellularizzate 3D da muscolo scheletrico fetale di topo per coltura cellulare

I fibroblasti isolati dal cuore umano adulto sono stati coltivati fino alla confluenza su piastre rivestite di gelatina per produrre la matrice extracellulare specifica del miocardio. Dopo la decellularizzazione, questo substrato può essere utilizzato per la coltura e lo studio di altre cellule cardiache e delle interazioni cellula-matrice.

Produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Scopri la decellularizzazione comparata di cuori fetali e adulti di topo per analizzare le proprietà della matrice extracellulare cardiaca in 3D. Questo metodo standardizzato facilita la ricerca cardiovascolare.

Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro (Video) | JoVE Journal

Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro

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