Name: Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Scopri un modello murino preclinico di osteosarcoma per studiare la comunicazione mediata da vescicole extracellulari tra tumore e cellule staminali mesenchimali. Questo metodo aiuta a comprendere la progressione tumorale in vivo.

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S.R. Baglio è stato sostenuto da una borsa di studio di Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-finanziato dall'Unione europea. Inoltre, questo progetto ha ricevuto non finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie 660200 (al S.R. Baglio).

Adiposo umano per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali sono state ottenute dal reparto di chirurgia plastica dell'ospedale Tergooi (Hilversum, Paesi Bassi) dopo l'approvazione dal comitato etico istituzionale e consenso informato scritto. MSCs adiposa GFP-positivi sono stati ottenuti dal dipartimento di scienze mediche e chirurgiche per bambini e adulti (Università di Modena e Reggio Emilia).
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge olandese sulla sperimentazione animale, e il protocollo è stato approvato dal Comitato sulla sperimentazione animale del centro medico Vrije Universiteit, Amsterdam, Paesi Bassi.
1. isolamento delle vescicole extracellulari secrete del tumore.
<ol><li>Preparare EV-vuotati fetale del siero bovino (FBS) mediante centrifugazione FBS a 70.000 x g durante la notte (16 ore), nessun freno, a 4 ° C, utilizzando un rotore ultra-oscillante (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione e raccogliere il surnatante (EV-vuotati FBS) senza disturbare il pellet. Filtrare la FBS EV-vuotati con un filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Preparare EV-vuotati colturale completando Medium (IMDM per volta Dulbecco di Iscove) con 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, glutammina 2 mM (1 x P/S/G) e 5% FBS EV-vuotati.</li>
	<li>3 x 106 143B cellule in boccette di 175 cm2 di semi e li della coltura in terreno di coltura EV-vuotati in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Quando le cellule sono 80-90% confluenti (in genere dopo 36 h a 48 h), è possibile raccogliere il surnatante da 8 x 175 cm2 boccette (28 mL/boccetta) per EV-isolamento.</li>
	<li>Pre-cancellare il surnatante delle cellule per rimuovere le cellule e detriti cellulari tramite centrifugazione differenziale (centrifugazione il surnatante dello spin precedente ogni volta) secondo il seguente protocollo:<ol>
<li>Centrifugare il surnatante due volte a 500 x g per 10 min.</li>
		<li>Centrifugare il supernatante due volte a 2000 x g per 15 min.</li>
		<li>Centrifugare il surnatante due volte a 10.000 x g per 30 min.</li>
		<li>Eseguire tutte le centrifugazioni a 4 ° C con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni. Dopo ogni passaggio, è necessario raccogliere con cura il supernatante contenente EV, lasciando circa 1 mL. Procedere immediatamente per passo 1.5 o negozio pre-sgomberati condizionata medio a-80 ° C fino a EV isolamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolare il server virtuale di Exchange mediante centrifugazione il medium condizionato pre-cancellato una volta a 70.000 x g per 1 h, lento freno, a 4 ° C in provette da ultra-centrifuga (volume finale 38,5 mL/tubo) utilizzando un rotore ultra oscillante.</li>
	<li>Eliminare il surnatante, lasciando circa 1 mL dietro, risospendere il pellet contenente EV nel volume restante attentamente, piscina li tutti in una provetta di ultracentrifuga e aggiungere tampone fosfato salino (PBS) fino al riempimento completo tubo (volume finale mL 38,5).</li>
	<li>Centrifugare nuovamente a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione, rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet e dimentichi di 100-200 µ l.</li>
	<li>Risospendere il pellet di EV e regolare il volume finale a 200 µ l con PBS (standardizzato per tutti i EV-isolamenti). Utilizzare la preparazione EV immediatamente o conservare a-80 ° C fino a uso22. Nota: EVs possono essere conservati fino a 6 mesi a-80 ° C.</li>
</ol>2. EV caratterizzazione.
Purificata EVs possono essere visualizzate da trasmissione microscopia elettronica (TEM)23.
<ol><li>Preps mix EV con un volume uguale di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato.</li>
	<li>Cappotto 200 mesh griglie TEM di nichel rivestita di carbonio Formvar con 5 µ l di sospensione di EV per 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Fissare i campioni EV su griglie TEM con 1% di glutaraldeide in 0.1 M tampone fosfato (pH 7.0), contrasto con ossalato di uranile (pH 7.0) e incorporare in una miscela di 4% uranile acetato e 2% metil cellulosa in un rapporto di 1:9 su ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere le griglie con passanti in acciaio inox e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro per garantire un adeguato spessore di pellicola di cellulosa di metile.</li>
	<li>Dopo l'essiccazione, esaminare le griglie con un microscopio elettronico a trasmissione e catturare immagini con una fotocamera digitale accoppiata al software di immagine corrispondente.</li>
</ol>3. formazione delle MSC di tumore-derivato EVs.
<ol><li>Preparare il terreno di coltura MSC completando alfa-minimo mezzo essenziale (alfa-MEM) con 4% EV-vuotati umana della piastrina Lysate (hPL)24, eparina (10 U/mL) e 1 x P/S/G. Nota: EV-vuotati hPL è ottenuta seguendo la procedura descritta nella sezione 1.1.</li>
	<li>Seme 1.4 x 106 adiposo-derivate MSCs per fiaschetta di 75 cm2 e loro la cultura a EV-vuotati MSC-coltura in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Quando cellule raggiungono 70% confluenza, aggiungere 143B osteosarcoma - o controllare i fibroblasti umani (hf)-SVE, 10 µ l EV preparazione/cm2 di matraccio di cultura. Incubare per 24 ore e aggiungere la stessa quantità di EVs per ulteriori 6 ore. Nota: I fibroblasti umani sono coltivati in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) 10% FBS e SVE sono isolati come descritto nella sezione 1.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante MSC, centrifugare 1x a 500 x g per 5 min a 4 ° C (con massima accelerazione e decelerazione velocità impostazioni), trasferire in una nuova provetta e conservare il supernatante eliminato a-80 ° C per attivare l'analisi del futuro citochina (sezione 5).</li>
	<li>Per in vivo esperimenti (sezione 6), educare GFP-positive MSCs25 come descritto nelle sezioni 3.1 a 3.3, raccogliere le cellule e loro risospendere in PBS ad una concentrazione finale di 106 cellule per 100 µ l. cellule di tenere il ghiaccio fino a iniezione.</li>
</ol>4. EV interiorizzazione Assay.
Per visualizzare l'assorbimento EV di MSCs, etichetta SVE con un colorante fluorescente verde del linker (GFLD) (disponibile in commercio) seguendo il protocollo del produttore:
<ol><li>Brevemente, aggiungere 180 µ l di diluente per la preparazione di EV 200 µ l. Diluire 1 µ l di colorante GFLD in 50 µ l di diluente e aggiungere 20 µ l di colorante diluito il prep EV diluito.</li>
	<li>Delicatamente mescolare pipettando e incubare per 3 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 0,1% BSA in PBS, trasferimento a ultra-provette e riempire il tubo con PBS (volume finale 38,5 mL/tubo).</li>
	<li>Centrifugare 1 x a 70.000 x g per 1 h a 4 ° C, senza freno (si aspettano 1 h per decelerazione). Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il EV-pellet con etichettato in un volume finale di 200 µ l (regolazione del volume con PBS).</li>
	<li>Aggiungere il servizio volontario europeo con etichettato alla cultura MSC, e conservare a-80 ° C. Dopo l'incubazione overnight, valutare interiorizzazione della vescicola mediante microscopia a fluorescenza e flusso cytometry7.</li>
</ol>5. valutazione del profilo di espressione di citochina MSC.
<ol><li>Per la quantificazione multisala di interleukin-8 (IL-8), interleuchina-1 β (IL-1 β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), fattore di necrosi tumorale (TNF) e interleukin - 12p 70 (IL - 12p70) livelli della proteina in MSC condizionata medio (Vedi punto 3.4), utilizzare un matrice di perlina cytometric commercialmente disponibile (CBA) per citochine infiammatorie umane seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Brevemente, mescolare le perle cattura anticorpo coniugato e aggiungerli a tutte le provette. Aggiungere le diluizioni standard di citochine o i campioni medi condizionati ai tubi.</li>
	<li>Aggiungere il reagente di rivelazione e incubare per 3 ore a TA.</li>
	<li>Lavare le perle con la soluzione di lavaggio fornita. Misurare i campioni utilizzando un citometro a flusso e analizzare i dati secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>6. generazione di un modello di topo Orthotopic dello xenotrapianto di Osteosarcoma.
<ol><li>Consentire sei-settimana-vecchio, donna, topi Athymic Nude-Foxn1nu acclimatare per almeno una settimana prima di iniziare le procedure sperimentali.</li>
	<li>Un giorno prima dell'intervento chirurgico e come analgesia peri-operatorio aggiungere paracetamolo per l'acqua potabile. Diluire "paracetamolo soluzione per bambini" (Vedi Tabella materiali) con acqua per ottenere una concentrazione finale di 2 mg/mL. Basato su un'assunzione media dell'acqua di 150 mL/kg/giorno, e un peso medio di 20 g, questa dose è sufficiente per raggiungere un dosaggio di 6 mg/mouse/giorno (300 mg/kg/giorno).</li>
	<li>Continuare il trattamento analgesico fino a 24 ore dopo l'operazione, o più se gli animali mostrano segni di dolore.</li>
	<li>Il giorno della procedura chirurgica, raccogliere cellule coltivate di luciferasi-positivi (Fluc) 143 ter (precedentemente generate attraverso la trasduzione lentivirale) mediante centrifugazione a 300 x g per 10 min e risospendere le cellule ad una concentrazione di 2 x 105 cellule / µ l di PBS. Tenere la sospensione cellulare su ghiaccio fino a 6 ore.</li>
	<li>Apparecchiature chirurgiche di autoclave. Preparare e pulire l'area di lavoro e inserire le forbici sterilizzate e pinzette sterili fogli. Venti minuti prima che la procedura chirurgica (passo 6,8), iniettare gli animali per via sottocutanea con buprenorfina (0,05 mg/kg, diluito in soluzione fisiologica allo 0,9%) come analgesico utilizzando siringhe da insulina 0,5 mL (ago 29-gauge).</li>
	<li>Poco prima anestetizzando ogni animale, riempire una siringa 10 µ l con almeno 1 µ l della sospensione delle cellule (Fluc) 143B concentrata (Vedi punto 6.4).</li>
	<li>Anestetizzare l'animale con anestesia inalazione isoflurane (2-3% di ossigeno). Controllare il livello dell'anestesia di punta-pizzicare l'animale. Quando l'animale non reagisce ad i pizzicotti, cioè, che esso è profondamente anestetizzato, applicare unguento per gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.</li>
	<li>Posizionare l'animale sul dorso con la testa in una mascherina dell'anestesia e con le gambe verso l'operatore. Flettere il ginocchio sinistro. Pulire la pelle con etanolo al 70% e applicare lidocaina (2%) con una punta di cotone 3 volte come analgesico locale.</li>
	<li>Utilizzare un coltello chirurgico sterile per praticare una piccola incisione (circa 5 mm) sulla pelle appena sotto il ginocchio per esporre la tibia. Praticare un foro nella tibia, circa 2 mm sotto il ginocchio con un trapano di torsione micro 0.8 mm. Fare attenzione a non forare entrambi cortecce di tibia.</li>
	<li>Iniettare il foro con un ago da 26-gauge sospensione di 1 µ l delle cellule (circa 2 x 105 cellule) lentamente (in circa 5 secondi). Chiudere il foro con una goccia di colla del tessuto per evitare il riflusso della sospensione.</li>
	<li>Chiudere la pelle con suture monofilamento e una goccia di colla del tessuto. Lasciate che il recupero degli animali in un ambiente ben riscaldato (uso una lampada di calore). Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Solo dopo che gli animali sono pienamente recuperati dall'anestesia, restituirli alle loro gabbie.</li>
	<li>Due giorni dopo l'inoculazione del tumore, iniettare EV educato o MSCs ingenuo GFP-positive (106 cellule in 100 µ l di PBS, vedi punto 3.5) per via endovenosa con una siringa da insulina 0,5 mL nella vena caudale dei topi.</li>
	<li>Seguire la crescita del tumore di bioluminescenza imaging26 due volte a settimana. A tal fine, iniettare il i.p. di topi con 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina. Dieci minuti dopo l'iniezione, posizionare gli animali nella bioluminescenza sistema di imaging e misurare il flusso di fotoni generato dalle cellule del tumore.</li>
	<li>Inoltre, misurare il diametro del osso-tumore primario con una pinza. Il volume del tumore (in mm3) stima di larghezza x di lunghezza2 x 0,5.</li>
	<li>Nota: Humane endpoint sono definiti come il diametro del tumore > 15mm o perdita di peso > 15%.</li>
</ol>7. la valutazione del numero di nodulo polmonare
<ol><li>Quando uno degli animali raggiunge l'endpoint umano definito nel passaggio 6.14 (in circa 3-4 settimane), terminare l'esperimento e raccogliere e analizzare tutti i tessuti interessati.</li>
	<li>Dieci minuti prima euthanization, iniettare 150 µ l D-luciferina (30 mg/mL) con una siringa da insulina 0,5 mL.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali con anestesia inalazione isoflurane (Vedi punto 6.7). Confermare la profondità dell'anestesia per l'assenza di reazioni del mouse a punta-pizzicare. Eutanasia i topi da dislocazione cervicale27.</li>
	<li>Raccogliere i polmoni, fegato, milza e reni, con pinzette e forbici sterilizzate. Lavare gli organi in PBS per rimuovere le tracce di sangue e metterli su una piastra di Petri.</li>
	<li>Posizionare la piastra di Petri con gli organi nella bioluminescenza sistema di imaging. Misurare il segnale di bioluminescenza su entrambi i lati degli organi. Immediatamente dopo la misurazione, immergere gli organi in formalina 4% di loro fissarsi (24-72 ore, a temperatura ambiente) per future analisi istologica.</li>
	<li>Elaborare le immagini ottenute con appropriato software di imaging di soglia manuale. Contare il numero di noduli polmonari su ogni immagine. Contare il numero totale dei noduli polmonari su entrambi i lati dei polmoni.</li>
</ol>8. istologici
<ol><li>Per l'analisi istologica del tessuto polmonare:<ol>
<li>Incorporare gli organi in formalina in paraffina e preparare i vetrini di tessuto 6 µm.</li>
		<li>Deparaffinate il tessuto polmonare diapositive ed effettuare ricupero dell'antigene, facendoli bollire per 15 minuti in tampone citrato 0.01 M (pH 6).</li>
		<li>Incubare i vetrini in posizione orizzontale a temperatura ambiente con il vimentin anti-umano dell'anticorpo (200 µ g/mL) diluito 1: 150 in anticorpo-diluente (disponibile in commercio) e successivamente con l'anticorpo secondario, HRP-etichettato (0,5 mg/mL, diluizione 1: 500). Macchiare i tessuti con 3'-diaminobenzidina (DAB) e contatore di ematossilina.</li>
		<li>Osservare i vetrini di tessuto macchiato con un microscopio ottico accoppiato alla telecamera corrispondente e immagine software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per valutare la presenza di GFP-positive MSCs in tibie del mouse:<ol>
<li>Decalcificare le tibie in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,24 M, pH 7,2-7,4. Aggiornare la soluzione tampone dell'EDTA ogni giorno fino alle ossa diventano flessibili (circa 1 settimana).</li>
		<li>Disidratare tibie e infiltrarsi loro con paraffina. Incorporare le tibie (compreso osteosarcoma tessuto) in blocchi di paraffina.</li>
		<li>Utilizzare un microtomo per preparare 6 sezioni di paraffina µm. Inserire le sezioni di paraffina su vetrini. Dopo l'essiccazione, memorizzare diapositive durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eseguire il recupero di calore-mediata antigene utilizzando tampone citrato (Vedi 8.1.2) e macchia i tessuti con l'anticorpo anti-GFP (intero antisiero) in una diluizione di 1:900 in anticorpo-diluente. Colorante di contrasto dei tessuti con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>Osservare i vetrini di tessuto con un microscopio a fluorescenza accoppiato per il corrispondente software di imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Lin, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+exosomes+endow+mesenchymal+stromal+cells+with+tumour-promotion+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities.</a> Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Tumore-secreto di vescicole extracellulari (SVE) possono alterare la fisiologia delle cellule mesenchimali locali e distanti per generare un ambiente favorevole del tumore. Qui descriviamo la generazione di un modello murino preclinico di osteosarcoma che consente una dissezione delle interazioni EV-mediata tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali (MSCs) in vivo. Mostriamo che iniezione sistemica del tumore umano MSCs EV-educato in topi che sopportano gli xenotrapianti osteosarcoma fortemente promuo...

Il microambiente tumorale partecipa attivamente in maggior parte, se non tutti, gli aspetti della progressione nella tumorigenesi e cancro, tra cui la formazione di metastasi e lo sviluppo della resistenza alla terapia1. Questo sottolinea la necessità di modelli murini di cancro preclinica orthotopic che consentono la dissezione delle interazioni tumore-stroma complesse che si verificano nella nicchia del tumore.
Tra i molti componenti cellulari del microambiente tumorale, cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuiscono fortemente alla progressione tumorale in diversi tipi di cancro come cancro al seno, cancro della prostata, i tumori cerebrali, mieloma multiplo e l'osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs sono cellule staminali multipotenti che si trovano in vari tessuti adulti e fetali, compreso il midollo osseo, il tessuto adiposo, placenta, sangue del cordone ombelicale e gli altri8,9. In risposta a segnali infiammatori generati dal cancro, MSCs migrare verso siti tumorali, incorporare nel microambiente tumorale e, in definitiva, differenziarsi in supporto di cancro cellule10. Questi MSCs cancro-collegati forniscono fattori essenziali (cioè, i fattori di crescita, chemochine, citochine e mediatori immunosoppressivi) per la progressione del tumore, che agiscono sia sulle cellule del tumore e lo stroma circostante2, 3 , 11 , 12 , 13. mentre gli effetti dipromozione di MSCs cancro-collegati sono stati studiati nei numerosi modelli di cancro, i meccanismi da cui le cellule del tumore riprogrammare MSCs per modellare una nicchia dipromozione sono capiti male. Qui descriviamo la generazione di un modello di xenotrapianto ortotopico che consente in particolare lo studio dell'interazione pro-cancerogeno tra cellule tumorali dell'osso e MSCs tramite vescicole extracellulari (EVs).
SVE sono mediatori cruciali della comunicazione intercellulare tra tumore e cellule stromali14. SVE trasportano biomolecole funzionale della cellula di origine, tra cui proteine, lipidi e RNA regolatori. Una volta rilasciato nello spazio extracellulare, queste vescicole possono essere preso dalle cellule circostanti o trasportato ai luoghi distanti tramite il sangue o la circolazione linfatica e possono influenzare profondamente il comportamento della cella di destinazione. 15 , 16 , 17 per esempio, l'assorbimento di cancro EVs dai fibroblasti stromal può provocare nella differenziazione dei miofibroblasti sostenendo l'angiogenesi e accelerando tumore crescita in vivo18,19, interiorizzazione di endoteliale cellule in grado di stimolare l'angiogenesi del tumore e aumentare la permeabilità vascolare16,20, e l'interazione con le cellule immunitarie potrebbe portare alla soppressione della risposta immunitaria antitumorale21.
Recentemente abbiamo dimostrato, utilizzando un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma, che le cellule del tumore rilasciano elevate quantità di EVs che richiedono MSCs per acquisire un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Questo effetto è dovuto ad un drammatico cambiamento nel profilo di espressione di citochina MSC (denominato "Formazione MSC") e può essere prevenuto con la somministrazione di un anticorpo di terapeutico del ricevitore interleukin-6 (IL-6R)7. Nostro lavoro ha dimostrato che il cancro SVE sono cruciali nella modulazione del comportamento MSC, così fornendo una spiegazione razionale per approcci mirati microambiente per fermare la progressione di osteosarcoma. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare l'interazione tumore-MSC EV-mediata in vivo. Questo modello è destinato a: 1) in particolare definire le alterazioni di EV-indotta di cancro di comportamento MSC nel microambiente tumorale, 2) valutare come questa interazione contribuisce alla crescita del tumore dell'osso e la formazione di metastasi e 3) Studio se interferiscono con la diafonia EV-mediata in vivo impedisce la progressione del cancro.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuga</td><td>Beckman</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Rotore SW32Ti</td><td>Beckman</td><td>369650</td><td>Indicato nel manoscritto come rotore a secchio ultra-oscillante</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Zeiss</td><td>EM109</td><td>O simile TEM</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Nikon</td><td>DMX 1200F</td><td>O fotocamera simile</td></tr><tr><td>Software di imaging TEM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>ACT-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Imager.D2</td><td>O simile Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Software di imaging FM</td><td>Zeiss</td><td>ZEN Blue</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nuaire</td><td>4750E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hettick</td><td>ROTANTA 460R-80</td><td></td></tr> <tr><td>Congelatore</td><td>Thermo electro corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>BD FACScalibur</td><td>O citometro a flusso simile</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ferm</td><td>FCT-300</td><td>Con trapano da 0,8 mm</td></tr><tr><td>Micro punte elicoidali HSS, 0,8 mm</td><td>Proxxon</td><td>28 852</td><td>Trapano da 0,8 mm</td></tr><tr><td>Telecamera IVIS</td><td>Xenogen</td><td>Ivis Lumina</td><td>Indicato nel manoscritto come telecamera a bioluminescenza. Xenogen fa ora parte del software di immagine Perkin Elmer</td></tr><tr><td>Living2.60</td><td>Xenogen / Igor Por</td><td>n.a</td><td>Xenogen fa ora parte di Perkin Elmer</td></tr><tr><td>10 &micro; L Siringa</td><td>Hamilton</td><td>Neuros Modello 1701 RN</td><td></td></tr><tr><td>Ago: Hamilton RN Ago per siringa, calibro 26, Pointstyle AS, lunghezza personalizzata 2 cm</td><td>Hamilton</td><td>n.a.Pinza</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>G08004463</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Astell</td><td>n.a.Lampada</td><td></td></tr> <tr><td>termica</td><td>Philips</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>Hyclone</td><td>RYG35912</td><td></td></tr><tr><td>Platelet Lysate</td><td>n.a.n.a.IMDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-722F</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE02-002F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>pen/streptococco/glutammina</td><td>GIBCO</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>eparina</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (10x)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td><forte>Cellule</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adiposa deriverd MSCs</td> n.a.n.a.GFP-positive <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSCs</td> n.a.n.a.fiblasti <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>umani</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Celle 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Celle FLUC-143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>Trasdotte</td></tr><tr><td><forti>Monouso</forti></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staffe di coltura 175 cm2</td><td>CELLSTAR</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>Provette per congelamento</td><td>377224 termoscientifico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette ultratrasparenti</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Indicato nel manoscritto come provette ultra-centrifughe</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtro</td><td>Millex SLGV033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh Formvar-carbon-coated nickel griglie</td><td>EMS (Electron Microscopy Sciences)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da insulina da 0,5 mL con ago da 29G</td><td>Terumo</td><td>U-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P7612</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>50363215</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti / kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Alfa Aeser</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Braun</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>EMS (Scienze della microscopia elettronica)</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>ossalato di uranile</td><td>EMS (Microscopia elettronica Scienze)</td><td>22510</td><td></td></tr><tr><td>acetato di uranio</td><td>EMS (Scienze della microscopia elettronica)</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>metilcellulosa</td><td>EMS (Scienze della microscopia elettronica)</td><td>1560</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>mini67-1kt</td><td>Indicato nel manoscritto come GFLD</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CBA - kit di citochine infiammatorie umane</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 37%</td><td>VWR</td><td>104003100</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche in acciaio al carbonio</td><td>Swann-Morton</td><td>206</td><td>Indicato nel manoscritto come coltello chirurgico</td></tr><tr><td>anticorpo anti-vimentina umana</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6260</td><td>Clone V9</td></tr><tr><td>Diluente anticorpale</td><td>DAKO</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG di topo marcato con HRP</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>32230</td><td></td></tr><tr><td>DAB-kit DAKO</td><td></td><td>K500711</td><td></td></tr><tr><td>ematossillina</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buffer</td><td>n.a.n.a.Tampone</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>citrato</td><td>n.a.n.a.rabbit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>policlonale anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>n.a.Ab290</td><td></td></tr> <tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamolo, 120 mg / 5 ml sciroppo</td><td>Bayer</td><td>n.a.Sinaspril</td><td>, soluzione di paracetamolo per bambini</td></tr><tr><td>Isoflurano 1000 mg/g</td><td>Vumc farmacia</td><td>n.a.buprenofina</td><td></td></tr> <tr><td>cloridrato, 0,3 mg/ml</td><td>Indivior UK Limited</td> n.a.lidocaina-HCL <td></td><td></td></tr><tr><td>2%</td><td>Vumc farmacia</td><td>n.a.70</td><td></td></tr><tr><td>% etanolo</td><td>VWR</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Colla tissutale</td><td>Derma+Flex, formulata cianoacrilato medico</td><td>Vygon</td><td>LB604060</td></tr><tr><td>Collirio: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml</td><td>Bausch+Lomb</td><td>n.a.D-luciferina</td><td></td></tr><tr><td>, sale di potassio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Thermo scientific</td><td>630-0954</td><td></td></tr><tr><td>Anelli in acciaio inossidabile&nbsp;</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td></td></tr><tr><td>Esperimenti sui topi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topi, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu,&nbsp; femmina, 6 settimane all'arrivo, stato batterico conforme FELASA</td><td>ENVIGO</td><td>n.a.Paper-pulp</td><td></td></tr> <tr><td>smart home (arricchimento della gabbia)</td><td>Bio Services</td><td>n.a.Alpha-dri</td><td></td></tr> <tr><td>materiale da lettiera</td><td>Shepperd Speciality Papers</td><td>n.a. </td><td></td></tr><tr><td>Cibo per topi: Teklad global 18% protein dieta per roditori</td><td>ENVIGO</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon</td><td>V926H</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td> <td>(o simile)</td></tr> <tr><td>Pinzetta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142-1EA</td> <td>(o simile)</td></tr></tbody></table>

un modello murino preclinico di osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

All'interno del microambiente tumorale, residente o reclutate cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuire alla progressione maligna in diversi tipi di cancro. Sotto l'influenza di specifici segnali ambientali, queste cellule staminali adulte possono rilasciare mediatori paracrini che conduce alla crescita accelerata del tumore e metastasi. Definire il crosstalk tra tumore e MSCs è di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base di progressione del cancro e identificare nuovi bersagli per interventi terapeutici.
Le cellule tumorali producono elevate quantità di vescicole extracellulari (EVs), che possono influire profondamente sul comportamento delle cellule bersaglio nel microambiente tumorale o ai luoghi distanti. Tumore EVs racchiudere biomolecole funzionali, tra cui infiammatoria RNA e proteine (onco), che possono educare le cellule stromal per migliorare il comportamento metastatico delle cellule tumorali o per partecipare alla formazione di nicchia pre-metastatico. In questo articolo, descriviamo lo sviluppo di un modello murino di cancro preclinica che consente la valutazione specifica del crosstalk EV-mediata tra tumore e cellule staminali mesenchimali. In primo luogo, descriviamo la purificazione e la caratterizzazione del tumore-secreto SVE e alla valutazione di interiorizzazione EV di MSCs. Quindi facciamo uso di un immunodosaggio basato su perlina multiplex per valutare l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotta da cancro EVs. Infine, ci illustrano la generazione di un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma che ricapitola l'interazione tumore-MSC e mostrare il contributo delle MSC EV-educato a formazione di crescita e la metastasi del tumore.
Il nostro modello offre l'opportunità di definire come cancro EVs forma un ambiente di supporto di tumore e per valutare se il blocco della comunicazione fra il tumore e MSCs EV-mediato previene la progressione del cancro.

In questo studio, abbiamo esplorato la possibilità di sve osteosarcoma-secreto di educare MSCs verso un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Mostriamo che cellule di osteosarcoma rilasciano EVs esosomi-like che sono interiorizzati da MSCs. Abbiamo misurato l'alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotto da cancro EVs ed abbiamo valutato l'effetto di MSCs EV-istruiti sulla crescita del tumore e la formazione di metastasi. La rappresentazione generale del disegno de...

Iniezione diretta di cancro-derivato di vescicole extracellulari (SVE) conduce alla riprogrammazione del midollo osseo, sostenendo la progressione del tumore; Tuttavia, le celle che mediano questo effetto è poco chiaro. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare EV-mediata di cellule staminali tumorali mesenchimali (MSC) interazioni in vivo, rivelando un ruolo cruciale per MSCs EV-educato in metastasi.

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di sviluppare un modello murino preclinico per studiare il ruolo della comunicazione extracellulare mediata dalle vescicole tra cellule staminali tumorali e mesenchimali. Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave nel campo della biologia del cancro, su come il tumore e le cellule staminali mesenchimali comunicano per mezzo di vescicole extracellulari e se questo supporta la progressione del cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di studiare il ruolo dell'adattamento delle cellule staminali mesenchimali da parte delle vescicole extracellulari tumorali, sulla progressione e la formazione di metastasi in vivo.L'implicazione di questa procedura si estende alla nostra terapia del cancro, perché possiamo usare il GSA per interferire con la comunicazione EV e la segnalazione degli androgeni per inibire la progressione del cancro. Oltre a fornire informazioni sulla comunicazione mediata dalle EV nell'osteosarcoma, questo metodo può essere applicato anche a molti altri tipi di cancro. Infatti, il midollo osseo derivato dalle cellule staminali mesenchimali viene prontamente reclutat

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Il nuovo protocollo riportato nel presente studio permette la rilevazione selettiva delle metastasi polmonari con una risoluzione singola cellula nei topi...

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Questo video presenta la procedura chirurgica per la resezione tumorale guidata da immagini e l'impianto di un bio-scaffold seminato con cellule staminali mesenchimali geneticamente modificate o MSC che esprimono il ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale o TRAIL. Queste MSC terapeutiche hanno il potenziale nel trattamento dei tumori cerebrali.

Resezione tumorale guidata da fluorescenza e impianto di scaffold seminato con MSC in modello murino: una procedura chirurgica per fornire cellule staminali mesenchimali terapeutiche nella cavità di resezione del tumore cerebrale in un modello murino

Questo manoscritto descrive lo sviluppo di un modello animale che permette di testare direttamente gli effetti dell'ipossia tumorale sulle metastasi e di decifrare i meccanismi della sua azione. Sebbene gli esperimenti qui descritti si concentrino sul sarcoma di Ewing, un approccio simile può essere applicato ad altri tipi di tumore.

Modello in vivo per la prova Effetto dell&#39;ipossia sul tumore metastasi

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.

Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma

Di seguito è descritto l'uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall'osteosarcoma. È inoltre dimostrata l'ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.

Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

Qui, viene descritto un impianto ortotopico singenico seguito da una procedura di amputazione dell'osteosarcoma con metastasi polmonari spontanee che può essere utilizzato per l'indagine preclinica della biologia delle metastasi e lo sviluppo di nuove terapie.

Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi

Il presente protocollo descrive l'iniezione di cellule di osteosarcoma intratibia per generare modelli murini portatori di osteosarcoma ortotopico e lesioni da metastasi polmonari.

Iniezione di cellule di osteosarcoma intratibiale per generare modelli murini di osteosarcoma ortotopico e metastasi polmonari

Il protocollo fornisce un processo di standardizzazione dettagliato della formula di decotto e della tecnica del gavage con il decotto Yiqi Jiedu nel modello murino di osteosarcoma come esempio. Descrive la protezione degli animali e migliora l'affidabilità dei dati della ricerca, fornendo strategie efficaci per studiare l'efficacia terapeutica e i meccanismi molecolari delle formule di decotto in vivo.

Strategia del sonda gastrica per la formula di decotto della medicina tradizionale cinese nei topi modello di osteosarcoma

Il presente protocollo descrive il metodo per stabilire un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente (PDX) utilizzando tessuto di osteosarcoma umano.

Istituzione di un modello murino di xenotrapianto derivato da paziente con tessuti di osteosarcoma umano

Scopri un modello murino preclinico di osteosarcoma per studiare la comunicazione mediata da vescicole extracellulari tra tumore e cellule staminali mesenchimali. Questo metodo aiuta a comprendere la progressione tumorale in vivo.

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali (Video) | JoVE Journal

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

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