Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di sviluppare un modello murino preclinico per studiare il ruolo della comunicazione extracellulare mediata dalle vescicole tra cellule staminali tumorali e mesenchimali. Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave nel campo della biologia del cancro, su come il tumore e le cellule staminali mesenchimali comunicano per mezzo di vescicole extracellulari e se questo supporta la progressione del cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di studiare il ruolo dell'adattamento delle cellule staminali mesenchimali da parte delle vescicole extracellulari tumorali, sulla progressione e la formazione di metastasi in vivo.

L'implicazione di questa procedura si estende alla nostra terapia del cancro, perché possiamo usare il GSA per interferire con la comunicazione EV e la segnalazione degli androgeni per inibire la progressione del cancro. Oltre a fornire informazioni sulla comunicazione mediata dalle EV nell'osteosarcoma, questo metodo può essere applicato anche a molti altri tipi di cancro. Infatti, il midollo osseo derivato dalle cellule staminali mesenchimali viene prontamente reclutato in più siti dove possono differenziarsi in cellule che supportano il cancro.

Inizia seminando otto fiasche da 175 centimetri quadrati con 3 milioni di cellule 143B ciascuna. Coltivare le cellule utilizzando un terreno impoverito di EV per 36-48 ore. Quando le cellule sono confluenti all'80-90%, raccogliere i surnatanti dagli otto flaconi per l'isolamento delle vescicole extracellulari.

Successivamente, utilizzare la centrifugazione differenziale per rimuovere tutte le cellule e i detriti cellulari dal surnatante. Consiste in centrifugazioni ripetute a quattro gradi Celsius, con accelerazione e decelerazione massime. Dopo ogni fase di centrifugazione, raccogliere il surnatante e lasciare un millilitro di surnatante nella provetta di centrifugazione.

Ora, caricare un surnatante pre-autorizzato nelle provette dell'ultracentrifuga a 38,5 millilitri per provetta. Quindi, isolare le vescicole extracellulari utilizzando un'ultracentrifuga a 70.000 g per un'ora, con una pausa lenta e a quattro gradi Celsius. Dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con cura il surnatante, lasciandone circa un millilitro.

Quindi, risospendere i pellet contenenti EV nel volume rimanente. Raggruppa tutte le sospensioni. E lavare le sospensioni raggruppate con PBS.

Riempire il tubo a 38,5 millilitri. Quindi, ripetere il ciclo di ultracentrifugazione, ma senza fare interruzioni. Il rotore dovrebbe smettere di girare dopo circa un'ora.

Quindi, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet e lasciare da 100 a 200 microlitri di soluzione. Infine, risospendere il pellet EV e regolare il volume finale a 200 microlitri con PBS. Le vescicole extracellulari possono quindi essere caratterizzate da TEM, marcate con coloranti per esperimenti di assorbimento o utilizzate per educare le cellule staminali mesenchimali per esperimenti in vivo.

È fondamentale che le MSC primarie abbiano la giusta densità cellulare prima dell'esposizione alle vescicole extracellulari tumorali. La cellula dovrebbe essere confluente per circa il 70% per ottenere un rapporto EV cellulare ottimale e anche per prevenire la crescita eccessiva durante i periodi di istruzione. Questo esperimento utilizza topi adulti acclimatati Athymic Nude-Foxn1nu.

Un giorno prima dell'intervento chirurgico, somministrare paracetamolo attraverso l'acqua potabile. Il giorno dell'intervento, preparare le cellule 143B a 200.000 per microlitro in PBS. 20 minuti prima dell'intervento, somministrare all'animale buprenorfinea.

Poco prima dell'anestesia, caricare una siringa da 10 microlitri con le cellule 143B concentrate. Dopo aver confermato la corretta anestesia e aver applicato l'unguento per gli occhi, posizionare l'animale sulla schiena con le zampe posteriori rivolte verso l'operatore. Quindi, fissa una maschera per anestesia all'animale.

Quindi, flettere il ginocchio sinistro e pulire la pelle con tre scrub alternati di etanolo al 70% e iodio povidone, quindi applicare il 2% di lidocaina come analgesico locale. Ora, fai una piccola incisione nella pelle appena sotto il ginocchio per esporre la tibia. Quindi, utilizzando una fresa microtwist da 0,8 millimetri, praticare un foro di spillo nella tibia, circa 2 millimetri sotto il ginocchio.

Evitare di perforare entrambe le cortecce della tibia. Procedere iniettando lentamente un microlitro di cellule nel foro nell'arco di circa cinque secondi. Quindi, chiudere il foro con una goccia di colla tissutale per evitare il riflusso della sospensione.

Completa l'intervento chiudendo la pelle con punti di sutura e una goccia di colla per tessuti. Lasciare che l'animale si riprenda con il riscaldamento e trattarlo con paracetamolo per 24 ore. Due giorni dopo, utilizzare una siringa da insulina da 0,5 millimetri per iniettare le MSC nella vena caudale.

La corretta somministrazione durante un'iniezione della vena caudale può essere confermata visivamente. Se appare un'area bianca, o se incontra resistenza, iniettare nuovamente in un'area sopra il sito di iniezione precedente. Quindi, due volte a settimana, seguire la crescita del tumore utilizzando la bioluminescenza.

Iniettare nei topi la D-luciferina tramite una siringa da insulina e, 10 minuti dopo, misurare il flusso di fotoni generato dalle cellule tumorali utilizzando un sistema di imaging. Quando il diametro del tumore di un animale supera i 15 millimetri o la sua perdita di peso supera il 15%, sopprimere l'animale e raccogliere tutti i tessuti pertinenti. 10 minuti prima dell'eutanasia, iniettare D-luciferina, come fatto prima dell'imaging.

Dopo l'eutanasia, raccogli i polmoni, il fegato, la milza e i reni, usando forbici e pinzette sterilizzate. Lavare il sangue dagli organi usando la PBS e disporli su una piastra di Petri per l'imaging. Utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza, documentare entrambi i lati degli organi.

Una volta scattate le immagini, fissare immediatamente gli organi per future analisi istologiche. Per elaborare i documenti fotografici, è sufficiente applicare la soglia manuale e contare il numero di noduli in ogni foto. Assicurati di utilizzare la stessa soglia per ogni foto e di documentare i tessuti da ogni direzione, in particolare i polmoni.

Dopo aver decalcificato la tibia del topo, procedere con la disidratazione e l'inclusione di paraffina. Quindi, utilizzare un microtomo per preparare sezioni di paraffina da sei micron e raccogliere le sezioni su vetrini. Una volta che i vetrini si sono asciugati, conservarli per una notte a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, eseguire un recupero dell'antigene mediato dal calore, utilizzando un tampone citrato. Quindi, colorare i tessuti con anticorpi anti-GFP da uno a 900 e seguire con una controcolorazione DAPI. Infine, documentare le sezioni di tessuto colorate utilizzando la microscopia a fluorescenza.

La purezza delle vescicole extracellulari isolate è stata confermata dalla microscopia elettronica. I preparati contenevano vescicole di diametro compreso tra 40 e 100 nanometri. Per valutare se le vescicole extracellulari tumorali interagiscono con le MSC, le vescicole extracellulari sono state marcate con un colorante linker lipofilo fluorescente verde e incubate durante la notte con le MSC.

L'adozione efficiente dei veicoli elettrici da parte delle MSC è stata quindi confermata. Una proprietà immunomodulatoria delle EV sulle MSC è stata confermata utilizzando un test immunologico multiplex sulle citochine basato su B. Le vescicole extracellulari tumorali hanno causato un aumento della produzione di IL-8 e IL-6 nelle MSC, rispetto alle vescicole extracellulari di controllo dei fibroblasti umane.

Successivamente, in un modello murino ortotopico di osteosarcoma con xenotrapianto, i topi trattati con MSC educate con EV hanno dimostrato di avere una crescita tumorale accelerata. Quattro giorni dopo l'iniezione sistemica di MSC che esprimono GFP, sono state rilevate cellule che esprimono GFP nel midollo osseo e nel tessuto tumorale, dimostrando l'homing delle MSC nel sito tumorale. L'imaging ex vivo di vari organi ha evidenziato la formazione di noduli polmonari.

In definitiva, i topi che ricevevano MSC educate con EV avevano più metastasi polmonari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come educare le cellule stromali con EV tumorali ex vivo e studiare gli effetti delle cellule stromali istruite in vivo utilizzando modelli murini preclinici. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita entro quattro settimane, a condizione che siano disponibili abbastanza EV tumorali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante pianificare in anticipo e ottenere una purificazione riproducibile delle vescicole extracellulari tumorali, nonché utilizzare cellule staminali mesenchimali proliferanti a basso passaggio.