Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mettere in scena i periodi pupali e misurare la pigmentazione delle ali di Drosophila guttifera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia evolutiva dello sviluppo, come ad esempio come si sviluppano i modelli di pigmentazione in Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere informazioni dettagliate sullo sviluppo morfologico e sul processo di pigmentazione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo morfologico e sul processo di pigmentazione di Drosophila guttifera, può essere applicato ad altre specie di Drosophila. Per iniziare la rimozione del pupario, attacca un pezzo di nastro biadesivo su un pezzo di carta assorbente. Posiziona una pupa sul nastro biadesivo, con il lato ventrale rivolto verso l'alto.

Individua lo spazio tra il lato anteriore del pupario e la pupa interna. Afferra e rimuovi il pupario attorno a questa fessura, usando una pinza. Ed esporre il lato anteriore della testa della pupa.

Inserire la punta di una pinza spostandola parallelamente all'asse antero-posteriore. Solleva la punta della pinza per rompere localmente il pupario. Ripetere questa azione fino a quando la rottura non raggiunge la parte posteriore del pupario.

Assicurarsi che si formi uno spazio tra il pupario e le zampe della pupa. E rompi il lato ventrale del pupario riducendo al minimo i danni alla pupa interna. Dopo aver rotto il puparium il più possibile, estrai la pupa usando un pennello fine.

Posizionare la pupa su un pezzo di carta velina che è stato inumidito con ddH2O e posto in una capsula di Petri di plastica. Scatta immediatamente fotografie, poiché la pupa esposta è vulnerabile e si asciuga facilmente. Procedere con la preparazione dell'immagine e rimuovere la porzione anteriore del pupario con una pinza.

Estrarre la pupa e metterla in soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, in una capsula di Petri di plastica. Quindi, taglia l'articolazione basale di un'ala. Quando l'ala è piegata, mettila in una capsula di Petri di plastica riempita con ddH2O per estenderla per pressione osmotica.

Raccogli gli adulti appena chiusi una volta ogni 10 minuti da un file di magazzino. Anestetizzare una mosca utilizzando un tampone anestetizzante a CO2. Confermare l'anestesia per immobilità e tagliare l'articolazione basale di un'ala.

Far cadere 10 microlitri di PBS su un vetrino. Posiziona l'ala nella goccia. E copri la goccia con un vetrino coprioggetti.

Quindi, accendi la luce dello stereomicroscopio e impostala al massimo. Impostare la lente dell'obiettivo su 11,5x e impostare il diaframma sullo stato più aperto. Quindi, accendi la fotocamera e imposta la fotocamera.

Mettere a fuoco il campione spostando la manopola di messa a fuoco del microscopio. Premere il pulsante di scatto dell'otturatore del telecomando per scattare un'immagine. Prendete un'immagine dell'ala, centrata un sensillo campaniforme, posizionando la parte distale dell'ala sul lato sinistro e la parte interna dell'ala sul lato superiore.

Apri un'immagine con la macchia del sensillum campaniforme al centro. Fare clic su Immagine, digitare 1, 8 bit, per convertire l'immagine in un'immagine a 8 bit. Fare clic sul rettangolo negli strumenti di selezione dell'area e disegnare un rettangolo.

Posizionare il lato destro del rettangolo in modo che si trovi a destra della macchia del sensillum campaniforme. Fare clic su Modifica, Selezione, Aggiungi a Manager, quindi selezionare la colonna Mostra tutto. Quindi, fai clic sullo strumento angolo negli strumenti di selezione della linea.

Disegna la prima linea sulla linea posteriore della terza vena longitudinale. Impostare i punti finali sinistri della linea sul vertice del rettangolo disegnato in precedenza. Disegna la seconda linea sul lato superiore del rettangolo.

Premere il tasto M per misurare l'angolo tra le due linee tracciate in questo passaggio. Fare clic sulla finestra dell'immagine sullo schermo del computer. Fare clic su Modifica, Selezione, Aggiungi a Manager.

Fare clic sul rettangolo negli strumenti di selezione dell'area e disegnare un rettangolo di circa 1/9 delle dimensioni della finestra dell'immagine. Fare clic su Modifica, Selezione, Ruota. Scrivere i gradi negativi dell'angolo misurato in precedenza nella colonna Angolo e fare clic su OK per ruotare il rettangolo disegnato in questo passaggio.

Sposta il rettangolo disegnato utilizzando i tasti freccia e imposta il punto finale della linea posteriore della seconda vena longitudinale sul lato sinistro del rettangolo. E il lato inferiore del rettangolo, si attacca alla linea posteriore della terza vena longitudinale. Verificare che sia stata tracciata una linea perpendicolare dall'estremità della seconda vena longitudinale alla linea posteriore della terza vena longitudinale.

Definire il piede della linea perpendicolare come punto A.Registrare la coordinata X e la coordinata Y del punto A, indicate sotto gli strumenti di selezione dell'area quando si posiziona il cursore sul punto A.Aprire l'immagine con il punto A al centro. Fare clic su Immagine, Digita, 8 bit, per convertire l'immagine in un'immagine a 8 bit. Fare clic sul rettangolo negli strumenti di selezione dell'area e disegnare un rettangolo di circa 1/9 delle dimensioni della finestra dell'immagine.

Fare clic su Modifica, Selezione, Specifica. Controllare Colonna ovale e centrata. Scrivi 100 pixel nelle colonne della larghezza e dell'altezza.

Scrivere le coordinate X del punto A nella colonna delle coordinate X e le coordinate Y del punto A nella colonna delle coordinate Y, quindi fare clic su OK. Quindi, fai clic su Analizza e misura. Se la calibrazione è già stata completata, gli OD sono indicati nella colonna Media. Il confronto dei dati di più stadi ha rivelato che lo stadio P12 è il momento di inizio della pigmentazione e che la pigmentazione è completata entro 12 ore dopo l'eclosione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia evolutiva dello sviluppo per esplorare le differenze nello sviluppo delle pupe e nel processo di pigmentazione tra le specie di Drosophila.