Name: Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Impara a gestire i periodi pupali e misurare la pigmentazione alare in Drosophila guttifera. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dello sviluppo dei tratti adulti e le adattamenti evolutivi.

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Ringraziamo Sean B. Carroll e Thomas Werner per fornire scorte volare, Naoyuki fusibile per attrezzature, Byung Seok Jin per la sua assistenza nella contaminazione, Kiyokazu Agata per tutoraggio ed Elizabeth Nakajima per l'editing di inglese. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI 17K 19427 e Takeda Science Foundation.

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Descriviamo qui i protocolli per la definizione delle fasi pupal, rimuovendo il pupario per osservazione dettagliata, misurano la durate delle fasi pupal e misurazione dell'intensità delle macchie nere su un'ala a d. guttifera. Questi protocolli possono essere applicati per molti Drosophila e relative specie volare, soprattutto con la pigmentazione di ala.
Descrizione degli eventi inerenti allo sviluppo più dettagliati e approfondita osservazione consentirebbe ulteriore suddi...

Alcune delle caratteristiche morfologiche di Drosophila sono diversificate tra specie1,2,3,4,5. Noi possiamo affrontare la questione della diversità come morfologica si pone confrontando i meccanismi di generazione di queste morfologie. Esempi di tali morfologie sono larvale Tricomi, sesso adulto pettini, apparato genitale esterno, pigmentazione addominale e ala pigmentazione6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. per studiare le differenze morfologiche tra gli adulti, osservazione e analisi delle fasi pupale sono importanti, perché il destino dell'adulti tratti è determinato nelle ultime fasi larvali e successiva morfogenesi procede durante il periodo pupa.
Negli studi di biologia dello sviluppo di Drosophila melanogaster, "ore APF" (ore dopo formazione pupal) è il metodo comune per indicare una fase pupal16. Questo sistema impiega tempo assoluto dopo formazione pupal e molto comodo per gli esperimenti di routine. Tuttavia, velocità inerente allo sviluppo possono differire tra pupe e può essere influenzata da lievi differenze genetiche, epigenetiche o microambientali, e quindi avere lo stesso tempo assoluto dopo formazione pupal non garantisce che le pupe sono allo stesso Stadio di sviluppo. In molti casi, fasi definite da caratteristiche morfologiche sono preferibili per il confronto di più individui. Soprattutto, un confronto tra specie richiede stadiazione precisa e confronto tra le fasi (omologhi) corrispondente.
Bainbridge e Bownes17 riconosciuto 20 fasi pupal (P1 a P15(ii)) basata su caratteristiche morfologiche di Drosophila melanogaster pupe. Questa messa in scena è il sistema più diffuso di gestione temporanea dello sviluppo morfologico18. In uno studio precedente, abbiamo effettuato pupal messa in scena di Drosophila guttifera per stabilire una base per ala pigmentazione studi19. D. guttifera ha un modello di pois neri sulle ali ed è una delle specie modello per ala pigmentazione formazione20. Anche se abbiamo fatto riferimento ai criteri morfologici descritti nella Bainbridge e 'Bownes ricerca17, abbiamo misurato direttamente le durate fase di osservazioni di serie19, invece di utilizzare Bainbridge e 'Bownes stima delle durate di fase da frequenza osservata. Qui descriviamo il metodo di stadiazione pupal e misurazione delle durate delle fasi pupal di Drosophila utilizzato Fukutomi et al.19.
Per studiare il meccanismo inerente allo sviluppo della pigmentazione di ala, abbiamo bisogno di sapere quando nelle fasi di pupal o adulti la pigmentazione si verifica. Fukutomi et al. 19 quantificato densità ottica (ODs) di pigmentazione, pupa e adulto nella fase di analisi dell'immagine di immagini di ala. La pigmentazione delle ali di Drosophila è pensata per essere causato da accumulo di melanina nera21. Per la quantificazione dell'ODs, immagini in scala di grigio e ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 sono stati usati. Per riconoscere e quantificare la pigmentazione posto specifico (ΔOD), sottraiamo il OD di fuori di un posto dal OD all'interno di un punto. Per rendere questo metodo riproducibile ed obiettivo, dovrebbero essere determinati i posti di misura OD utilizzando le vene ala come punti di riferimento. In questo articolo, descriviamo in dettaglio questo metodo di quantificazione della pigmentazione di ala in Drosophila guttifera.

<table><tbody><tr><td>Drosophila guttifera</td><td>The Drosophila Species Stock Center presso l'U.C. San Diego</td><td>15130-1971.10</td><td>Drosophila guttifera, una specie di moscerino della frutta utilizzata in questo articolo</td></tr><tr><td>Fiala di plastica</td><td>Hightech</td><td>MKC-30</td><td>Fiala di plastica, per il mantenimento delle mosche</td></tr><tr><td>Buzz plugs, fiale e chiusure per flaconi per fiale di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-271</td><td>Tappo di cellulosa, per la manutenzione del bestiame volante</td></tr><tr><td>Zucchero morbido bianco</td><td>Mitsui Sugar</td><td>J-500g</td><td>Zucchero morbido bianco, per alimenti standard di farina di mais/zucchero/lievito/agar Farina di</td></tr><tr><td>mais</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>F</td><td>Farina di mais, per alimenti standard di farina di mais/zucchero/lievito/agar</td></tr><tr><td>Semola di mais - C</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>GC</td><td>Semola di mais - C, per farina di mais/zucchero/lievito/agar standard Polvere</td></tr> <tr><td></td><td>di agarMatsuki Kanten Sangyo</td><td>No.602</td><td>Agar in polvere, per farina di mais/zucchero/lievito/agar standard</td></tr><tr><td>Lievito di birra secco</td><td>Asahi Food & Healthcare</td><td>Y2A</td><td>Lievito di birra secco, per alimenti standard a base di farina di mais/zucchero/lievito/agar</td></tr><tr><td>Butile p-idrossibenzoato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06327-02</td><td>Butile p-idrossibenzoato, per alimenti standard a base di farina di mais/zucchero/lievito/agar</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>Etanolo, per alimenti standard a base di farina di mais/zucchero/lievito/agar</td></tr><tr><td>Microprovetta a fondo piatto</td><td>Microprovetta Ina Optica</td><td>CF-0150</td><td>da 1,5 mL, per raccolta di pupe</td></tr><tr><td>CAPSULEFUGE</td><td>Tomy</td><td>PMC-060</td><td>Mini microcentrifuga, per la raccolta di pupe</td></tr><tr><td>Sterilizzato Schale NB</td><td>Sansei Medical</td><td>01-013</td><td>Piastra di Petri in plastica (diametro 90 mm x altezza 15 mm)</td></tr><tr><td>Rack per provette di siero</td><td>Iwaki</td><td>9796-050</td><td>Utilizzato come camera umida, per l'osservazione di pupe</td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip piatto per coltura tissutale</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Piastra di Petri in plastica (diametro 35 mm x altezza 10 mm)</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale standard Falcon</td><td>Corning</td><td>353002</td><td>Piastra di Petri in plastica (diametro 60 mm x altezza 15 mm)</td></tr><tr><td>Puntina</td><td>Kokuyo</td><td>51233709</td><td>Push-pin, per la realizzazione di fori di spillo sul coperchio del microtubo</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Stereomicroscopio, per l'osservazione</td></tr><tr><td>morfologica Fotocamera digitale</td><td>Olympus</td><td>DSE-330-A</td><td>Fotocamera digitale, per l'imaging</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo NICETACK</td><td>Nichiban</td><td>NW-15SF</td><td>Nastro biadesivo, per la rimozione del pupario</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Pinze, per la rimozione del pupario</td></tr><tr><td>Van Gogh VISUAL Pennello</td><td>Talens Japan</td><td>GWVR-#5/0</td><td>Pennello, per la rimozione del pupario</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Piastra per colture cellulari a 12 pozzetti</td><td>Merck</td><td>665-180</td><td>Piastra per colture cellulari a 12 pozzetti, per la misurazione della durata dei periodi pupali</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>NaCl, per PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>285-14</td><td>KCl, per PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td>Na2HPO4&middot; 12H2O, per PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td>KH2PO4, per filtro a</td></tr><tr><td>densità neutra (ND) a gradini PBS 0,04 - 3,0</td><td>Edmund Optics</td><td>64-384</td><td>Filtro a densità graduale, per la calibrazione della misurazione della pigmentazione</td></tr><tr><td>Software</td><td>ImageJ NIH</td><td>1.8.0-101</td><td>Software ImageJ, per la misurazione dell'intensità delle macchie nere su un'ala (https://imagej.nih.gov)</td></tr><tr><td>Vetrino FINE FROST</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>FF-001</td><td>Vetrino in vetro, per la misurazione dell'intensità delle macchie nere su un'ala</td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio quadrato 18 x 18</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>C018181</td><td>Vetrino coprioggetti, per la misurazione dell'intensità delle macchie nere su un'ala</td></tr></tbody></table>

metodi per la gestione temporanea pupal periodi e misura di ala pigmentazione della drosophila guttifera

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversificato specie di Drosophila (moscerino della frutta) offrono l'opportunità di studiare i meccanismi di sviluppo e cambiamenti genetici responsabili di cambiamenti evolutivi. In particolare, la fase adulta è una fonte ricca di tratti morfologici per confronto interspecifico, compreso il raffronto di pigmentazione di ala. Per studiare le differenze di sviluppo tra specie, osservazione dettagliata e gestione temporanea appropriata sono necessari per confronto preciso. Qui descriviamo i protocolli per la stadiazione dei periodi pupal e quantificazione della pigmentazione di ala a pois moscerino della frutta, Drosophila guttifera. In primo luogo, descriviamo il metodo di osservazione morfologica dettagliata e definizione di fasi pupal basato sulle morfologie. Questo metodo include una tecnica per la rimozione del pupario, che è il caso di chitinoso esterno della pupa, per consentire l'osservazione dettagliata delle morfologie pupale. In secondo luogo, descriviamo il metodo per misurare la durata delle fasi di pupal definite. Infine, descriviamo il metodo per la quantificazione della pigmentazione di ala sulla base di analisi di immagine utilizzando immagini digitali e software ImageJ. Con questi metodi, possiamo stabilire una solida base per il confronto di processi di sviluppo dei tratti adulti durante fasi pupal.

Il periodo pupa di d. guttifera è diviso in 17 tappe (P1 - P15(ii); immagini del rappresentante tre fasi (P1, P5 - 6, P10) sono mostrati nella figura 3e 17 tutte le fasi sono illustrate nella Figura 4). Anche Bainbridge e Bownes17 riconosciuto 20 tappe in d. melanogaster, alcune di queste fasi non poteva essere applicata a d. guttifera. L'ordine di due eventi inerenti allo svilup...

Protocolli per la gestione temporanea di pupal periodi e misurazione della pigmentazione ala della Drosophila guttifera sono descritti. Staging e quantificazione della pigmentazione forniscono una solida base per lo studio di meccanismi di tratti di adulti e consentire interspecifico confronto tra lo sviluppo del tratto.

Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mettere in scena i periodi pupali e misurare la pigmentazione delle ali di Drosophila guttifera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia evolutiva dello sviluppo, come ad esempio come si sviluppano i modelli di pigmentazione in Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere informazioni dettagliate sullo sviluppo morfologico e sul processo di pigmentazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo morfologico e sul processo di pigmentazione di Drosophila guttifera, può essere applicato ad altre specie di Drosophila. Per iniziare la rimozione del pupario, attacca un pezzo di nastro biadesivo su un pezzo di carta assorbente. Posiziona una pupa sul nastro biadesivo, con il lato ventrale rivolto verso l'alto.Individua lo spazio tra il lato anteriore del pupario e la pupa interna. Afferra e rimuovi il pupario attorno a questa fessura, usando una pinza. Ed esporre il lato anteriore della testa della pupa.Inserire la punta di una pinza spostandola parallelamente all'asse antero-posteriore. Solleva la punta della pinza per rompere localmente i

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Variazione fenotipica per i tratti può derivare da mutazioni in cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze che i modelli di espressione genica di controllo. Metodi derivati ​​per l'utilizzo in Drosophila melanogaster possono confrontare quantitativamente i livelli di modelli spaziali e temporali di espressione genica mediata da modificato o naturale varianti CRE.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

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Questo articolo descrive una tecnica per rimuovere il pupario di un insetto mantenendo intatta la pupa interna e quindi adatta per ulteriori indagini. Il protocollo di esempio mostra la procedura con Drosophila guttifera; tuttavia, questa tecnica è applicabile ad altre specie di Drosophila.

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Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.

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Questo protocollo presenta un metodo efficiente per l'imaging del neuroepitelio dell'occhio pupale di Drosophila. Questo metodo compensa il movimento dei tessuti e la topologia irregolare, migliora la visualizzazione dei confini cellulari attraverso l'uso di più proteine di giunzione marcate con GFP e utilizza un impianto di imaging facilmente assemblabile.

Live-imaging del Drosophila Pupa Eye

La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).

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L'ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Qui, presentiamo un metodo facile da usare e versatile per eseguire dal vivo imaging dei processi di sviluppo nella morfogenesi generale e muscolo-tendinee in particolare nella vita della drosofila pupe.

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Questo protocollo è progettato per l'imaging e l'analisi delle dinamiche dell'orientamento cellulare e della crescita dei tessuti nell'epitelio addominale della Drosophila mentre la mosca della frutta subisce la metamorfosi. La metodologia qui descritta può essere applicata allo studio di diverse fasi di sviluppo, tessuti e strutture subcellulari nella Drosophila o in altri organismi modello.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Qui, viene presentato un protocollo per l'imaging dal vivo a lungo termine della zampa di Drosophila durante lo stadio pupale, che prevede la rimozione completa del pupario. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tessuti.

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

La Drosophila è un potente modello per comprendere i meccanismi fondamentali della miogenesi. Questo protocollo per la dissezione e la preparazione di emisezioni toraciche, consente l'analisi al microscopio del muscolo del volo indiretto sia dallo stadio pupale che da quello adulto. Questo protocollo consente l'imaging confocale della morfologia cellulare, della localizzazione delle proteine, della struttura muscolare e di molti altri aspetti della miogenesi.

Dissezione dei muscoli di volo indiretti di Drosophila melanogaster per approcci di microscopia

Impara a gestire i periodi pupali e misurare la pigmentazione alare in Drosophila guttifera. Questo metodo consente di studiare i meccanismi dello sviluppo dei tratti adulti e le adattamenti evolutivi.

Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera

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