Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

L'obiettivo generale di questo protocollo è ottenere DNA tumorale di alta qualità da campioni clinici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella scienza di base e clinica come la ricerca sul cancro, la diagnosi e le decisioni terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo ottenere il DNA tumorale in modo più semplice e rapido rispetto ai metodi precedenti.

Per iniziare il protocollo, toccare più volte la superficie tumorale di un tessuto precedentemente preparato e resecato su un normale vetrino con le mani guantate. Confermare visivamente che l'area toccata copra più dell'80% del vetrino. Premere leggermente il vetrino normale contro un vetrino in polietilene naftalato o un vetrino a membrana PEN e strofinarlo delicatamente due o tre volte con le mani guantate.

Confermare visivamente che le cellule siano trasferite dal normale vetrino al vetrino a membrana PEN. Asciugare all'aria sia il vetrino in vetro che la membrana PEN per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, colorare il normale vetrino per l'esame citologico diretto.

Immergere i vetrini in una soluzione fissativa per cinque secondi e poi colorare con la soluzione colorante Giemsa per 15 secondi. Valutare e vagliare il contenuto e la cellularità del tumore sul normale vetrino interamente con un microscopio per una rapida valutazione. Valutare le cellule tumorali in base a diversi criteri.

Se il campione mostra una cellularità tumorale superiore al 60% mediante una rapida valutazione microscopica della sezione precedente, tagliare la pellicola toccata dal tumore dei vetrini della membrana PEN per l'estrazione del DNA con un coltello e le mani guantate. Trasferire la pellicola tagliata in una provetta da microcentrifuga sterile con un set di spilli e le mani guantate. Conservare la provetta per microcentrifuga contenente film a quattro gradi Celsius fino all'estrazione del DNA.

Aprire il software e pianificare la condizione di esecuzione e impostare il parametro di esecuzione all'interno del software. Fare clic sulla scheda del piano e selezionare il modello, quindi selezionare il metodo di esecuzione appropriato. Selezionare l'applicazione e il tipo di tecnica e fare clic su Avanti.

Selezionare lo strumento, il kit di preparazione del campione, il tipo di kit di libreria, il kit di modelli, il kit di sequenziamento, la modalità di calibrazione della base, il tipo di chip, la sequenza di controllo e il set di codici a barre e fare clic su Avanti. Seleziona i plug-in e fai clic su Avanti. Seleziona il progetto e fai clic su Avanti.

Quindi selezionare i file di riferimento e BED predefiniti della regione di destinazione. Digitare il nome dell'esempio, selezionare il codice a barre e fare clic su Pianifica esecuzione. Successivamente, eseguire la preparazione del modello e il caricamento del truciolo in uno strumento automatizzato secondo le istruzioni del produttore.

Scongelare la cartuccia di reagenti a temperatura ambiente per 45 minuti prima dell'uso. Diluire la libreria non diluita con acqua priva di nucleasi secondo la concentrazione della libreria calcolata al punto 6.8 e creare 20 librerie picomolari. Preparare una libreria in pool per il sequenziamento e conservarla in ghiaccio.

Aggiungere 25 microlitri della libreria in pool con una pipetta da 100 microlitri sul fondo della provetta del campione. Accendere l'alimentazione e aprire il coperchio dello strumento automatizzato. Posizionare il chip di sequenziamento, l'adattatore per chip, la cartuccia di arricchimento, la cartuccia del puntale, la piastra PCR, la guarnizione del telaio PCR, la provetta di recupero, la cartuccia della soluzione e la cartuccia del reagente nella posizione appropriata dello strumento automatizzato.

Tocca Configura, Esegui e passo dopo passo sullo schermo. Chiudere il coperchio e toccare avvia controllo sullo schermo. Dopo il processo di scansione del mazzo, toccare Avanti.

Controllare il contenuto del display, il tipo di kit, l'ID del chip, l'ID del campione, il tipo di chip, i piani. Impostare l'ora e toccare OK. Dopo aver terminato il caricamento dei trucioli, toccare Avanti e aprire il coperchio. Scaricare il chip di sequenziamento dall'adattatore del chip con le mani guantate.

Posiziona il chip nel contenitore del chip, avvolgilo con il parafilm e conservalo a quattro gradi Celsius fino alla reazione di sequenziamento. Quindi rimuovere la cartuccia di arricchimento, la piastra PCR, il sigillo del telaio PCR, la provetta di recupero, la cartuccia della soluzione e la cartuccia del reagente dalla posizione appropriata dello strumento automatizzato con le mani guantate. Trasferire una cartuccia di puntale vuota nella posizione di scarico dello strumento automatizzato con le mani guantate.

Toccare Avanti e chiudere il coperchio. Quindi toccare start e pulire lo strumento automatizzato con raggi ultravioletti per quattro minuti. Sciogliere una compressa di clorito di sodio in 1.000 millilitri di acqua ultrapura e filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron.

Una volta che lo strumento di sequenziamento si è riscaldato, toccare clean e next sullo schermo dello strumento di sequenziamento. Pulire lo strumento di sequenziamento con 250 millilitri di soluzione di clorito di sodio sterilizzata con filtro, quindi 250 millilitri di acqua ultrapura. Quindi toccare inizializza e selezionare il kit di sequenziamento appropriato sullo schermo.

Installa un mittente grigio con le mani guantate. Inizializzare lo strumento di sequenziamento con la soluzione di lavaggio, la soluzione di regolazione del pH e la soluzione standard del pH. Quindi, aggiungere 20 microlitri di nucleotidi DATP, DGTP, DCTP e DTTP in provette da 50 millilitri con una pipetta da 100 microlitri.

Installare un dispositivo di spedizione grigio nella posizione appropriata con le mani guantate. Caricare la provetta da 50 millilitri e avvitarla sullo strumento di sequenziamento. Selezionare Avanti sullo schermo per avviare la fase di inizializzazione.

Dopo aver completato la fase di inizializzazione, toccare Esegui sullo schermo e selezionare lo strumento di preparazione della libreria appropriato. Scansiona il codice a barre bidimensionale del chip. Inserire il chip di sequenziamento nella posizione appropriata.

Chiudere il chip clamp e lo sportello dello strumento e toccare chip check, quindi e OK sullo schermo per avviare la sequenza di sequenziamento. Dopo la reazione di sequenziamento, trasferire i dati ed eseguire l'analisi dei dati sulla pipeline sul server di sequenziamento. Le quantità assolute di DNA e il valore RQ, un indicatore del livello di degradazione del DNA genomico, mostrano che si ottiene una resa di DNA più elevata utilizzando i campioni TIC rispetto ai campioni FFPE.

Inoltre, i valori RQ del DNA TIC erano significativamente più alti rispetto a quelli del DNA FFPE in diversi tipi di tumore. APC Q1367* è stato identificato sia nel DNA FFPE che in quello TIC estratti dal sito uno e APC S1356*KRAS G12D e TP53 M237i sono stati rilevati sia nel DNA FFPE che in quello TIC estratti dal sito due, tre e quattro, suggerendo che le mutazioni somatiche identiche sono state identificate in campioni di DNA accoppiati FFPE e TIC preparati dallo stesso sito tumorale. In particolare, le stesse mutazioni somatiche sono state rilevate tra il cancro del colon-retto primario e due campioni di cancro al fegato metastatico, suggerendo che i cloni tumorali dal sito due metastatizzavano al fegato.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca molecolare e medica per identificare i tumori genetici.