Visualizzazione di lignificazione Dynamics in piante con chimica clicca: doppia etichettatura è beatitudine!

L'obiettivo generale di questa doppia metodologia di etichettatura è quello di osservare attivamente le zone lignificanti dei tessuti vegetali. In questo flusso di lavoro, la strategia del reporter chimico viene applicata utilizzando due reporter chimici distinti in una combinazione sequenziale di reazioni chimiche a clic bio-ortogonali. Questo metodo può aiutare a decifrare questioni chiave nel campo della biologia vegetale, come determinare quali fattori regolano la formazione spaziale o temporale della lignina all'interno delle piante e delle pareti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si rivolge esclusivamente alla lignina prodotta durante l'incorporazione metabolica. Lo differenzia da qualsiasi lignina preesistente nel campione. Sebbene originariamente avessimo sviluppato questo metodo per studiare le bandiere di lignificazione, potrebbe essere utilizzato con altre specie come l'arabidopsis, il pioppo o qualsiasi altra pianta che produce lignina.

Per presentare questa tecnica abbiamo Clemence Simon, una dottoranda che lavora all'interfaccia tra chimica e biologia e che sta usando questa tecnica per studiare la dinamica della lignificazione. Innanzitutto, preparare una soluzione di reporter chimico da 300 microlitri contenente dieci micromuller di reporter G marcato con alchini. E dieci micromuller di reporter H marcato con azide e terreno liquido sterile da 1/2 MS.

Agitare la soluzione e trasferirla in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con una pipetta di trasferimento. Preparare una soluzione di controllo negativo da 300 microlitri contenente dieci micromuller di G e dieci micromuller di H e un terreno liquido sterile 1/2 MS. Agitare la soluzione e trasferirla in un secondo pozzetto della stessa piastra a 48 pozzetti.

Usando una lama di rasoio pulita, taglia il gambo di una pianta di lino di due mesi a dieci centimetri sopra il livello del suolo. Preparare diligentemente 50 sezioni trasversali a mano libera dello stelo utilizzando la lama del rasoio e posizionarle immediatamente in un mezzo 1/2 MS. Quindi, selezionare intere sezioni trasversali intatte e distribuirne in modo casuale dieci nel pozzetto riempito con la soluzione di reporter chimico, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto.

Le sezioni trasversali devono essere tagliate in modo fermo e pulito e la sezione trasversale deve essere diritta. Hai bisogno di una mano ferma e di una lama di rasoio affilata per mantenere intatti i tessuti. Si consiglia di esercitarsi in anticipo.

Dopo aver distribuito dieci sezioni trasversali intatte nella soluzione di controllo negativo, incubare la piastra in luce continua in una camera di crescita a 20 gradi Celsius per 20 ore. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione monolignal in ogni pozzetto con una micropipetta. Aggiungere 500 microlitri di 1/2 MS di terreno in ogni pozzetto e mescolare delicatamente per dieci minuti.

Quindi, rimuovere la soluzione di risciacquo con una micropipetta. Preparare un millilitro di una soluzione di cicloaddizione azide-alchina promossa dal ceppo. Contiene cinque micromuller di colorante fluorescente marcato con ciclooctene e terreno liquido sterile 1/2 MS.

Quindi, fai vorticare la soluzione. Dopo le fasi finali di lavaggio del protocollo di incorporazione metabolica, rimuovere il terreno da 1/2 MS e aggiungere 300 microlitri della soluzione SPAAC a ciascun pozzetto con una micropipetta. Proteggere la piastra da 48 pozzetti dalla luce mettendola in una scatola.

Quindi, mescolare delicatamente la piastra su uno shaker meccanico per un'ora al buio a temperatura ambiente. Successivamente, lavare ogni pozzetto quattro volte con 1/2 MS di terreno come descritto in precedenza, mantenendo la piastra al buio. Preparare un millilitro di soluzione di cicloaddizione di alkine azide catalizzata da rame contenente ascorbato di sodio, solfato di rame e colorante fluorescente marcato con azide e terreno sterile liquido da 1/2 MS.

Quindi agitare la soluzione. Dopo aver rimosso il terreno da 1/2 MS, posizionare la piastra in una scatola e aggiungere 300 microlitri della soluzione di CuAAC a ciascun pozzetto con una micropipetta. Mescolare delicatamente la piastra su uno shaker meccanico per un'ora al buio a temperatura ambiente.

Rimuovere la piastra dall'agitatore meccanico e rimuovere la soluzione di CuAAC da ciascun pozzetto con una micropipetta. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno 1/2 MS e mescolare la piastra sullo shaker meccanico per dieci minuti al buio. Dopo aver lavato altre due volte con 1/2 MS di terreno, aggiungere 500 microlitri di una soluzione di metanolo 7:3 e acqua in ogni pozzetto.

Mescolare la piastra sullo shaker meccanico per un'ora al buio. Quindi, rimuovere la soluzione dai pozzetti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di 1/2 MS di terreno in ogni pozzetto e mescolare al buio per dieci minuti.

Dopo aver ripetuto questo lavaggio quattro volte, conservare le sezioni trasversali conservate in mezzo 1/2 MS, al riparo dalla luce. Posizionare cinque gocce di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopio. Quindi, depositare con cura ogni sezione trasversale etichettata dal reporter chimico sul vetrino.

Applicare lo smalto su due lati opposti del vetrino. Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti, facendo attenzione a evitare bolle d'aria. Quindi, rimuovere il supporto di montaggio in eccesso utilizzando un tovagliolo di carta.

Successivamente, sigillare il campione con smalto per unghie su tutti e quattro i lati. Dopo che lo smalto si è asciugato, conservare i vetrini a quattro gradi Celsius al buio fino all'osservazione al microscopio confocale. Le sezioni delle piante hanno la tendenza a diventare croccanti quando si asciugano.

Assicurati di tenerli sempre in soluzione e di sigillare i vetrini coprioggetto con smalto su tutti i lati. Aumenta la durata di conservazione delle guide montate. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio sotto la lente dell'obiettivo.

Osservare e centrifugare il campione per identificare la regione desiderata del tessuto vegetale. Quindi, selezionare il piano più fluorescente sull'asse Z. Regola il guadagno, l'offset e la potenza del laser per ottenere la distribuzione ottimale del segnale lungo l'intera gamma di livelli di grigio per ciascun canale.

Infine, acquisisci immagini confocali di alta qualità. BLISS fornisce tre mappe di localizzazione a colori della lignina all'interno delle pareti cellulari delle piante, si rivolge esclusivamente alla lignina prodotta in novo durante l'incorporazione metabolica e la differenzia dalla lignina preesistente nel campione. Evidenzia i siti di lignificazione attivi all'interno di diversi tessuti di un organo all'interno di diversi tipi di cellule di un tessuto, o all'interno di diversi strati di parete o sottostrutture di una cellula.

I profili di incorporazione del reporter G marcato con alchine e H marcati con azide dal cambio al midollo all'interno dello xilema secondario del lino indicano che la massima lignificazione viene rapidamente raggiunta nelle tracheidi in fibra durante lo sviluppo, mentre le cellule di razza continuano a incorporare lignina in fasi molto più avanzate della loro vita. La variazione del rapporto del reporter chimico dimostra che la composizione della lignina nei tessuti xilematici secondari dipende direttamente dalla disponibilità di monolignale all'interno delle pareti cellulari. Piuttosto che sulla specificità della perossidasi o della laccasi durante la polimerizzazione della lignina.

L'incorporazione del reporter chimico è limitata agli angoli delle cellule e alla parete cellulare primaria della lamella media di alcune, ma non di tutte le fibre liberiane. Nelle radici di lino, i reporter chimici sono incorporati nelle pareti delle cellule endodermiche dove la banda caspariana è assente. Per una migliore visualizzazione dell'architettura dei tessuti, è possibile generare anche ricostruzioni 3D Z stack.

A seguito di questa visualizzazione, è possibile eseguire anche un'elaborazione completa dei dati. Prese tutte le precauzioni, è possibile ottenere risultati costanti per confronto relativo, leggendo un campione tra diversi campioni. Può essere fatto in aggiunta alla localizzazione di leader attivi di varie aree.

Questo metodo è uno strumento meraviglioso per i biologi vegetali come me che studiano la parete cellulare. Una volta padroneggiato, può essere fatto in poche ore. È molto sensibile e può essere applicato a un'intera gamma di diversi sistemi di modelli sperimentali in vitro in vivo.

L'applicazione della strategia del reporter chimico alla lignina apre la strada ai biologi chimici per esplorare le dinamiche di lignificazione e scoprire cosa controlla questo processo di polimerizzazione, che per molti aspetti costituisce ancora un territorio inesplorato.