Name: Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri la microscopia intravitalia per visualizzare il rotolamento e l'adesione dei leucociti nelle arterie carotidee di topi con ipertensione da angiotensina II. Questo metodo permette di studiare le interazioni cellulari in vivo.

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Quest'opera è stata sostenuta dal Ministero tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF 01EO1003 e 01EO1503 BMBF).

Gli esperimenti sono stati condotti sull'età di topo maschio 8-12 settimane vecchie sotto l'approvazione del comitato etico sulla sperimentazione animale da Renania-Palatinato (numero di autorizzazione 23 177-07/G12-1-002 e 23 177-07/G15-1-051).
1. mouse l'anestesia e la preparazione all'intervento
<ol>
	<li>Prima dell'intervento, verificare la buona salute e la condizione degli animali. Prima dell'intervento chirurgico, è necessario monitorare gli animali una volta al giorno per 2-3 giorni per la loro condizione generale (aspetto, postura, comportamento spontaneo), peso corporeo, cibo e consumo di acqua.</li>
	<li>Preparare il mix master per anestesia con midazolam (5 mg/kg di peso corporeo), medetomidina (0,5 mg/kg di peso corporeo) e fentanil (0,05 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale (i.p.) iniettare 200 µ l/30 g topo in siringa da 1 mL con ago 26 G.</li>
	<li>L'impianto pompa osmotica e preparazione degli animali per esperimenti di IVM vengono eseguite su un campo di funzionamento con un 39 ° C riscaldamento piattaforma. Tutti gli strumenti in un bagno di disinfezione di sterilizzare e disinfettare la piattaforma.</li>
	<li>Durante le procedure, proteggere gli occhi degli animali con unguento oculare. Rimuovere la pelliccia con rasoi prima dell'impianto pompa osmotica. Utilizzare una crema depilatoria e tamponi di cotone per l'isolamento delle carotidi e l'impianto di catetere giugulare in esperimenti di IVM. Disinfettare la pelle dell'animale utilizzando due disinfettanti della pelle: un antisettico e disinfettante contenente iodio povidone e una pelle antisettico octenidine contenenti in soluzione a base di alcool.</li>
	<li>Preparare il mix master per antagonizzare l'anestesia ("mix antisedan") con atipamezol (0,05 mg/kg di peso corporeo) e di flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) e 200 µ l/mouse nella siringa da 1 mL con un ago da 26 G sia per via sottocutanea (s.c.) iniettato.</li>
</ol>
2. l'impianto e la pompa osmotica preparazione
Nota: L'infusione sottocutanea di AngII mediante pompe osmotiche è stata descritta in dettaglio da Lu et al. 17
<ol>
	<li>Preparare il AngII mediante ricostituzione della polvere liofilizzata con soluzione salina sterile e regolare la concentrazione con il peso dell'animale e della portata della pompa. Mantenere l'AngII ricostituito in tubi di plastica (non utilizzare tubi di vetro).</li>
	<li>Riempire la pompa con la soluzione di AngII a consegnare 1 mg/(kg·d) per 7 giorni. Dopo la preparazione, mantenere le pompe in soluzione salina sterile per 4-6 h minimo a 37 ° C.</li>
	<li>Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione di anestesia mix con posteriore riflessi del piede e posizionarlo sul campo di operazione a caldo. Induzione di anestesia dura 10-15 min e funziona meglio se gli animali sono collocati in un ambiente buio.</li>
	<li>Radere la parte bassa della schiena il mouse e disinfettarlo con una pelle alcolica antisettica.</li>
	<li>Praticare un'incisione di 1 cm perpendicolarmente alla colonna vertebrale con le forbici. Creare una tasca per la pompa usando un laccio emostatico stretto e inserire la pompa (portata moderatore prima). La tasca deve consentire la libera circolazione della pompa con nessuna pressione sulla ferita.</li>
	<li>Chiudere la ferita con punti di sutura e non clip, al fine di limitare l'infiammazione; quindi disinfettare con antisettico della pelle.</li>
	<li>Antagonizzare l'anestesia tramite iniezione s.c. di 200 µ l della miscela antisedan e tornare il mouse alla sua gabbia.</li>
	<li>Svolgere l'analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) una volta dopo l'intervento chirurgico e su richiesta in base al comportamento animale.</li>
</ol>
3. l'impianto di catetere giugulare e carotidi preparazione
<ol>
	<li>Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione dell'anestesia mescolare con riflessi posteriore cibo e metti l'animale anestetizzato in dorsale recumbence sulla piastra chirurgica di 39 ° C con una sonda rettale al fine di mantenere la temperatura e mettere l'unguento sopra gli occhi per proteggerli durante la procedura.</li>
	<li>Eliminare i peli del collo usando la crema depilatoria. Utilizzare un cotton fioc per diffondere e strofinare la crema per 2 min, fino a quando i capelli iniziano a cadere. Dopo altri 2 minuti, togliere la panna e i capelli con una spatola e disinfettare la cute con un antisettico di pelle alcoliche.</li>
	<li>Effettuare l'intervento in un microscopio stereoscopico. Fare un'incisione lungo 1-1,5 cm nella pelle longitudinalmente nel collo, 1 cm accanto alla trachea. Poi fare due altre incisioni perpendicolarmente alla due estremità delle incisioni prime.</li>
	<li>Rimuovere tessuti vicino la pelle delicatamente e rimuovere il pezzo di pelle che copre la vena giugulare di sinistra e la trachea.</li>
	<li>Isolare accuratamente la ghiandola parotidea; ghiandole sublinguali e sottomascellari dalla zona di interesse con il forcipe curvo 2. Non tagliare o danneggiare le ghiandole, metterli per consentire il migliore accesso alla vena giugulare e per le carotidi.</li>
	<li>Per isolare la vena giugulare, utilizzare pinze sottili e lentamente aprire e chiudere per liberare delicatamente il vaso dal tessuto circostante. Una volta che la vena è completamente pulita, posizionare la pinza sotto la nave e posizionare due suture 7-0 di 10 cm ogni sotto esso.</li>
	<li>Chiudere la sutura prossimale alla testa con due nodi. La sutura di altri, preparare un nodo ma non chiuderlo.</li>
	<li>Mantenere il catetere (0,28 mm diametro interno, diametro esterno mm 0,61) riempito con soluzione fisiologica sterile di 37 ° C con una pinza con una mano; mentre con l'altra mano, praticare una piccola incisione nel recipiente con un paio di forbici sottile o un ago curvo 26 G. Quindi inserire il catetere nella vena giugulare e chiudere il nodo due volte. Chiudere la sutura prossimale alla testa sopra il catetere al fine di garantire l'immobilizzazione completa.</li>
	<li>Per isolare e preparare le arterie carotiche, sezionare l'area che copre la trachea usando il forcipe curvo sottile.</li>
	<li>Una volta che le carotidi sono liberi dai tessuti circostanti, rimuovere il nervo vago (si presenta come una linea bianca adiacente la carotide) dalla nave (ma non lo taglio). Il forcipe sottile può essere chiuso e aperto lentamente per mobilitare delicatamente il nervo.</li>
	<li>Una volta che entrambe le arterie sono completamente pulite, collocare la pinza sotto la prima arteria carotica e posizionare un pezzo di plastica piccolo nero 3 mm larghezza x 2,5 cm lunghezza sotto la nave. È molto importante non tirare troppo il vaso e controllare che il flusso di sangue è presente una volta il nave titolare è collocato. Posizionare la seconda arteria sopra il nave titolare. Se il mouse non è posizionato direttamente sotto il microscopio, rimettere le ghiandole sopra la trachea e applicare la soluzione salina sterile a 37 ° C per evitare l'essiccazione della zona.</li>
</ol>
4. valutazione di rotolamento e l'aderenza dei leucociti / LysM + celle con IVM
<ol>
	<li>Preparare acridina arancia da una soluzione madre di 2 mg/mL conservata a-20 ° C e diluirla 1:4 in soluzione fisiologica sterile (concentrazione finale di 0,5 mg/mL) in una siringa da 1 mL.</li></ol>Proteggere la siringa dalla luce e utilizzare 200 µ l per un topo.<ol>
		<li>Diverse condizioni di prova: (1) iniezione di acridina arancia con il catetere giugulare; (2) iniezione di arancio di acridina direttamente nella vena caudale laterale (con questa circostanza che è stato impiantato senza catetere giugulare); (3) misurazione senza topi acridina arancione usando la fluorescenza LysMCre++ di IRG (in questo caso nessun catetere giugulare è stato impiantato).</li>
	</ol>
	
	<li>Una volta che il catetere è a posto e le due carotidi sono isolate, posizionare il mouse al microscopio. Eseguire misure con un microscopio a fluorescenza di largo campo ad alta velocità utilizzando un condensatore a lunga distanza e un 10x (NA 0,3) obiettivo a immersione in acqua con un monocromatore, un divisore di fascio e una fotocamera di charge coupled device. Eseguire analisi con sistema di imaging in tempo reale e acquisizione di immagini.</li>
	<li>Focalizzare l'obiettivo del microscopio nel mezzo dell'arteria carotica alla superficie dell'endotelio. Iniettare lentamente 50 µ l di arancio di acridina (0,5 mg/mL) (prendere in considerazione il volume morto del catetere per la prima iniezione). Impostare il software per registrare 100 immagini con un tempo di esposizione di 120 millisecondi per ogni immagine.</li>
	<li>Fare quattro video per dell'arteria carotica (sinistra e destra) alle posizioni differenti sull'arteria per ogni video. Se il segnale di fluorescenza diminuisce, iniettare un altro 50 µ l di arancio di acridina.</li>
	<li>Dopo aver registrato tutti i video eutanasia animale di dislocazione cervicale.</li>
	<li>Impostare la velocità dei video a 10 immagini al secondo e quantificare le cellule rotolamento e aderente in vista per il rettangolo µm 200 µm x 250, collocato nel mezzo della nave per ogni video. Contare le celle di rotolamento e aderente; le cellule aderenti sono definite come cellule che non spostare o staccare dall'endotelio entro 10 s video. Per semplificare la quantificazione, il canale viene rimosso con la fluorescenza rossa e utilizzare solo la fluorescenza verde per contare le celle di rotolamento e aderente.</li>
	<li>Per esperimenti con arancio di acridina, fare una soglia manuale della fluorescenza al fine di rimuovere sfondo fatto da cellule endoteliali.</li>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

I monociti LysM+ precedentemente sono stati indicati per essere implicati nello sviluppo di ipertensione5. Qui indichiamo che le cellule immunitarie LysM+ rotolo e rispettano lo strato endoteliale in risposta all'infusione di AngII. Questo risultato è stato ottenuto utilizzando LysMCre++ di IRG topi da nostri studi precedenti, esplorando il ruolo delle cellule immuni in ipertensione in vivo visualizzando leucociti con iniezione di arancio di acridina6,10. Così, la discriminazione di tipi delle cellule aderiscono all'endotelio non era possibile.
L'IVM è uno strumento molto utile per studi vascolari e osservazioni in vivo delle cellule direttamente nel sistema vascolare, ma l'impatto di iniettare coloranti con l'aiuto di un catetere inserito chirurgicamente nel contesto infiammatorio di ipertensione rimane sconosciuto. Per valutare l'effetto potenziale del catetere e arancio di acridina iniezione abbiamo approfittato del LysMCre+topi IRG+ . Infusione di AngII ha aumentato il numero di rotolamento LysM+ cellule all'endotelio. Inserimento di un catetere nella vena giugulare amplificato l'effetto e leucociti più rotolamento e aderenti sono stati rilevati nei topi AngII-infuso strumentati con un catetere rispetto ai topi senza catetere protesi. Questo indica che l'impianto di un cause carotica catetere una reazione infiammatoria sistemica nel contesto della cicatrizzazione che si sovrappone con la reazione immune vista in ipertensione18. Inoltre, a causa della vicinanza della vena giugulare all'arteria carotica un'ulteriore attivazione immunitaria potrebbe essersi verificato che interessano la vena giugulare. Poiché questo effetto non era presente quando le iniezioni sono state fatte direttamente nella vena caudale, possiamo supporre che l'effetto era dovuta non alla tintura, ma per la procedura di inserimento del catetere. Abbiamo dimostrato qui l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.
Un passaggio fondamentale della procedura è l'infusione di AngII. Valutazione del polsino della coda della pressione sanguigna può essere fatta al fine di controllare l'efficacia di AngII consegna la pompa. Pressione sanguigna dovrebbero aumentare dopo 2−3 giorni di infusione. Per limitare l'infiammazione che poteva influenzare l'attivazione di cellule LysM+ , chiusura dell'incisione dove viene impiantata la pompa dovrebbe essere effettuata con suture invece di clip. Una limitazione deve essere notata sull'iniezione della vena della coda: per rendere l'acquisizione di dati possibili migliore, 4 video è di solito prese per ogni carotico. Se il segnale fluorescente diminuisce, 50 µ l di arancio di acridina vengono iniettati ma con iniezione coda è più difficile di fare diverse iniezioni e di mantenere le carotidi stabile nell'ambito dell'obiettivo del microscopio. La durata della presenza di un catetere nella vena giugulare potrebbe inoltre modulano l'attivazione di cellule immunitarie poiché si sta interessando l'attivazione di coagulazione in plasma ricco di piastrine preparato 4 h dopo l' impianto di catetere19. Questo aspetto dell'impianto di catetere necessita di ulteriori indagini.
Infine, anche se apprezziamo l'impatto dell'impianto di catetere giugulare sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII, completamente abbiamo non possiamo stimare il ruolo della preparazione, la rimozione della pelle e carotica isolamento su una potenziale cellula LysM+ attivazione. Concludiamo che l'uso di topi reporter fluorescenza come il LysMCre++ di IRG mouse è consigliato per evitare interruzioni di integrità del vaso durante la preparazione degli animali per l'imaging in vivo .

Ipertensione arteriosa aumenta il rischio di malattia cardiovascolare e di morte e promuove lo sviluppo di aterosclerosi, malattia coronarica e tromboembolie arteriose o venose1. Lo sviluppo di ipertensione dipende dall'interazione di fattori ambientali, genetici, endocrini ed emodinamici. Attualmente, l'immunità e infiammazione correlato sono apprezzate per svolgere un ruolo importante in eziologia di ipertensione2.
Tra le cellule del sistema immunitario, i macrofagi così come monociti e linfociti T sono stati trovati per essere causalmente coinvolti nell'infiammazione vascolare indotta da AngII e ipertensione, in parte legate alla loro capacità di innescare di specie reattive dell'ossigeno3. Topi deficienti di fattore del macrofago distimolazione ha mostrato ridotta risposta di AngII per quanto riguarda l'aumento della pressione sanguigna e l'infiammazione vascolare4. In un precedente lavoro, abbiamo potuto mostrare che i monociti LysM + guidano disfunzione vascolare e l'infiammazione in ipertensione indotta da AngII5. Più recentemente, abbiamo descritto una via novella nella quale coagulazione fattore XI coopera con le piastrine e la parete del vaso per indurre l'infiammazione vascolare trombina-dipendente6. Le attuali conoscenze sul ruolo del sistema immunitario nell'ipertensione recentemente sintetizzata e recensita da Rodriguez-Iturbe et al. 7
Dal momento che il coinvolgimento delle cellule immuni nello sviluppo di ipertensione è diventato evidente, modelli e tecniche per lo studio dell'interazione tra la nave e le cellule immuni è diventato necessari. Epifluorescence IVM dei vasi sanguigni è un utile strumento per osservare in vivo interazioni fra le cellule del sangue e l'endotelio8,9,10di circolazione. Con questa tecnica, iniezione di coloranti intercalanti con DNA (ad esempio di arancio di acridina) possa visualizzare cellule nucleate (circolazione nonché dall'endotelio). Piastrine isolate tinto ex vivo con rhodamin - 6G o della diclorofluorescina (DCF) può essere iniettata per visualizzare embolo ricco di piastrina in modelli di lesione arteriosa o venosa.
In genere, un catetere giugulare è usato per iniettare traccianti o contrassegnato le piastrine. Alterazione dell'endotelio e la successiva attivazione della cascata della coagulazione sono entrambi noti per avere effetti sull'attivazione del monocito. Lesione endoteliale porta immediatamente all'attivazione delle piastrine tramite molecole subendothelial matrice per sigillare il tessuto, con conseguente monocito attrazione e attivazione11. Al contrario, un endotelio intatto è noto per avere proprietà anticoagulanti (ad es., via inibitore di via di fattore del tessuto o thrombomodulin)12 ed effetti inibitori diretti su monocito, ad esempio, attraverso la secrezione di vescicole extracellulari contenenti microRNA13. I monociti sono noti per produrre un fattore del tessuto, l'attivatore estrinseco della cascata della coagulazione ed esprimere recettori attivati da proteasi (PARs) che possono essere attivati dalla trombina e partecipare a monocito attivazione14,15 . Pertanto, qualsiasi attivazione delle piastrine o della cascata della coagulazione, a causa di lesioni vascolari può avere effetti inattesi sulla attivazione del monocito e interferire con il fenomeno osservato. Con l'aiuto di topi transgenici di LysM Cre transgenici IRG, un mouse di reporter di doppio-fluorescente Cre (LysMCre+IRG+), ci proponiamo di studiare in dettaglio l'effetto delle iniezioni con un catetere e metodi alternativi su LysM+ cellule myelomonocytic in un modello murino di ipertensione arteriosa16.

<table><tbody><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>Miscela per anestesia</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>Miscela per anestesia</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>Miscela per anestesia</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Miscela antisedan</td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Hikma pharma</td><td></td><td>Miscela antisedan</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe osmotiche</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>Impianto di pompa osmotica</td></tr><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Impianto di pompa osmotica</td></tr><tr><td>Sutura in prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Impianto di pompa osmotica</td></tr><tr><td>Acridina arancione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catetere</td><td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>Diametro interno, 0,28 mm; diametro esterno, 0,61 mm</td></tr><tr><td>Microscopio</td> Microscopio a fluorescenza <td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td></tr><tr><td>Beam Splitter</td><td>Fotometria</td><td>CMR-DV2-SYS - Obiettivo DualView2 MicroImager</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Obiettivo Olympus</td><td>UMPLFLN10X</td><td>Obiettivo a immersione in acqua con monocromatore</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Acquisizione e analisi delle immagini software</td><td>Olympus</td><td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>Mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 008705</td><td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>Topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td></tr></tbody></table>

visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina ii-infuso topi: tecniche e insidie

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Videomicroscopia video epifluorescenza (IVM) dei vasi sanguigni è un metodo consolidato per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e la loro capacità di ruolo e rispettare lo strato endoteliale. Visualizzazione di cellule circolanti per iniezione di coloranti fluorescenti o fluorophore-accoppiati anticorpi è comunemente usato. In alternativa, possono essere utilizzati topi reporter fluorescente. Interazioni dei leucociti, in particolare lisozima M+ (LysM+) monociti, con la parete del vaso giocano un ruolo fondamentale nella promozione della disfunzione vascolare e ipertensione arteriosa. Qui presentiamo la tecnica per visualizzare e quantificare leucocita rotolamento e adesione nelle arterie carotiche in angiotensina II (AngII)-ha indotto l'ipertensione nei topi di IVM.
L'impianto di un catetere danneggia la parete vascolare e porta a risposte alterata delle cellule del sangue. Abbiamo confrontato le tecniche di iniezione differenti e vie di somministrazione per visualizzare i leucociti in un LysMCre++ di IRG mouse con diffusa espressione della proteina fluorescente rossa e condizionale espressione della proteina fluorescente verde in LysM + cellule. Per studiare l'attivazione delle cellule di LysM+ , abbiamo usato AngII infuso topi in cui rotolamento e adesione dei leucociti all'endotelio è aumentato. Abbiamo iniettato o catetere acridina arancione utilizzando una giugulare o direttamente se la coda della vena e rispetto la quantità di rotolamento e l'aderenza delle cellule. Abbiamo trovato che l'impianto di catetere giugulare per sé aumentato il numero di rotolamento e aderente LysM+ cellule in sham-infuso LysMCre+topi IRG+ rispetto ai controlli. Questa attivazione è stata aumentata in topi AngII-infuso. Interessante, l'iniezione di adesione delle cellule acridina arancio direttamente attraverso la coda della vena non ha aumentato LysM+ o rotolamento in topi falsità-infuso. Abbiamo quindi dimostrato l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.

Carotidi di LysMCre++ di IRG infusi con AngII topi sono stati osservati utilizzando IVM. Arancio di acridina è stato iniettato usando un catetere giugulare. Abbiamo mirato a guardare la proporzione di cellule LysM+ a contatto con la parete vascolare rispetto a tutte le cellule nucleate circolanti (che potrebbero anche interagire con la nave, poiché la discriminazione del tipo cellulare interagendo con la nave è rimasto un open domanda dal nostro lavoro precedente). Al basale, la presenza di un catetere giugulare provoca adesione delle cellule LysM+ (Figura 2A, D). Dopo l'iniezione di arancio di acridina, le stesse cellule erano fluorescente, ma anche le cellule endothelial erano fluorescenti (Figura 2B, E). Dopo la riduzione dello sfondo per limitare endoteliali correlate a fluorescenza, i dati indicano che tutte le cellule nucleate aderenti sono LysM+ (Figura 2, F); Questi risultati valgono dopo infusione di AngII confermando i nostri risultati precedenti e dimostrando che il LysMCre++ di IRG è un buon modello per osservare l'effetto di AngII sull'attivazione delle cellule LysM+ .
Abbiamo valutato il ruolo delle vie di somministrazione dell'acridina arancia sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII in LysMCre++di IRG. Dopo una settimana di AngII infusione, interazioni leucocitarie endotelio nelle arterie carotiche di LysMCre++ di IRG topi erano imaged e visualizzati da IVM con o senza iniezione di arancio di acridina tramite un catetere giugulare o attraverso la vena caudale. Senza catetere o iniezione, rotolamento delle cellule LysM+ è stato aumentato significativamente dopo infusione di AngII rispetto ai topi non trattati e l'adesione ha mostrato un aumento (Figura 3). Iniezione di acridina arancia con una catetere giugulare aumentata adesione e rotolamento in AngII topi trattati in misura maggiore rispetto ai topi senza catetere (Figura 3). Iniezione di acridina arancia nella vena caudale conduce ad adesione simili e rotolamento rispetto ai topi che non hanno ricevuto l'iniezione di arancio di acridina (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Figura 1. Schema di infusione di angiotensina II e di valutazione di LysM+ cellule di rotolamento e adesione in topi. LysMCre++ di IRG topi sono stati infusi 7 giorni con AngII e aderendo così come rotolamento LysM+ cellule sopra le carotidi sono state quantificate con o senza iniezione di acridina arancia tramite un catetere giugulare o vena caudale iniezione. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Nella figura 2. Valutazione dell'adesione cellulare LysM+ e rotolamento nelle arterie carotiche di LysMCre+topi IRG+ . Cellule di adesione di LysM+ in LysMCre+topi IRG+ prima (A, D) e dopo l'iniezione di acridina (B, E) tramite un catetere giugulare. Fluorescenza rossa e verde sono state registrate, erano visibili cellule LysM+ (in verde) e cellule di muscolo liscio (in rosso). Dopo iniezione di arancio di acridina, le cellule endoteliali sono anche visibili in verde ma rimozione di fluorescenza di fondo permette solo circolanti nucleate visualizzazione delle cellule (C, F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Nella figura 3. Valutazione delle vie di somministrazione di coloranti fluorescenti in angiotensina II infuso LysMCre+topi IRG+ . Quantificazione di rotolamento (A) e di aderire LysM (B)+ cellule in animali AngII-infuso o sham operati e con o senza iniezione di arancio di acridina utilizzando un catetere giugulare o di iniezione della vena della coda. Immagini rappresentative delle diverse condizioni (C). I risultati sono media ± errore standard della media. 2-way ANOVA è stato effettuato e post hoc test di Bonferroni, n = 3-12/gruppi; p &lt; 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive l'uso di topi transgenici reporter e vie di somministrazione differenti di coloranti fluorescenti in angiotensina II-ipertensione indotta mediante videomicroscopia video microscopia dei vasi sanguigni per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e loro capacità di rotolare e aderire all'endotelio.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

L'obiettivo generale di questa videomicroscopia intravitale per epifluorescenza, o protocollo IVM dei vasi sanguigni, è visualizzare e quantificare il rotolamento e l'adesione dei leucociti nelle arterie corrose nell'ipertensione indotta da angiotensina II nei topi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patologia della disfunzione vascolare e dell'ipertensione arteriosa, come il meccanismo di interazione tra i leucociti e in particolare i lisosomi e le cellule positive, e il lavoro dei vasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo vedere le interazioni in vivo tra le cellule del sangue circolanti e la comprensione vascolare.Preparare un topo maschio per l'intervento chirurgico dopo sette giorni di trattamento con angiotensina due con una pompa osmatica secondo il testo protol. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per proteggerli durante la procedura. Posizionare l'animale anestetizzato in decubito dorsale su una placca chirurgica a 39 gradi Celsius e inserire una sonda rettale per mantenere la temperatura.Usa un batuffolo di cotone per stendere e strofinare la crema depilatoria sul collo fino a quando i capelli iniziano a cadere. Quindi, dopo altri 2 minuti, utilizzare una spatola per rimuovere i peli e la crema. Quindi, disinfettare la pelle utilizzando un antisettico alcolico per la pelle.Successivamente, sotto uno stereomicroscopio, praticare un'incisione longitudinale da 1 a 1,5 cm nella pelle del collo, a 1 cm dalla trachea. Quindi, praticare 2 incisioni perpendicolari su entrambe le estremità della prima incisione. Rimuovere con cautela il fazzoletto appena sotto la pelle e rimuovere il pezzo di pelle che copre la vena giugulare sinistra e la trachea.Quindi, utilizzare due pinze curve per isolare accuratamente le ghiandole corrose sublinguali e sottomascellari dalla zona di interesse. Facendo attenzione a non tagliare o danneggiare le ghiandole, posizionarle in modo da consentire il miglior accesso alla vena giugulare e ai corridoi. Quindi, per isolare la vena giugulare, inserire una pinza sottile tra il vaso e il tessuto circostante e aprire e chiudere lentamente lo strumento per liberare delicatamente la vena dal tessuto.Una volta che la vena giugulare è completamente pulita, posizionare la pinza sotto il vaso e posizionare due suture 7-0 lunghe 10 cm sotto di essa. Fare due nodi per chiudere la sutura prossimale alla testa e con la seconda sutura, preparare un nodo, ma non chiuderlo. Ora, con una pinza in una mano, tieni il catetere riempito con soluzione fisiologica sterile a 37 gradi Celsius, quindi con l'altra mano, usa le forbici o un ago curvo calibro 26 per praticare una piccola incisione nel vaso.Inserire il catetere nella vena giugulare e chiudere il nodo due volte. Quindi, chiudere la sutura prossimale alla testa sopra il catetere per garantire la completa immobilizzazione. Per isolare e preparare le arterie corrose, utilizzare una pinza curva sottile per sezionare l'area che copre la trachea.Quindi, una volta che le corrose si sono liberate dai tessuti circostanti, rimuovere il nervo vegas dal vaso senza tagliarlo, chiudendo e aprendo lentamente le pinze sottili, se necessario, per mobilizzare delicatamente il nervo. Una volta che entrambe le arterie sono completamente pulite, posizionare la pinza sotto la prima arteria corrosa e, facendo attenzione a non allungare eccessivamente il vaso, posizionare un piccolo supporto per vaso di plastica nero di 3 mm per 2,5 cm sotto il vaso. Una volta posizionato il supporto del vaso, assicurarsi che il flusso sanguigno sia presente.Per evitare di allungare il vaso, la mano dell'operatore deve muoversi il meno possibile con un solo movimento della prima pinza per isolare l'arteria corrosa e l'aiuto della seconda pinza per praticare un foro sotto il vaso. Quando il supporto del recipiente è posizionato correttamente, posizionare la seconda arteria sopra il dispositivo. Se il topo non viene posizionato direttamente sotto il microscopio, riposizionare le ghiandole sulla trachea e applicare soluzione fisiologica sterile a 37 gradi Celsius per evitare l'essiccazione della zona.In una siringa da 1 mL, preparare una diluizione da 1 a 4 in soluzione fisiologica sterile, di una soluzione madre scongelata da 2 mg per mL di arancia acridina. Proteggere la siringa dalla luce. Per eseguire le misurazioni, posizionare il mouse sotto un microscopio a fluorescenza ad alta velocità e ad ampio campo utilizzando un condensatore a lunga distanza e un obiettivo a immersione in acqua 10x con un monocromatico, un divisore di fascio e una telecamera CCD.Acquisisci immagini in tempo reale focalizzando l'obiettivo al centro dell'arteria corrosa sulla superficie endoteliale. Iniettare lentamente 50 ml di arancia acridina. Quindi, impostare il software per registrare 100 immagini, con un tempo di esposizione di 120 millisecondi per immagine.Registra quattro video per arteria corrosa in punti diversi dell'arteria per ogni video. Se il segnale fluorescente diminuisce, iniettare altri 50 ml di arancia acridina. Per testare diverse condizioni, iniettare l'arancia acridina direttamente nella vena caudale laterale se non è stato inserito un catetere giugulare ed eseguire la stessa acquisizione dell'immagine.Come controllo, registrare le misurazioni della florescenza da topi lis-Mcre-Mcre-positivi e IRG-positivi non iniettati. Quantifica le celle di rollio e aderenza in una vista rettangolare di 200 micron per 250 micron posizionata al centro del recipiente per ogni video, visualizzato a una velocità di 10 immagini al secondo. Contare le celle di rotolamento e aderenza.Le cellule di aderenza sono definite come cellule che non si muovono o si staccano dall'endotelio entro il video di 10 secondi. Per semplificare la quantificazione, rimuovere il canale con la fluorescenza rossa e utilizzare solo la fluorescenza verde per contare le cellule che rotolano e aderiscono. In questo studio, le corrose di topi lys-mCre positivi e IRG-positivi infusi con angiotensina 2, sono state osservate utilizzando IVM.Come si vede qui al basale, la presenza di un catetere giugulare ha provocato l'adesione di cellule fluorescenti lys-M-positive. Dopo l'iniezione di acridina arancione, anche le cellule endoteliali erano fluorescenti. Quindi, la riduzione del fondo per limitare la fluorescenza correlata all'endoteliato, ha rivelato che tutte le cellule aderenti nucleate erano lys-M positive.In questo esperimento, dopo una settimana di infusione di angiotensina 2, le interazioni dell'endotelio leucocitario nelle arterie corrose di topi lys-M Cre-positivi all'IRG, sono state visualizzate mediante IVM, con o senza iniezione di arancia acridina, tramite un catetere giugulare o attraverso la vena caudale. Senza alcun catetere o iniezione, il rotolamento delle cellule lys-M positive è aumentato significativamente dopo l'infusione di angiotensina 2, rispetto ai topi non trattati. E anche l'adesione è stata aumentata.L'iniezione di arancia acridina con un catetere giugulare ha aumentato l'adesione e il rotolamento nei topi trattati con angiotensina 2, in misura maggiore rispetto ai topi senza catetere. Infine, come si vede in questi pannelli, l'iniezione di arancia acridina nella vena caudale porta a un'adesione e a un rotolamento simili rispetto ai topi che non hanno ricevuto l'iniezione di arancia acridina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in trenta minuti se eseguita correttamente.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare i tessuti che circondano i vasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori in campo cardiovascolare ed emostatico per esplorare i leucociti e l'adesione piastrinica alla parete vascolare in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come limitare l'impatto dell'iniezione di colorante e della chirurgia nell'IVM.Non dimenticare che lavorare con coloranti fluorescenti intercalanti può essere estremamente pericoloso e il contatto della pelle con il colorante deve essere evitato con il materiale appropriato, come i guanti.

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Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

In questo video, dimostriamo la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellula del sangue-endoteliale nelle vene mesenteriali di un modello murino iniettato per via intraperitoneale con lipopolisaccaride.

Microscopia intravitale per analizzare le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali in un modello murino di infiammazione

Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.

Valutare interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso in un Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow Camera

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.

Imaging dell'adesione molecolare nel laminaggio cellulare mediante analisi dell'impronta di adesione

L'imaging in vivo delle articolazioni è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA).

In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

Scopri la microscopia intravitalia per visualizzare il rotolamento e l'adesione dei leucociti nelle arterie carotidee di topi con ipertensione da angiotensina II. Questo metodo permette di studiare le interazioni cellulari in vivo.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

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