Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

L'obiettivo generale di questa videomicroscopia intravitale per epifluorescenza, o protocollo IVM dei vasi sanguigni, è visualizzare e quantificare il rotolamento e l'adesione dei leucociti nelle arterie corrose nell'ipertensione indotta da angiotensina II nei topi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patologia della disfunzione vascolare e dell'ipertensione arteriosa, come il meccanismo di interazione tra i leucociti e in particolare i lisosomi e le cellule positive, e il lavoro dei vasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo vedere le interazioni in vivo tra le cellule del sangue circolanti e la comprensione vascolare.

Preparare un topo maschio per l'intervento chirurgico dopo sette giorni di trattamento con angiotensina due con una pompa osmatica secondo il testo protol. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per proteggerli durante la procedura. Posizionare l'animale anestetizzato in decubito dorsale su una placca chirurgica a 39 gradi Celsius e inserire una sonda rettale per mantenere la temperatura.

Usa un batuffolo di cotone per stendere e strofinare la crema depilatoria sul collo fino a quando i capelli iniziano a cadere. Quindi, dopo altri 2 minuti, utilizzare una spatola per rimuovere i peli e la crema. Quindi, disinfettare la pelle utilizzando un antisettico alcolico per la pelle.

Successivamente, sotto uno stereomicroscopio, praticare un'incisione longitudinale da 1 a 1,5 cm nella pelle del collo, a 1 cm dalla trachea. Quindi, praticare 2 incisioni perpendicolari su entrambe le estremità della prima incisione. Rimuovere con cautela il fazzoletto appena sotto la pelle e rimuovere il pezzo di pelle che copre la vena giugulare sinistra e la trachea.

Quindi, utilizzare due pinze curve per isolare accuratamente le ghiandole corrose sublinguali e sottomascellari dalla zona di interesse. Facendo attenzione a non tagliare o danneggiare le ghiandole, posizionarle in modo da consentire il miglior accesso alla vena giugulare e ai corridoi. Quindi, per isolare la vena giugulare, inserire una pinza sottile tra il vaso e il tessuto circostante e aprire e chiudere lentamente lo strumento per liberare delicatamente la vena dal tessuto.

Una volta che la vena giugulare è completamente pulita, posizionare la pinza sotto il vaso e posizionare due suture 7-0 lunghe 10 cm sotto di essa. Fare due nodi per chiudere la sutura prossimale alla testa e con la seconda sutura, preparare un nodo, ma non chiuderlo. Ora, con una pinza in una mano, tieni il catetere riempito con soluzione fisiologica sterile a 37 gradi Celsius, quindi con l'altra mano, usa le forbici o un ago curvo calibro 26 per praticare una piccola incisione nel vaso.

Inserire il catetere nella vena giugulare e chiudere il nodo due volte. Quindi, chiudere la sutura prossimale alla testa sopra il catetere per garantire la completa immobilizzazione. Per isolare e preparare le arterie corrose, utilizzare una pinza curva sottile per sezionare l'area che copre la trachea.

Quindi, una volta che le corrose si sono liberate dai tessuti circostanti, rimuovere il nervo vegas dal vaso senza tagliarlo, chiudendo e aprendo lentamente le pinze sottili, se necessario, per mobilizzare delicatamente il nervo. Una volta che entrambe le arterie sono completamente pulite, posizionare la pinza sotto la prima arteria corrosa e, facendo attenzione a non allungare eccessivamente il vaso, posizionare un piccolo supporto per vaso di plastica nero di 3 mm per 2,5 cm sotto il vaso. Una volta posizionato il supporto del vaso, assicurarsi che il flusso sanguigno sia presente.

Per evitare di allungare il vaso, la mano dell'operatore deve muoversi il meno possibile con un solo movimento della prima pinza per isolare l'arteria corrosa e l'aiuto della seconda pinza per praticare un foro sotto il vaso. Quando il supporto del recipiente è posizionato correttamente, posizionare la seconda arteria sopra il dispositivo. Se il topo non viene posizionato direttamente sotto il microscopio, riposizionare le ghiandole sulla trachea e applicare soluzione fisiologica sterile a 37 gradi Celsius per evitare l'essiccazione della zona.

In una siringa da 1 mL, preparare una diluizione da 1 a 4 in soluzione fisiologica sterile, di una soluzione madre scongelata da 2 mg per mL di arancia acridina. Proteggere la siringa dalla luce. Per eseguire le misurazioni, posizionare il mouse sotto un microscopio a fluorescenza ad alta velocità e ad ampio campo utilizzando un condensatore a lunga distanza e un obiettivo a immersione in acqua 10x con un monocromatico, un divisore di fascio e una telecamera CCD.

Acquisisci immagini in tempo reale focalizzando l'obiettivo al centro dell'arteria corrosa sulla superficie endoteliale. Iniettare lentamente 50 ml di arancia acridina. Quindi, impostare il software per registrare 100 immagini, con un tempo di esposizione di 120 millisecondi per immagine.

Registra quattro video per arteria corrosa in punti diversi dell'arteria per ogni video. Se il segnale fluorescente diminuisce, iniettare altri 50 ml di arancia acridina. Per testare diverse condizioni, iniettare l'arancia acridina direttamente nella vena caudale laterale se non è stato inserito un catetere giugulare ed eseguire la stessa acquisizione dell'immagine.

Come controllo, registrare le misurazioni della florescenza da topi lis-Mcre-Mcre-positivi e IRG-positivi non iniettati. Quantifica le celle di rollio e aderenza in una vista rettangolare di 200 micron per 250 micron posizionata al centro del recipiente per ogni video, visualizzato a una velocità di 10 immagini al secondo. Contare le celle di rotolamento e aderenza.

Le cellule di aderenza sono definite come cellule che non si muovono o si staccano dall'endotelio entro il video di 10 secondi. Per semplificare la quantificazione, rimuovere il canale con la fluorescenza rossa e utilizzare solo la fluorescenza verde per contare le cellule che rotolano e aderiscono. In questo studio, le corrose di topi lys-mCre positivi e IRG-positivi infusi con angiotensina 2, sono state osservate utilizzando IVM.

Come si vede qui al basale, la presenza di un catetere giugulare ha provocato l'adesione di cellule fluorescenti lys-M-positive. Dopo l'iniezione di acridina arancione, anche le cellule endoteliali erano fluorescenti. Quindi, la riduzione del fondo per limitare la fluorescenza correlata all'endoteliato, ha rivelato che tutte le cellule aderenti nucleate erano lys-M positive.

In questo esperimento, dopo una settimana di infusione di angiotensina 2, le interazioni dell'endotelio leucocitario nelle arterie corrose di topi lys-M Cre-positivi all'IRG, sono state visualizzate mediante IVM, con o senza iniezione di arancia acridina, tramite un catetere giugulare o attraverso la vena caudale. Senza alcun catetere o iniezione, il rotolamento delle cellule lys-M positive è aumentato significativamente dopo l'infusione di angiotensina 2, rispetto ai topi non trattati. E anche l'adesione è stata aumentata.

L'iniezione di arancia acridina con un catetere giugulare ha aumentato l'adesione e il rotolamento nei topi trattati con angiotensina 2, in misura maggiore rispetto ai topi senza catetere. Infine, come si vede in questi pannelli, l'iniezione di arancia acridina nella vena caudale porta a un'adesione e a un rotolamento simili rispetto ai topi che non hanno ricevuto l'iniezione di arancia acridina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in trenta minuti se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di non danneggiare i tessuti che circondano i vasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori in campo cardiovascolare ed emostatico per esplorare i leucociti e l'adesione piastrinica alla parete vascolare in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come limitare l'impatto dell'iniezione di colorante e della chirurgia nell'IVM.

Non dimenticare che lavorare con coloranti fluorescenti intercalanti può essere estremamente pericoloso e il contatto della pelle con il colorante deve essere evitato con il materiale appropriato, come i guanti.