Name: Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a isolare e caratterizzare le microparticelle derivate da neutrofili umani e murini utilizzando ultracentrifugazione, citometria a flusso e immunoblotting. Questo metodo rapido ed economico permette di studiare la comunicazione cellulare nei processi fisiologici.

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Siamo grati per l'assistenza tecnica del Dr. Suchitra Swaminathan che gestisce il nucleo di Northwestern Feinberg School di medicina citometria a flusso. Finanziamento è stato fornito da DK101675 (NIH).

Tutto il lavoro animale fu approvato il IACUC nord-occidentale. Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e rispetto di tutti i pertinenti orientamenti normativi e istituzionali. Per soggetti umani donazione di sangue, un consenso informato è stato presentato e firmato; Inoltre, tutti i soggetti umani in questo studio sono stati trattati in conformità con le linee guida istituzionali e federale per il benessere umano.
Nota: La procedura di protocollo sono elencati sotto le sottosezioni seguenti: (i) isolamento delle cellule del midollo osseo del Mouse; (ii) PMN isolamento da midollo osseo murino; (iii) PMN isolamento da sangue umano; (iv) MP isolamento da surnatanti PMN (dall'ultracentrifugazione); (v) caratterizzazione di MPs mediante Western Blotting; (vi) caratterizzazione di MPs da citometria a flusso; (viii) l'applicazione di MPs isolato per la guarigione della ferita di studio
1. isolamento delle cellule del midollo osseo Mouse
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Dissezione del femore e della tibia da piedini posteriori del mouse
	<ol>
<li>Preparare una scatola di eutanasia (ad esempio, una casella di punta vuota 1 mL) per inalazione dell'anestesia. Aggiungere poche gocce di isoflurane 100% su un panno sterile registrato all'interno di un coperchio di scatola di plastica. Secondo le nuove linee guida IACUC, animali non dovrebbe entrare in contatto diretto con isoflurano, così posto un titolare di punta tra il mouse e la garza contenente l'isoflurano. Nota: Isoflurane è un potente anestetico da inalazione e devono essere maneggiate con estrema cautela all'interno di una cappa aspirante.</li>
		<li>Eutanasia topi secondo la raccomandazione IACUC. Posizionare un mouse all'interno della scatola di eutanasia descritta al punto 1.1.1 per 1 – 5 min fino a quando non ha smesso di respirare. Garantire la morte dell'animale eseguendo una dislocazione cervicale.</li>
		<li>Sollevare la pelle addominale utilizzando acciaio inox, 12 cm curvata, pinzette 0,17 X 0,1 mm e tagliare la pelle a metà strada tra l'estremità superiore e inferiore. La buccia da qui alla sezione più distale del corpo del mouse compreso le estremità più basse. Con 10 cm di lunghezza, dritto di dissezione Forbici, rimuovere i muscoli dalle zampe posteriori e dislocare l'articolazione dell'anca, lasciando intatta la testa del femore.</li>
		<li>Usare le forbici per sezionare i muscoli dal femore e la tibia e separare il femore, dalla tibia. Assicurarsi che le estremità delle ossa rimangono intatte, in quanto contengono quantità significative di midollo osseo.</li>
		<li>Rimuovere tutta la carne rimanente facendo rotolare le ossa all'interno di un tovagliolo di carta. Posizionare le ossa pulite in una piastra Petri contenente Medium senza siero (SFM, cioè, esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) senza siero o antibiotici).</li>
		<li>Sciacquare le ossa in etanolo al 70% e poi in SFM.</li>
		<li>Preparare 50 mL di SFM in una provetta conica da 50 mL. Caricare 10 mL di SFM in una siringa da 10 mL e allegarlo a un ago di calibro 25 e 5/8 di pollice.</li>
		<li>Tagliare le estremità delle ossa con le forbici, fino a un'apertura al midollo osseo (colore rossastro) è visibile.</li>
		<li>Lavare le cellule del midollo osseo in una nuova provetta da 50 mL. Utilizzare una siringa da 10 mL con un ago di calibro 26 e 5/8 di pollice con circa 3 mL/osso di SFM. Al termine di vampate di calore, risospendere le cellule nel tubo pipettando (punte di plastica monouso da 1 mL uso) per rompere aggregati cellulari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN isolamento dal midollo osseo murino
<ol><li>
Lisi delle cellule rosse
	<ol>
<li>Pellet di midollo osseo raccolto mediante centrifugazione a 350 x g per 8 min a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di 0,2% NaCl per circa 20-30 s a lisare la frazione dell'eritrocito. Non superare 30 s come questo si tradurrà nella lisi PMN. Aggiungere 20 mL di 1,6% NaCl per ripristinare osmolalità. Nota: Questo passaggio può portare all'attivazione di PMN molto poco.</li>
		<li>Lavare le cellule con 2 mL di PBS e centrifugare come descritto al punto 2.1.1 sopra. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Procedere alla separazione PMNs centrifugazione in gradiente di densità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento dei neutrofili di centrifugazione in gradiente di densità
	<ol>
<li>Caldo polysucrose e sodio diatrizoate soluzioni, con densità di 1,119 g/mL e 1,077 g/mL (Vedi Tabella materiali), a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare polysucrose e sodium diatrizoate gradienti freschi, immediatamente prima dell'applicazione delle cellule del midollo osseo di stratificazione lentamente 3 mL di soluzione densità 1,077 g/mL oltre 3 mL di soluzione di densità 1,119 g/mL in provette coniche da 15 mL. Nota: La preparazione della soluzione gradiente troppo lontano in anticipo si tradurrà in miscelazione degli strati e scarsa purezza del neutrofilo e recupero.</li>
		<li>Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo in 1 mL di PBS ghiacciata e la sospensione cellulare risultante in cima il diatrizoate polysucrose e sodio di sovrapposizione sfumatura (lentamente, per evitare la miscelazione degli strati).</li>
		<li>Centrifuga per 30 min a 850 x g a 25 ° C a RT, senza freno. Conservare i reagenti a RT per separazione effettiva dei neutrofili dalle altre cellule presenti nel midollo osseo. Impostare la centrifuga in decelerazione lenta per consentire il gradiente deve essere efficiente formata e mantenuta dopo la fase di centrifugazione.</li>
		<li>Localizzare visivamente uno strato di cellule mononucleari all'interfaccia di PBS e soluzione di densità 1,077 g/mL (livello superiore). Rimuovere questo strato e il resto della soluzione densità senza disturbare la band PMN.</li>
		<li>Raccogliere un intero livello PMN e alcune delle polysucrose sottostante e soluzione di sodio diatrizoate 1,119 g/mL in provette da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Nota: La purezza dell'isolato PMNs dipenderà una rimozione completa dello strato superiore.</li>
		<li>Home page i tubi con filtrata PBS (filtrata attraverso un filtro di dimensione dei pori di 0.1 µm) e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare il pellettato PMNs con 2 mL di PBS utilizzando le condizioni di centrifugazione come descritto al punto 2.2.7.</li>
		<li>Risospendere in 1 mL di PBS filtrata e contare i PMNs isolato di un emocitometro. Nota: Per questo metodo di isolamento, la purezza PMN risultante ammonta a ~ 85-90%, come è stata valutata da citometria a flusso. Il restante contaminando le frazioni costituita principalmente da linfociti mononucleari.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimolazione di PMN di indurre il rilascio di MP Nota: PMNs possono essere stimolate a rilasciare MPs utilizzando varie condizioni d'attivazione, tra cui N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) o interferone gamma (IFNγ). Importante, prima della simulazione, PMNs dovrebbero essere tenuti su ghiaccio in ogni momento.<ol>
<li>PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione soluzione (HBSS) salina bilanciata di Hank, contenente l'agente stimolante della scelta. Per stimolazione ottima, utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL. Nota: Le seguenti concentrazioni di attivatori sono state utilizzate con successo nel nostro lavoro precedente: fMLF (0,5-1 µM per umani e 2-5 µM per mouse PMNs), PMA (200 nM) e IFNγ (100 ng/mL). Se è previsto il rilascio di MPs pre-etichettata, incubare PMNs non stimolate (1-5 x 106) con N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (Vedi Tabella materiali) (1 µM 100 µ l HBSS, 15 min, 37 ° C). Procedere con la procedura 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Rotazione verso il basso a 850 x g per 5 min a 4 ° C, per rimuovere PMNs e trasferire senza cellula surnatanti a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Per l'isolamento di MP da surnatanti senza cellula, continuare al punto 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PMN isolamento da sangue umano
<ol><li>
Reclutare volontari sani per l'estrazione di sangue secondo le linee guida istituzionali IRB.
	<ol>
<li>Raccogliere il sangue dall'avambraccio di un volontario sano nelle provette contenenti citrato di sodio a 5ml commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Pipettare 5 mL della soluzione di diatrizoate destrano e sodio (densità 1,113 g/ml, Vedi Tabella materiali) in provette sterili da 15 mL e lentamente strato 5 mL di sangue periferico umano appena isolato in cima esso.</li>
		<li>Centrifugare le provette per 50 min a 400 x g a temperatura ambiente (25 ° C) con bassa accelerazione e senza freno.</li>
		<li>Al termine della centrifugazione, rimuovere il plasma e cellule mononucleari (strato superiore) utilizzando una pipetta sterile di aspirazione in plastica.</li>
		<li>Trasferire lo strato inferiore (PMNs) in una nuova provetta conica sterile 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere un volume equivalente di 0,45% NaCl di PMNs (mix bene e delicatamente ruotando il tubo).</li>
		<li>Centrifugare per 10 min 400 x g e a 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lisi delle cellule rosse
	<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di acqua ghiacciata, sterile a pellettato cellule per 45 s seguita da 10 mL di gelida sterile 1,8% NaCl per ripristinare osmolalità. Nota: Tutti i passaggi seguenti per isolamento di PMN devono essere eseguiti sul ghiaccio per evitare l'attivazione di PMN e rilascio prematuro di MP. Il passo di lisi stessa provoca l'attivazione di PMN minore ma non significativo, tuttavia, è essenziale per l'isolamento di una popolazione di PMN pura per analisi funzionali.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 10 min a 250 x g a 4 ° C con decelerazione morbida.</li>
		<li>Ripeti punti 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Risospendere PMNs in 5 mL di HBSS ghiacciata senza calcio o magnesio. Conteggio totale di cellule vive (USA un emocitometro e attuabilità macchiatura alla diluizione 1:2, Vedi Tabella materiali) prima di stimolazione. Nota: PMNs isolato dovrebbe essere usato per la stimolazione o altri esperimenti entro 2 h di isolamento per evitare cambiamenti funzionali e cellulari e morte cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP isolamento da surnatanti attivato PMN
Nota: Un simile protocollo viene utilizzato per l'isolamento di MPs da PMNs murine ed umane.
<ol><li>PMNs pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) e risospendere in 0,1 µm filtrata soluzione HBSS, contenente l'agente stimolante della scelta (per esempio 1 µM fMLF, vedere Nota: 2.3.1). Per stimolazione ottima utilizzare 100 µ l di soluzione di stimolazione per 10 milioni PMNs per 20-30 min a 37 ° C in provette da 15 mL.</li>
	<li>Dopo stimolazione, spin giù PMNs attivato a 600 x g per 5 min a 4 ° C e trasferire senza cellula surnatanti in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugare il supernatante PMN-cancellata a 13.000 x g, 10 min, 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta di ultracentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare per 1 h a 100.000 x g, a 4 ° C. Rimuovere i surnatanti prima dello stoccaggio MP. Se necessario, archivio pellettato MPs in paraffina sigillato tubi ultracentrifuga a-80 ° C fino all'utilizzo negli esperimenti.</li>
</ol>5. esame dei PMN-MPs mediante Western Blotting
<ol><li>Aggiungere 1% SDS tampone (50-200 µ l con 100 millimetri Tris pH: 7,4) a MPs a pellet (dal punto 4.4), trasferimento a nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL e portare a ebollizione il lisato MPs per 5 min. Nota: Il numero di parlamentari e il volume di tampone di Lisi deve essere regolato e ottimizzato per ogni proteina di interesse.</li>
	<li>
Caricare gli importi uguali di PMN-MPs per corsia in tampone contenente β-mercapto-etanolo al 10% di carico. Nota: Con il nostro metodo carichiamo i parlamentari che sono stati isolati dallo stesso numero di PMN stimolato.<ol>
<li>Separare i lisati mediante SDS-PAGE su gel di poliacrilammide del 10% (utilizzare 50-100 V per 1-1,5 h) e il trasferimento di proteine totali sulle membrane di nitrocellulosa come descritto9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membrane per 1 h con 5% senza grassi del latte in 0.05% Tween-20 soluzione fisiologica tamponata di bloccare e viene quindi incubato con un appropriato primario (una notte a 4 ° C), seguito da anticorpi secondari coniugati a HRP.</li>
	<li>Visualizzare le bande aggiungendo soluzione di chemiluminescenza per la membrana e l'esposizione ad una pellicola di raggi x all'interno di una cassetta a prova di luce (1-24 h).</li>
</ol>6. l'esame dei PMN-MPs tramite flusso Cytometry
<ol><li>
Per la macchiatura dell'anticorpo, diluire gli anticorpi in modo appropriato nel buffer di FACS (PBS con 0,1 mM EDTA, 0,1% di sodio azide). Risospendere pellettato PMN-MPs (derivato da 1-3 x 106 PMNs/condizione) in 100 µ l di soluzione di anticorpo.
	<ol>
<li>Se la macchiatura per annessina V, risospendere pellettato PMN-MPs in tampone di Annexin V contenente 5 µ l di coniugato FITC Annessina V. Se co-macchiando con gli anticorpi, aggiungere gli anticorpi desiderati (per vedere un esempio Tabella materiali) direttamente alla soluzione di annessina V. Aggiungere il colorante fluorescente del lipido, N-(2-aminoethyl) maleimide (Vedi Tabella materiali), a 1 concentrazione µM in 100 µ l di tampone di FACS per etichettare e identificare MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la MPs nella macchiatura soluzione per almeno 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare il MPs dall'ultracentrifugazione (1h a 100.000 x g, a 4 ° C); scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere in FACS tampone ed eseguire gli esempi su un citometro a flusso designato dotato di un'unità elettronica aggiornata per una maggiore sensibilità (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>7. le domande di isolato PMN-MPs studiare la funzione PMN nella guarigione delle ferite
<ol><li>
Somministrazione in vivo di PMN-MPs a coliche ferite
	<ol>
<li>Anestetizzare topi tramite un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Confermare l'anestesia da pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare secondo necessità.</li>
		<li>Posizionare il mouse sul suo stomaco e utilizzando pinze da biopsia di 28 cm e un endoscopio dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (ad esempio un endoscopio veterinario per piccoli animali utilizzare, Vedi Tabella materiali), generare 3-5 ferite superficiali lungo il lato dorsale della due punti. Al termine del ferimento, topi di ritorno per una gabbia inserito su una stuoia di temperatura (37 ° C) fino a quando non ha recuperato.</li>
		<li>Anestetizzare topi (come al punto 7.1.1). Utilizzare un endoscopio per acquisire immagini di ferite inflitte post-ferendone 24 h (giorno 1). Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.</li>
		<li>Allo stesso tempo (24 h post-ferimento), amministrare murino PMN-MPs derivato da 2 x 106 PMNs in 100 µ l di HBSS + direttamente in ogni luogo della ferita usando un microinjection basati sulla colonscopia (uso un ago 29 G)9. Tre giorni più tardi (4 ° giorno post-ferimento) anesthetize topi (come al punto 7.1.1) e utilizza un endoscopio per riacquisire immagini di guarigione delle ferite. Lasciate che i topi recuperare come descritto al punto 7.1.2.</li>
		<li>Utilizzando software di analisi di immagine preferita (Vedi Tabella materiali), aree della struttura visibile ferita in immagini acquisite, misura l'area della stessa ferita ai giorni 1 e 4 post-ferendo e calcolare la percentuale di chiusura della ferita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellule umane epiteliali delle cellule in vitro guarigione della ferita
	<ol>
<li>BBe Caco-2 count o T84, cellule epiteliali intestinali umane di emocitometro e seme 5x105 cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti coltura. Incubare le cellule in una camera standard di incubazione a 37 ° C e 5% CO2. Caco-2 BBe o T84 raggiungere confluency all'interno di 48 h9. Di cultura di cellule epiteliali, utilizzare DMEM e DMEM-F12 (50: 50) con i supplementi come precedentemente descritto9.</li>
		<li>Generare meccanica ai graffi ferite nello strato monomolecolare del utilizzando un puntale e bassa aspirazione come precedentemente descritto4,9. Acquisire immagini della ferita aree immediatamente dopo graffiare utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita interferenza differenziale (uso 5x o 10x obiettivi), per essere utilizzato come un tempo = punto di riferimento 0.</li>
		<li>MPs (derivato da 2-4 X 106 PMNs) in strati monomolecolari della cellula epiteliale graffiato-ferito ed incubare per altre 24 h (48 h post-ferimento, a 37 ° C con 5% CO2). In questo momento ri-acquisire immagini delle ferite-zero.</li>
		<li>Utilizzare software di analisi di immagine preferita (vedere Tabella materiali) per misurare aree ferita a t = 0 e t = 48 h. calcola la percentuale di chiusura della ferita determinando la differenza nella zona della ferita presso i punti di tempo selezionato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di qualsiasi natura in relazione alla presente comunicazione

Protocolli per l'isolamento e la caratterizzazione di PMN-derivato MPs sono descritti nella presente comunicazione. Parecchi punti critici chiave deve tener conto per il successo della procedura. In primo luogo, PMNs deve essere isolato fresco e usato negli esperimenti entro 2 h di isolamento per prevenire degranulazione e attivazione spontanea. Tutte le gestione di PMNs durante l'isolamento e fino al punto di stimolazione deve essere eseguita sul ghiaccio per impedire l'attivazione e prematuro MP versione<sup class="xre...

Recentemente, "microparticelle/microvescicole" provenienti dal cytosol delle cellule o della membrana plasmatica sono diventati di grande interesse scientifico, come i dati emergenti suggeriscono che queste strutture, che vanno da 50-1.000 nm di diametro, possono trasportare informazioni biologiche e servire come un metodo non-canonica di comunicazione cellulare. Immunitario cellule derivate MPs e specialmente quelli prodotti dai neutrofili polimorfonucleari (PMNs) sono di grande interesse, dato l'importante ruolo di PMNs in host defense1,2, le risposte infiammatorie3e guarigione 4. intrigante, finora, numerose segnalazioni hanno dimostrato sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori funzioni di PMN-MPs5, suggerendo un potenziale contesto - malattia-, specie- e ruolo di organo-specific di MPs.
Protocolli descritti nella presente comunicazione forniscono un metodo conveniente, innovativo e adattabile per studiare la funzione di MPs nella salute e nella malattia. Sono applicabili a molti organismi modello, organi e condizioni di stimolazione. Essi consentono l'identificazione di diversi tipi di MPs e può essere utilizzati in futuro per affrontare le loro funzioni pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Ad esempio, descritto qui è come studiare la funzione di PMN-MPs in arrotolata epiteliale guarigione in vitro e in vivo. Il protocollo presentato per l'isolamento del mouse PMNs derivate da midollo osseo è stato adattato con alcune modifiche da un metodo descritto in precedenza6.
Inoltre, protocolli descritti in questo studio consentono l'individuazione e la caratterizzazione di marcatori specifici che possono essere trovati su PMN-MPs con due metodi complementari: Western blot e citometria a flusso. Troviamo che immunoblotting di MPs utilizzando protocolli standard5 è semplice e affidabile, tuttavia, i recenti progressi nella sensibilità di flusso cytometry strumenti e una migliore rapporto segnale-rumore ora consentono per ulteriori analisi di MPs utilizzando questo metodo. Incorporano i protocolli descritti in questo studio gli avanzamenti recenti e consigli da articoli di ricerca originale, incluse le modifiche alla velocità di centrifugazione e ora, l'aggiunta dell'esempio filtraggio e congelamento/conservazione condizioni7 , 8e come ridurre il "rumore di fondo", migliorare il limite di rilevamento di PMN-MPs e discriminare tra diverse dimensioni di MPs.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (inattivato termicamente)</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (10.000 unità di penicillina / 10.000 mg/ml di streptococco)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP2482</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Sterile e filtrato attraverso un 0,1 unità filtrante micron</td></tr><tr><td>Sterile filtrato Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtrato Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Densità 1.119 g/ml. Soluzione di polisaccarosio e... diatrizoato di sodio. Portare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico (200 proof)</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu, 0,4%</td> <td>Sigma</td><td>T8154 SIGMA</td><td>Diluito 1:2 per il conteggio della vitalità cellulare</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD11b-APC coniugato</td><td>Biolegend</td><td>301350</td><td>Clone ICRD44 (Concentrazione finale: 1 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-amminoetil) maleimmide&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone legante Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>Perle di calibrazione per citometria a flusso</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td></td><td>Diatrizoato di sodio/destrano 500, densità 1,113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuga da 15 ml tubi</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 ml provette da centrifuga</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche da 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche da 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche da 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 pollici. Aghi (aghi di scorrimento di precisione)</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtri cellulari m</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Provette Vacutainer</td><td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td><td>BD</td><td>(SORP)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a secchiello oscillante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a secchiello oscillante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per biopsia, 28 cm</td><td>Storz</td><td>27071zj<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>Open source&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Microparticelle neutrofili polimorfonucleate (PMN)-MPs) sono il doppio strato lipidico, microvescicole sferica con dimensioni che vanno da 50 – 1.000 nm di diametro. M/s sono una nuova evoluzione, parte importante della comunicazione cellula-cellula e segnalazione macchine. A causa della loro dimensione e la natura del loro rilascio, fino a poco tempo esistenza MP è stato trascurato. Tuttavia, con la migliore tecnologia e metodi analitici sta emergendo la loro funzione nella salute e nella malattia. I protocolli qui presentati mirano a isolare e caratterizzare PMN-MPs di immunoblotting e citometria a flusso. Inoltre, diversi esempi di implementazione sono dati. Questi protocolli per l'isolamento di MP sono veloci, basso costo e non richiedono l'uso di costosi Kit. Inoltre, essi consentono l'etichettatura di MPs dopo isolamento, così come pre-etichettatura delle cellule di origine prima del rilascio di MP, utilizzando un colorante fluorescente di membrana specifici per la visualizzazione e l'analisi di citometria a flusso. Questi metodi, tuttavia, hanno diverse limitazioni tra cui purezza di PMNs e MPs e la necessità di sofisticata strumentazione analitica. Un citometro a flusso High-end è necessario analizzare MPs e minimizzare letture false positive a causa di rumore o auto-fluorescenza in modo affidabile. I protocolli descritti possono essere utilizzati per isolare e definire la biogenesi di MP e caratterizzano i loro marcatori e variazione nella composizione sotto diverse condizioni stimolanti. Eterogeneità di dimensioni può essere sfruttata per indagare se il contenuto di particelle della membrana contro esosomi è diverso, e se essi soddisfano diversi ruoli nell'omeostasi del tessuto. Infine, può essere esplorate seguente isolamento e caratterizzazione di MPs, la loro funzione in risposte cellulari e vari modelli di malattia (tra cui, PMN-collegata di disordini infiammatori, quali le malattie infiammatorie intestinali o ferita acuta del polmone).

Analisi di cytometric di flusso rappresentativi dei parlamentari che sono stati isolati dall'essere umano e del mouse PMNs sono mostrati nella Figura 1. L'eterogeneità di dimensioni di PMN-MPs può essere valutato in confronto ai branelli di dimensioni conosciute come mostrato in Figura 1A, B per umano MPs. nota, sono state osservate differenze significative nella eterogeneità di dimensioni tra mouse e MPs umano. ...

Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare e caratterizzare microparticelle derivate da neutrofili per studi funzionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo delle vescicole esocellulari, o microparticelle, nella comunicazione cellula-cellula in diversi processi fisiologici, tra cui il cancro, l'infiammazione e la guarigione delle ferite. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è relativamente veloce, economica e che consente la valutazione della composizione psicotipica delle microparticelle, o micro-vescicole, negli asset funzionali.A dimostrare la procedura saranno Ariel Finkielsztein, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio, e Joseph Lee, uno studente universitario nel mio laboratorio. Per la separazione in gradiente di densità di cellule polimorfonucleari del midollo osseo murino, o PMN, sovrapporre lentamente tre millilitri di soluzione appena preparata, a temperatura ambiente, 1,077 grammi per millilitro su tre millilitri di soluzione di densità di 1,119 grammi per millilitro appena preparata, a temperatura ambiente, in una provetta conica da 15 millilitri per campioni di cellule del midollo osseo. Quindi sovrapporre un m

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Immunologia e Infezioni

I neutrofili sono tra le prime cellule ad arrivare sul luogo del infiammatoria risposta immunitaria, e le loro funzioni e meccanismi sono stati ampiamente studiata in vitro. Si dimostra uno standard gradiente di densità metodo di separazione per isolare neutrofili umani da sangue intero utilizzando mezzi di separazione disponibili in commercio.

Neutrofili isolamento Protocollo

Questo video dimostra l'isolamento delle proteine dai neutrofili, che vengono ulteriormente elaborate e digerite in peptidi più piccoli. Questi peptidi possono essere utilizzati per analisi future.

Isolamento e digestione delle proteine neutrofile

Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

I neutrofili svolgono un ruolo importante non solo nella difesa dell'ospite contro i microrganismi invasori, ma sono anche coinvolti nella sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali. Qui, descriviamo le tecniche relative all'isolamento di neutrofili con proprietà antitumorali e i metodi per monitorare la funzione dei neutrofili antitumorali in vitro e in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Descriviamo qui un metodo per ottenere e identificare una sottopopolazione di recente caratterizzato dei fagociti giganti neutrofili derivato. Queste cellule si sviluppano in cultura da freschi neutrofili sangue umano, e sono caratterizzati da fagocitosi, l'autofagia, immensamente grandi dimensioni, e la durata della vita estesa. Questo metodo è fondamentale per approfondire questo unico sottopopolazione neutrofili-derivati.

Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant In Vitro

In questa ricerca, dimostriamo un metodo privo di etichetta del neutrofilo separazione da clinica delle secrezioni bronchiali mediante operazione di ciclo chiuso della microfluidica inerziale a spirale. Il metodo proposto sarebbe espandere i dosaggi clinici in vitro per varie malattie respiratorie.

Label-free del neutrofilo arricchimento da secrezione di paziente-derivato della via aerea utilizzando microfluidica inerziale Closed-loop

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

In questo caso, forniamo un approccio affidabile per isolare neutrofili a bassa e normale densità dal sangue intero utilizzando l'isolamento magnetico (selezione negativa) e il mezzo a gradiente di densità discontinuo. Garantisce l'isolamento intatto di cellule ad alta purezza (≥93%), facilitando un'analisi accurata a valle delle sottopopolazioni di neutrofili, fondamentale per comprendere il loro ruolo nella salute e nella malattia.

L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

I neutrofili a bassa densità (LDN) aumentano significativamente in diverse malattie. Le LDN sono solitamente isolate attraverso la selezione cellulare. Presentiamo un metodo pratico per ottenere LDN puro e vitale. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico, le cellule vengono incubate con microsfere magnetiche e quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche.

Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

Impara a isolare e caratterizzare le microparticelle derivate da neutrofili umani e murini utilizzando ultracentrifugazione, citometria a flusso e immunoblotting. Questo metodo rapido ed economico permette di studiare la comunicazione cellulare nei processi fisiologici.

Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

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