Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare e caratterizzare microparticelle derivate da neutrofili per studi funzionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo delle vescicole esocellulari, o microparticelle, nella comunicazione cellula-cellula in diversi processi fisiologici, tra cui il cancro, l'infiammazione e la guarigione delle ferite. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è relativamente veloce, economica e che consente la valutazione della composizione psicotipica delle microparticelle, o micro-vescicole, negli asset funzionali.

A dimostrare la procedura saranno Ariel Finkielsztein, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio, e Joseph Lee, uno studente universitario nel mio laboratorio. Per la separazione in gradiente di densità di cellule polimorfonucleari del midollo osseo murino, o PMN, sovrapporre lentamente tre millilitri di soluzione appena preparata, a temperatura ambiente, 1,077 grammi per millilitro su tre millilitri di soluzione di densità di 1,119 grammi per millilitro appena preparata, a temperatura ambiente, in una provetta conica da 15 millilitri per campioni di cellule del midollo osseo. Quindi sovrapporre un millilitro di cellule del midollo osseo appena isolate in PBS ghiacciato sullo strato superiore del gradiente di densità di ciascuna provetta e separare le cellule mediante centrifugazione del gradiente di densità.

Al termine della separazione, rimuovere con cura gli strati di celle mononucleate alle interfacce tra il PBS e gli strati superiori del gradiente di densità in ciascuna provetta senza disturbare le bande PMN. Utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere gli strati di PMN in una nuova provetta da 15 millilitri per campione e portare il volume finale in ciascuna provetta fino a 15 millilitri con PBS filtrato da 0,1 micron. Pellettare i PMN mediante centrifugazione, seguita da una seconda centrifugazione in due millilitri di PBS appena filtrato per provetta.

Quindi risospendere i pellet in un millilitro di PBS appena filtrato per il conteggio. Dopo il conteggio, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 100 microlitri di HBSS filtrato da 0,1 micron, integrato con lo stimolante di interesse per 10 milioni di cellule. Incubare per 20-30 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine della stimolazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e trasferire i surnatanti privi di cellule in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per campione. Centrifugare i surnatanti per rimuovere eventuali detriti cellulari e trasferire i surnatanti eliminati in nuove provette per ultracentrifuga, quindi centrifugare i surnatanti e conservare le microparticelle pellettate in provette per ultracentrifuga sigillate con paraffina a 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi sperimentali. Per somministrare le microparticelle nel colon del topo, posizionare prima un topo completamente anestetizzato in posizione prona e utilizzare una pinza per biopsia e un endoscopio dotato di una telecamera ad alta risoluzione per generare da tre a cinque ferite superficiali lungo il lato dorsale del colon.

Rimettere il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino al completo recupero. 24 ore dopo, utilizzare l'endoscopio per acquisire immagini delle ferite inflitte in anestesia. Quindi utilizzare un sistema di microiniezione basato sulla colonscopia per somministrare un volume sperimentale di microparticelle PMN risospese in 100 microlitri di HBSS direttamente in ciascun sito della ferita.

L'eterogeneità dimensionale delle microparticelle PMN può essere valutata confrontando le microparticelle con microsfere di citometria a flusso di dimensioni note. Come dimostrato, l'espressione delle proteine di interesse da parte delle microparticelle può essere esaminata anche mediante citometria a flusso. In questo esperimento, l'espressione di molecole infiammatorie e antinfiammatorie chiave da parte di microparticelle derivate da PMN stimolate dall'attivatore è stata valutata mediante immunoblot.

Gli effetti delle microparticelle PMN sulla guarigione delle cellule epiteliali possono essere monitorati mediante l'acquisizione di immagini di monostrati epiteliali feriti da graffio in punti temporali predeterminati in vitro, nonché dopo la ferita da pinze bioptiche in vivio. Una volta padroneggiate, le microparticelle derivate da PMN possono essere isolate entro quattro ore, se la tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che prima della stimolazione, il PMN deve essere tenuto su ghiaccio per evitare l'attivazione prematura e la perdita di microparticelle.

Seguendo questa procedura, la citometria a flusso, l'immunoblotting e le tecniche di reazione alla proliferazione in tempo reale possono essere utilizzate per definire il contenuto di microparticelle, in varie condizioni stimolatorie, o da diverse cellule di origine. Questa tecnica è utile per esaminare il ruolo del contributo delle microparticelle nella regolazione delle risposte immunitarie, nella funzione di barriera, nel danno e nella riparazione dei tessuti, nonché nella progressione del cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare ed etichettare le microparticelle murine e di utilizzare le microparticelle in una risorsa funzionale per la guarigione delle ferite in vivo.

Non dimenticare che lavorare con animali vivi può essere pericoloso e che le precauzioni suggeriscono di indossare i dispositivi di protezione individuale e completare gli appropriati corsi di formazione sulla sicurezza prima di eseguire questa procedura.