Name: In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Scopri il tracking di singole molecole in vivo al terminale presinaptico del nervo motorio di Drosophila melanogaster. Questa tecnica PALM consente di visualizzare e tracciare proteine sinaptiche individuali con alta risoluzione.

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Ringraziamo Jean-Baptiste Sibarita e Daniel Choquet (IINS, CNRS/Università di Bordeaux) per il loro supporto gentile con l'analisi di singola molecola. Ringraziamo in particolare Nick Valmas e Jessica Mcgaw (QBI, Università del Queensland) per il loro aiuto con il video registrazione, Voice-over, nonché figura di disegno grafico. Questo lavoro è stato supportato dal progetto scoperta Consiglio di ricerca australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), l'Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), futuro Fellowship (FT100100725 a B.V.S), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M.) e progetto NHMRC concedere (APP1103923 a B.V.S). F.A.M. è NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. design di transgenici della drosofila che esprimono le proteine mEos2-etichetta
<ol><li>Selezionare la proteina per essere contrassegnati con la proteina mEos2. Per aumentare il tasso di successo di imaging, selezionare proteine con un dominio transmembrana della membrana neuronale14 (ad es., sintaxina-1A), proteine delle vescicole sinaptiche o autofagosomi26,27 (ad es., Synaptobrevin-2), o proteine citosoliche con stretta interazione con le proteine di un neurone membrana plasmatica (ad es., Munc18-1).</li>
	<li>Costruire transgeni che codifica per la proteina mEos2-etichetta (Figura 1). Progettare il primer forward e reverse per la proteina e mEos2. Nota: La sequenza di codificazione di mEos2 può essere amplificata dal plasmide pmEos2-N1, che è stato progettato per fondere al C-terminale della proteina di interesse. Clonazione per esempio può essere eseguita tramite la ricombinazione in vivo in Saccharomyces cerevisiae usando il pFL44S-attB-MCS-w + vector14,28, alternativamente altri metodi di duplicazione potrebbero essere usati come Gibson Assemblea protocollo29.<ol>
<li>Linearizzare il vettore con BamHI e XbaI e co-trasformare in cellule di lievito ura3 - insieme i frammenti PCR codifica mEos2 e la proteina di interesse. Iniettare gli embrioni della drosofila con il costrutto per generare una linea di volo transgenici30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posteriore le culture transgeniche volare su standard medio di lievito e melassa o qualche altro sostituto adatto contenuti in fiale di plastica. Per garantire la sana e abbastanza grande boutons sinaptici31, evitare sovraffollamento mosche nelle fiale e capovolgere mosche a new fiale dopo ogni giorno di deposizione delle uova; in questo modo le larve instar terza sono ben nutrite e raggiungono dimensioni adeguate per il momento che cominciare vagare sul mezzo. Sollevare la Mosca transgenica a temperatura ambiente (25 ° C). Nota: Boutons sinaptici più grandi tendono a produrre grandi quantità di proteine visualizzati durante la formazione immagine.</li>
</ol>2. dissezione del terzo Instar Larva
<ol><li>Fare un ≤20 base cilindrica o semicilindrica sagomato polidimetilsilossano (PDMS) mm di diametro e ≤20 mm di altezza, utilizzando un kit di elastomero di silicone appropriato (Figura 2A). Mescolare elastomero di silicone con un silicone indurente con un rapporto di 10:1.<ol>
<li>Mescolare accuratamente per 5 min, versare il composto in uno stampo con il dimsensions sopra elencato. Lasciare indurire in un forno a 100 ° C per 45 min. La base PDMS servirà come il fondamento su cui effettuare la dissezione. Garantire la base PDMS si adatta nel pozzetto di una piastra di coltura con fondo di vetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare un'errante terzo instar larva dalla parete flaconcino. Utilizzare un stereo-microscopio ottico a 4,5 ingrandimento per visualizzare la larva posizionata sulla base PDMS cilindrica con il lato dorsale fino.</li>
	<li>Uso curvo e angolati pinzetta a bastone minutien perni sulla testa, sopra i ganci di bocca, tra i due che estende spiracoli anteriori e sulla coda sopra l'ano, tra le due spiracoli posteriori. Aggiungere 40 µ l di terreno dell'insetto di Schneider a temperatura ambiente sulla larva immobilizzata. Nota: Hemolyph-come soluzioni (HL3 o HL6) possono anche essere utilizzate al posto soluzione32,33 di Schneider.</li>
	<li>Fornire l'accesso attraverso il lato dorsale della parete addominale del corpo della larva di utilizzo di un pin di minutien incidere nella linea mediana della parete.</li>
	<li>Uso primavera forbici per tagliare la parete del corpo aprire dal punto di incisione. Tagliare lungo la linea mediana in direzione antero-posteriore34.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta e forbici per sventrare la larva di primavera: rimuovere gli organi interni, tra cui le ghiandole salivari, la trachea e l'intestino. Lavare la larva due volte con il mezzo dell'insetto di Schneider.</li>
	<li>Con una pinzetta, tenere i due lembi di parete del corpo, delicatamente li tratto fuori e bastone due minutien pin su ogni lato. Questo dovrebbe produrre una preparazione a forma di esagono (Figura 2A).</li>
	<li>Staccare il cervello dal cavo ventrale del nervo usando le forbici di primavera per diminuire la possibilità di movimento muscolare durante la formazione immagine; Questo serve anche a tenere la preparazione piatto contro il piatto di imaging. Usare le pinzette curve per spingere tutti i sei minutien pin nella base PDMS. Nota: Solo una piccola parte dei pin dovrebbe essere incorporata all'interno della parete addominale.</li>
	<li>Per confermare che la larva è sopravvissuto la procedura di dissezione, colpire leggermente il cavo ventrale del nervo, questo dovrebbe suscitare una contrazione peristaltica della parete addominale della larva.</li>
</ol>3. leggermente obliqua singola particella rilevamento microscopia
<ol><li>Capovolgere la base della larva-PDMS dissecata su una piastra di coltura con fondo di vetro. Riempire il piatto di imaging con 2 mL di terreno di insetto di temperatura Schneider (Figura 2B).</li>
	<li>Individuare i motoneuroni nei segmenti secondo e il terzi con sinapsi su muscoli addominali 6 e 735 utilizzando la x 63 / 1.2 obiettivo a immersione in acqua NA su un microscopio a fluorescenza (TIRF) fluorescente di riflessione interna totale.</li>
	<li>Utilizzare gli oculari del microscopio per individuare la larva dissecata; identificare muscolo 6 uso di illuminazione in campo chiaro.</li>
	<li>Utilizzare il software di acquisizione del microscopio (Vedi Tabella materiali), in configurazione TIRF; far scorrere l'angolo di ripresa di collimatore 1° per aumentare la profondità di penetrazione, in caso contrario spostare fuori TIRF angolo critico per ottenere illuminazione obliqua.</li>
	<li>Accendere il laser 488 nm per visualizzare mEos2 in verde. Utilizzare un laser a bassa potenza (meno di 5% di 22,8 mW) per evitare lo sbiancamento la fluorescenza verde. Individuare le giunzioni neuromuscolari (che appaiono come perle su una stringa) e acquisire un'immagine TIRF di bassa risoluzione.</li>
	<li>Contemporaneamente, accendere il laser 405 nm (mEos2 di photoconverts da verde a rosso specie) e il 561 nm laser (immagine del mEos2 photoconverted rosso) per localizzare casualmente mEos2 singole proteine fluorescenti. Nota: È consigliabile uso di bassa potenza di laser 405 nm (0,005 allo 0,9% di 4,78 mW) come questo permette per un tasso di fotoconversione relativamente costante durante l'acquisizione di film. Uso tra il 50 e il 75% del laser 561 nm (20,1 mW), in quanto questo è sufficiente per acquisire fluorescenza dalle specie mEos2 rosso senza alterare la morfologia del tessuto del muscolo che circonda la giunzione neuromuscolare.</li>
	<li>Per ogni catena di giunzione neuromuscolare, acquisire un tempo serie composta da 15.000 fotogrammi o più a 33 Hz. as.czi formato di salvataggio al fine di preservare l'accompagnamento meta-dati per eventuale riferimento.</li>
	<li>Utilizzare ImageJ per convertire film '.czi' 'TIFF' file.</li>
	<li>Analizzare i filmati acquisiti con adatta singola molecola tracking software di analisi11,14,36 come TrackMate sul FIJI/ImageJ37 (Vedi Tabella materiali). Individua la 'x' e 'y' le coordinate di ogni localizzazione dalla vestibilità gaussiana del punto di intensità diffuso funzione (PSF). Nota: risoluzione dei problemi: se fluorescenza verde non è osservato o è troppo debole alla giunzione neuromuscolare sopra l'esposizione al laser 488 nm, accendere brevemente il photoconverting e imaging laser (405 nm e 561 nm), come questo aiuta a produrre più del rosso specie di mEos2. Quindi passare nuovamente alla parte 488 nm laser e prendere un'immagine TIRF.</li>
</ol>4. singola molecola localizzazione nelle larve fisse
<ol><li>Per misurare la dimensione di nanocluster di proteina tramite PALM, è necessario sostituire medio dell'insetto di Schneider dopo dissezione con un fissativo - paraformaldeide 4%, diluito in tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Incubare la larva per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la dissezione perni e posizionare la larva fissa in un 1,7 mL trasparente tubo del microcentrifuge Schioccare-serratura.</li>
	<li>Sezionare e difficoltà come molte altre larve come necessario, quindi lavarli tre volte con PBS.</li>
	<li>Sostituire il PBS con mattoncino buffer (una soluzione di PBS, 0,1% Triton X-100 e 3% siero di capra normale).</li>
	<li>Lavare le larve con PBS tre volte, quindi incubare con l'anticorpo primario necessaria (diluito in soluzione tampone per il blocco).</li>
	<li>Incubare per una notte alle 4 oC.</li>
	<li>Lavare le larve tre volte con PBS, poi incubare con l'anticorpo secondario necessaria (diluito in soluzione tampone per il blocco).</li>
	<li>Lavare le larve tre volte con PBS, allegare la larva sul PDMS base e l'immagine come descritto in precedenza per il rilevamento di singola molecola.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive la singola molecola rilevamento delle proteine mEos2-etichettate alla giunzione neuromuscolare della drosofila terzo instar larva. Per evitare la sovra-espressione della proteina transgenica, sintaxina-1A-mEos2 espressione era guidato da promotore endogeno sintaxina-1A. Studi di mobilità della proteina sinaptica sono stati sostanzialmente limitati alle indagini in vitro di cellule coltivate e neuroni corticali9,11,12,13. Se queste proteine presentano firme di mobilità simile a un animale vivo è in gran parte sconosciuto. Per visualizzare mobilità singolo-proteina in vivo, limitazioni quali profondità ottica di trasparenza, accessibilità e penetrazione devono essere superati. La preparazione larvale di dissezione e la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari incorporate sulla superficie del muscolo, si evita il problema di accessibilità e trasparenza ottica. Tentativi di immagine singola molecola mobilità in configurazione normale TIRF avuto successo. Tuttavia, l'uso di illuminazione leggermente obliqua permette per laser di eccitazione maggiore profondità di penetrazione. Inoltre, i perni di minutien utilizzati per immobilizzare la larva ha contribuito a evitare un eventuale effetto negativo di uso anestetico sulla mobilità della proteina. È possibile utilizzare obiettivi di ingrandimento maggiori, ad esempio 100 x obiettivi di immersione di olio, per visualizzare le singole molecole in vivo. Tuttavia, una maggiore ingrandimento può aumentare l'avvenimento di derive fuori fuoco. Inoltre, abbiamo utilizzato un'intensità più bassa (~ 30%) 561 nm laser con successo a singole molecole di immagine presso i terminali del nervo motore. Ulteriori test potrebbe essere necessario utilizzare più bassa potenza del laser.
Questo protocollo è adatto a visualizzare la mobilità di proteine sinaptiche in prossimità della membrana neuronale. Utilizzando questo approccio, la mobilità della proteina SNARE - sintaxina-1A e l'autofagosoma associato proteina Atg18a - sono stati correttamente imaged in vivo14,26. La mobilità delle proteine del neurone di motore assoni possono anche essere studiato27. Tuttavia, indagine della mobilità delle proteine il cervello o del midollo ventrale del nervo può rivelarsi difficile da valutare a causa il segnale elevato rumore di fondo prodotto dal tessuto sottostante; Inoltre, visualizzando la mobilità della proteina sulla stessa struttura del cervello richiederà fluorescente tagging struttura del cervello (per garantire la replicabilità), e uso di formazione immagine doppia fotocamera sarebbe necessaria.
Attuali metodi disponibili per microscopia di Super-risoluzione in Drosophila sono perlopiù limitati agli embrioni imaging, piuttosto che più sviluppato terzo instar larva38,39. Il problema principale di questi protocolli è che produrre un basso numero di traiettorie nell'area imaging e quindi impedire un'analisi approfondita di mobilità stati22,40. I nostri in vivo singola molecola protocollo di rilevamento ha la capacità di generare un elevato numero di traiettorie e pertanto potrebbe essere utilizzata in altri modelli animali come Caenorhabiditis elegans e zebrafish. Infatti, ogni catena NMJ generato ~ 2.400 traiettorie che lo rende adatto per analizzare il mobili diversi Stati e le transizioni tra questi stati14,27. Inoltre, molti in vivo singola molecola strategie di imaging si basano sull'uso di anestetici per immobilizzare gli animali20,22, che potrebbe alterare la funzione fisiologica in cui è fatto l'imaging. Qui abbiamo ottimizzato un protocollo 'anestesia-free' per immobilizzare le larve con perni minutien.
Un uso potenziale di questo protocollo può essere per la visualizzazione la mobilità delle proteine in tre dimensioni. Gli avanzamenti recenti nella microscopia di Super-risoluzione permettono una mobilità di proteina essere visualizzati in vitro a 'x', 'y' e 'z' dimensioni41,42. Il nostro metodo attuale non tiene conto per la mobilità delle proteine nell'asse 'z'. Eppure il terminale del nervo motore Drosophila è una struttura sferica e un valido approccio futuro sarà quello di quantificare la mobilità della proteina in un volume tridimensionale43. L'imaging nella dimensione z è fattibile utilizzando una lente astigmatica. In alternativa, in TIRF modalità44,45, la risoluzione di z è anche aumentata. Tuttavia, nei nostri esperimenti, abbiamo usato leggermente obliqua per visualizzare singole molecole di syntaxin1A-mEos2 senza le lenti astigmatiche.
In conclusione, la disponibilità di entrambi un transgenici Drosophila volare stock che esprimono le proteine taggati con una proteina di fotoconvertibile, una base di PDMS dissezionare la larva transgenica, come pure un microscopio TIRF equipaggiato con la possibilità di cambiare il angolo di illuminazione sono gli strumenti più importanti necessari per visualizzare singole proteine, come descritto in questo protocollo.

Comunicazione di un neurone si basa sul rilascio di neurotrasmettitori, che avviene attraverso la fusione regolamentata delle vescicole sinaptiche contenenti neurotrasmettitore con la membrana plasmatica1. Questo processo chiamato esocitosi2,3,4,5,6 è altamente dinamico e può essere up - o down-regolati secondo le fluttuazioni del tasso di stimolazione7. Le proteine coinvolte in questi processi sono soggetti a moto browniano e pertanto visualizzato nanoscopica organizzazione capace di sostenere una serie di azioni che sono alla base di queste funzioni fisiologiche vincolanti. Proteine di membrana plasmatica sono altamente dinamici, consentendo laterale dell'intrappolamento di molecole in nanocluster la membrana plasmatica7,8,9,10,11, 12. Come tale, indagando la mobilità di queste proteine contribuisce a delucidare la loro modalità di azione8. Proteine sinaptiche come la N-ethylmaleimide fattore sensibile allegato proteine recettori solubili (trappole), ad esempio sintaxina-1A, ora sono conosciute per esibire mobilità veloce laterale, come pure laterale trapping all'interno di nanocluster che possono servire come molecolare depositi e siti per vescicola fusione9,13,14,15.
Il recente sviluppo di proteine fluorescenti fotoconvertibile, come monomerico (m) Eos16,17 e Kaede18, ha permesso la risoluzione nanoscopica delle proteine di un neurone membrana plasmatica attraverso l'uso di approcci tali come microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) e stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)14,15,19. Questi sviluppi hanno permesso le indagini nella mobilità e nella nanoclustering delle proteine biologiche nelle cellule coltivate dal vivo e nei neuroni. Più recentemente, sono stati condotti studi per delucidare (a risoluzioni elevate simili) le dinamiche e l'organizzazione di queste proteine di membrana nei neuroni di esseri viventi intatti tale Mus musculus, elegans di Caenorhabditis e Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Indagando le dinamiche e l'organizzazione di una proteina in vivo richiede non solo l'uso degli strumenti imaging ad alta super-risoluzione sviluppato di recente (ad esempio di fluorofori PALM, STORM e fotoconvertibile), ma anche la capacità di superare tali ostacoli come l'accessibilità della proteina e la profondità di penetrazione del laser imaging. Le proteine intracellulari in un animale intatto di imaging è intrinsecamente impegnativo quanto è imaging proteine sulle strutture incorporati profondo all'interno di tessuti viventi dell'animale intatto, quale l'ippocampo di un mouse intatto. Quindi, più facilmente sono Imaging proteine su o vicino alla superficie del tessuto. Un'altra difficoltà con imaging in vivo è garantire riproducibilità attraverso gli animali. Come l'anatomia potrebbe differire da un campione a altro, selezionando una struttura con facilità di replica in diversi campioni di animali intatti potrebbe anche rivelarsi difficile. L'utilizzo di strutture stereotipate, come sinapsi, aiutare con superamento di alcune di queste difficoltà.
Studi recenti hanno ripreso la mobilità della proteina negli animali con un'epidermide otticamente trasparente come Caenorhabditis elegans22, mentre altre indagini hanno ripreso la organizzazione della proteina sulla superficie di un tessuto/organo, per esempio formazione immagine di actina in neuroni corticali attraverso il cranio di un topo vivo21. In alcuni casi, gli anestetici sono stati utilizzati per mantenere l'animale immobile; Tuttavia, anestetici specifici possono influenzare negativamente la proteina di interesse. Mezzi alternativi per mantenere gli animali immobile durante l'imaging in vivo dovrebbero pertanto essere esplorati per minimizzare l'errore.
Un altro avvertimento a Super-risoluzione imaging in vivo è che il laser usato per illuminare le proteine di interesse poteva influenzare negativamente il tessuto circostante, e quindi mantenere l'intensità di eccitazione più basso possibile è raccomandato. Illuminazione del tessuto circostante dal laser tende anche ad aumentare il segnale di fondo. L'uso di intensità bassa eccitazione aiuta a ridurre lo sfondo, l'avvertenza che essendo esso potrebbe anche portare ad una diminuzione della resa del fotone di proteina fluorescente. Sottrazione di sfondo durante l'analisi potrebbe essere utilizzato come mezzo alternativo per ridurre il segnale di fondo prima dell'analisi di immagine.
Drosophila presenta un organismo ideale per in vivo imaging poiché fornisce strumenti genetici ben consolidati per l'indagine della funzione della proteina specifica. La sequenza d'attivazione a Monte (UAS)-sistema Gal4 consente l'espressione temporale e spaziale delle proteine e pertanto può essere utilizzato per manipolare la neurotrasmissione23, tale che stimolo termo-genetica usando Drosophila transitoria Sottofamiglia potenziali recettori A1 (dTRPA1)24 o stimolazione opto-genetica usando lontana rosso-spostato CsChrimson25 possa essere combinata con imaging14. Abbiamo superato molte delle complicazioni di effettuazione in vivo imaging di singola molecola in questo sistema e ora descrivere come singola particella di monitoraggio può essere effettuata in Drosophila melanogaster terzo instar larve.

<table><tbody><tr><td>PDMS (kit elastomero siliconico Sylgard 184)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura con fondo in vetro</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio ottico</td><td>Pinzetta curva Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>(stile 5/45)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Perni per minuzie (0,1 mm)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini (Dumont #5)</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (16%)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear provetta per microcentrifuga a scatto (1,7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black software di acquisizione</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Ceppo</td><td></td> di mosca <td>w1118; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo singola molecola tracking al terminale presinaptico nervo motore drosophila

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Un numero crescente di tecniche di microscopia di Super-risoluzione stanno aiutando a scoprire i meccanismi che governano il mondo cellulari su scala nanometrica. Formazione immagine singola molecola sta acquistando slancio in quanto fornisce un eccezionale accesso per la visualizzazione delle singole molecole in cellule viventi. Qui, descriviamo una tecnica che abbiamo sviluppato per eseguire il rilevamento di singola particella microscopia localizzazione foto-attivata (sptPALM) nelle larve di Drosophila . Comunicazione sinaptica si basa su importanti proteine presinaptiche che agiscono docking, adescamento, e promuovendo la fusione di neurotrasmettitore contenenti vescicole con la membrana plasmatica. Una gamma di interazioni proteina-proteina e proteina-lipide strettamente regola questi processi e le proteine presinaptiche pertanto mostrano cambiamenti nella mobilità associata con ognuno di questi eventi chiave. Indagando su come la mobilità di queste proteine correla con la loro funzione fisiologica in un animale vivo intatto è essenziale per comprendere il loro meccanismo preciso di azione. L'estrazione di mobilità della proteina con alta risoluzione in vivo richiede superare le limitazioni quali trasparenza ottica, accessibilità e profondità di penetrazione. Descriviamo come proteine fluorescenti fotoconvertibile etichettate alla proteina presinaptica sintaxina-1A possa essere visualizzati tramite leggera illuminazione obliqua e tracciati al terminale del nervo motore o lungo l'assone del neurone di motore del terzo instar Drosophila della larva.

Utilizzando il protocollo transgenico elencati sopra, sintaxina-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster sono stati generati (Figura 1). Transgenici terzo instar Drosophila larve sono state sezionate su base cilindrica PDMS (Figura 2A-F). Per visualizzare le singole molecole di sintaxina-1A, abbiamo utilizzato PALM su un microscopio TIRF con leggermente obliquo laser illuminazione14.
Singole molecole di sintaxina-1A sono state rilevate sui terminali presinaptici del nervo motore sul muscolo 6 del secondo segmento addominale. La fluorescenza verde di mEos2 potrebbe essere rilevata come mostrato dall'immagine a bassa risoluzione di sintaxina-1A-mEos2 su boutons 1b di tipo quando eccitato con il laser di 488 nm (Figura 3A). Negli esperimenti imaging, la 405 nm e 561 nm di eccitazione laser imaging profondità erano 133,5 nm e 165,6 nm, rispettivamente. L'immagine verde è stata acquisita come una media di 16 singoli fotogrammi. Questa immagine verde è stata utilizzata per creare la regione di interesse utilizzato per limitare l'analisi delle localizzazioni nel film photoconverted ai terminali presinaptici del nervo motore da solo.
L'analisi dei film sptPALM photoconverted acquisita generato un'intensità Super-risolta, coefficente di diffusione, e traiettoria mappe (Figura 3A). Sintaxina-1A-mEos2 mobilità più ulteriormente è stato quantificato dall'analisi dello spostamento quadratico (MSD) delle traiettorie individuali (Figura 3B). I confronti statistici possono essere fatto utilizzando l'area sotto la curva MSD (Figura 3B). Un'ulteriore analisi della mobilità produce la distribuzione di coefficiente di diffusione di sintaxina-1A-mEos2, e questo può essere valutato statisticamente tramite il confronto del mobile alle popolazioni immobile (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figura 1 : Generazione di costrutti con tag mEos2. Il pFL44S-attB-MCS-vettore w + è linearizzato con BamHI e XbaI. Frammenti di sovrapposizione reazione a catena della polimerasi (PCR) codifica per la proteina di interesse (PDI) e mEos2, rispettivamente, possono essere clonate, ad esempio, tramite la ricombinazione in vivo in cellule di lievito ura3 - o dall'Assemblea di Gibson. Si noti che per generare il transgene sintaxina-1A-mEos2, abbiamo clonato il costrutto fiancheggiato dalle sequenze di promozione e di terminazione sintaxina-1A endogene. Il costrutto risultante può successivamente essere iniettato negli embrioni della drosofila per creare una linea di volo transgenica esprimenti la proteina di interesse (PDI) fusa a mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figura 2 : Drosophila la dissezione della larva e illuminazione obliqua. Schema (A) risultati dissezione della larva della drosofila effettuata sulla base PDMS semicilindrica. Una larva di filettata era tenuta sul PDMS gel da uso di perni minutien. (B-C) La preparazione della larva-PDMS è stato disposto all'interno di una piastra di coltura con fondo di vetro che contiene il media dell'insetto di Schneider. Un microscopio TIRF in una configurazione leggermente obliqua è stato usato per prevedere sintaxina-1A-mEos2 nei terminali del nervo motore. (D-F) Una base PDMS semicilindrica con dissecata Drosophila larva. La preparazione della larva-PDMS è stato disposto in un piatto di imaging riempito con medie di Schneider e la larva era imaged il microscopio di PALM di Super-risoluzione. Barra di scala, mm. 10 (questa figura è stata modificata da14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figura 3 : In vivo traccia la sintaxina-1A-mEos2 presso il terminale presinaptica del nervo motore. (A) A bassa risoluzione immagine TIRF di sintaxina-1A-mEos2 su un terminale nervoso tipo motore 1b. Analisi di fotoconversione film ripreso a 33 Hz generati sptPALM super-risolto intensità, coefficente di diffusione e traiettoria mappe. 5.309 traiettorie individuali erano imaged oltre 16,000 frames film acquisizione. Barra della scala, 3 μm. (B-C) Quadratico medio dislocamento (MSD) di sintaxina-1A-mEos2 è stata tracciata da 6 terminali del nervo motore diverso; area sotto la curva (AUC) di MSD è stato utilizzato per quantificare il livello di mobilità. La distribuzione del coefficiente di diffusione rivela popolazioni sintaxina-1A mobili ed immobili che possono essere quantificati come rapporti uno da altro; una media di ~ 2.400 traiettorie sono stati ottenuti al terminale del nervo motore (n = 3 larve). Dati presentati come media errore standard della media. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Tracciamento in vivo di una singola molecola al terminale nervoso motorio presinaptico di Drosophila. Questa tecnica descrive come le singole proteine possono essere tracciate e visualizzate in vivo alle terminazioni nervose motorie delle larve di Drosophila di terzo stadio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare, tracciare e localizzare singole proteine ad alte risoluzioni simili a quelle osservate nei sistemi in vitro.Progettazione di Drosophila transgenica. La proteina sinaptica di interesse è marcata con un fluoroforo fotoconvertibile, e questo è espresso in Drosophila melanogaster. Dissezione della larva di Drosophila di terzo stadio.Posiziona una larva errante di terzo stadio su una base Sylgard di forma cilindrica o semicilindrica. Aggiungere 40 microlitri di Schneider's Insect Medium sulla larva. Sotto un microscopio da dissezione, infilare uno spillo minuzioso attraverso la testa e un altro attraverso la coda della larva per immobilizzarla.Per fornire l'accesso, utilizzare uno spillo per minuzie per praticare una stretta incisione sulla linea mediana del lato dorsale della regione addominale della larva. Da questo punto di incisione, utilizzando le forbici a molla, tagliare lungo la parete del corpo in direzione antero-posteriore. Rimuovere gli organi interni dalla larva con l'aiuto di una pinza fine e di forbici a molla.Lavare la larva sezionata con il mezzo per insetti di Schneider. Infilare due spilli minuziosi attraverso ciascuno dei due lembi della parete del corpo per produrre una preparazione di larva sezionata a forma esagonale. Usa le forbici a molla per staccare il cervello della larva dal cordone nervoso ventrale.Usando una pinzetta curva, spingi gli spilli minuziosi nella base Sylgard. Microscopia a localizzazione fotoattivata a tracciamento di particelle singole. Capovolgere la base Sylgard della larva su un piatto di coltura con fondo di vetro riempito con due millilitri di Schneider's Insect Medium a temperatura ambiente.Applicare l'acqua sull'obiettivo a immersione in acqua 63x di un microscopio ELYRA PS.1 e quindi posizionare il piatto sul tavolino. Accendere la luce trasmessa e utilizzare l'oculare per localizzare la larva sulla base Sylgard con l'aiuto dell'obiettivo pneumatico 10x. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 63x e identifica il muscolo sei, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro.Utilizzando il software di acquisizione ZEN Black, selezionare la configurazione TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cambia il laser a 488 nanometri per visualizzare eMos2 in verde. Localizzare le giunzioni neuromuscolari, che sembrano perline su una corda, e acquisire un'immagine TIRF a bassa risoluzione, accendere contemporaneamente il laser a 405 nanometri e il laser a 561 nanometri in modo da fotoconvertire e visualizzare le specie rosse eMos2.Utilizza una potenza laser molto bassa per il laser a 405 nanometri per consentire fotoconversioni stocastiche moderatamente costanti. Qui, un laser a 405 nanometri viene azionato allo 0,09% mentre un laser a 561 nanometri viene azionato al 50% Nelle opzioni dell'angolo TIRF sul software, far scorrere leggermente verso l'esterno l'angolo critico TIRF. Impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi.Acquisire una serie temporale di immagini della giunzione neuromuscolare. Qui è stato acquisito un film di 15.000 fotogrammi. Salva il filmato come file in formato czi.analisi dei dati. Analizzare i filmati acquisiti con opportuni software analitici a tracciamento molecolare singolo. Individua le coordinate x e y di ciascuna localizzazione proteica fluorescente mediante l'adattamento gaussiano della funzione di diffusione del punto di intensità.Per tracciare la traiettoria di ogni localizzazione, impostate una soglia di almeno otto apparizioni di fotogrammi diversi continui per ogni localizzazione e un massimo di tre pixel di mobilità tra ogni fotogramma. Ottenere l'immagine della traiettoria, lo spostamento quadratico medio, nonché il coefficiente di diffusione di tutte le localizzazioni tracciate. Risultati rappresentativi.È stato tracciato lo spostamento quadratico medio delle singole traiettorie di Syntaxin-1A-eMos2 da più giunzioni neuromuscolari in tre diverse larve, come media più meno errore standard della media. È stata anche tracciata l'area sotto la curva di spostamento quadratico medio. Il coefficiente di diffusione della sintassina-1A-mEos2 è stato ottenuto in modo simile da più giunzioni neuromuscolari e tracciato come un istogramma della distribuzione di frequenza relativa.La soglia del coefficiente di diffusione ha rivelato due popolazioni di Syntaxin-1A, una popolazione mobile e una immobile. È stato calcolato il rapporto tra le popolazioni mobili e immobili di Syntaxin-1A-mEos2. Conclusione. Questo video dovrebbe fornire una comprensione di come il tracciamento di una singola proteina possa essere effettuato alla giunzione neuromuscolare delle larve di Drosophila.La tecnica fornisce un modo per i ricercatori nel campo della comunicazione neuronale di visualizzare e osservare la mobilità e l'organizzazione di singole proteine ad alte risoluzioni in vivo.

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Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

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Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

In questo video, le fibre nervose delle larve di Drosophila sono immerse in un colorante FM, che si lega ai lipidi della membrana cellulare. Il microelettrodo di aspirazione e gli impulsi elettrici stimolano il processo di endocitosi, incorporando il colorante FM nelle vescicole endocitiche di nuova formazione. Questo metodo, che visualizza le fasi presinaptiche della neurotrasmissione, è utile per studiare la funzione sinaptica e il rilascio di neurotrasmettitori.

Carico e scarico del colorante FM mediato da microelettrodi nelle cellule nervose delle larve di Drosophila

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Qui, descriviamo il metodo che abbiamo impiegato per immaginare la filopodia dendritica altamente motile in una preparazione dal vivo del cervello larvale della Drosophila, e il protocollo che abbiamo sviluppato per quantificare i set di dati di imaging 3D time-lapse per le valutazioni quantitative dei dendriti dinamica nello sviluppo dei neuroni.

Time-lapse Live Imaging e quantificazione delle dinamiche del ramo dendritico veloce nello sviluppo di neuroni della Drosophila

Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.

Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Scopri il tracking di singole molecole in vivo al terminale presinaptico del nervo motorio di Drosophila melanogaster. Questa tecnica PALM consente di visualizzare e tracciare proteine sinaptiche individuali con alta risoluzione.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

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