In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Tracciamento in vivo di una singola molecola al terminale nervoso motorio presinaptico di Drosophila. Questa tecnica descrive come le singole proteine possono essere tracciate e visualizzate in vivo alle terminazioni nervose motorie delle larve di Drosophila di terzo stadio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare, tracciare e localizzare singole proteine ad alte risoluzioni simili a quelle osservate nei sistemi in vitro.

Progettazione di Drosophila transgenica. La proteina sinaptica di interesse è marcata con un fluoroforo fotoconvertibile, e questo è espresso in Drosophila melanogaster. Dissezione della larva di Drosophila di terzo stadio.

Posiziona una larva errante di terzo stadio su una base Sylgard di forma cilindrica o semicilindrica. Aggiungere 40 microlitri di Schneider's Insect Medium sulla larva. Sotto un microscopio da dissezione, infilare uno spillo minuzioso attraverso la testa e un altro attraverso la coda della larva per immobilizzarla.

Per fornire l'accesso, utilizzare uno spillo per minuzie per praticare una stretta incisione sulla linea mediana del lato dorsale della regione addominale della larva. Da questo punto di incisione, utilizzando le forbici a molla, tagliare lungo la parete del corpo in direzione antero-posteriore. Rimuovere gli organi interni dalla larva con l'aiuto di una pinza fine e di forbici a molla.

Lavare la larva sezionata con il mezzo per insetti di Schneider. Infilare due spilli minuziosi attraverso ciascuno dei due lembi della parete del corpo per produrre una preparazione di larva sezionata a forma esagonale. Usa le forbici a molla per staccare il cervello della larva dal cordone nervoso ventrale.

Usando una pinzetta curva, spingi gli spilli minuziosi nella base Sylgard. Microscopia a localizzazione fotoattivata a tracciamento di particelle singole. Capovolgere la base Sylgard della larva su un piatto di coltura con fondo di vetro riempito con due millilitri di Schneider's Insect Medium a temperatura ambiente.

Applicare l'acqua sull'obiettivo a immersione in acqua 63x di un microscopio ELYRA PS.1 e quindi posizionare il piatto sul tavolino. Accendere la luce trasmessa e utilizzare l'oculare per localizzare la larva sulla base Sylgard con l'aiuto dell'obiettivo pneumatico 10x. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 63x e identifica il muscolo sei, utilizzando l'illuminazione a campo chiaro.

Utilizzando il software di acquisizione ZEN Black, selezionare la configurazione TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cambia il laser a 488 nanometri per visualizzare eMos2 in verde. Localizzare le giunzioni neuromuscolari, che sembrano perline su una corda, e acquisire un'immagine TIRF a bassa risoluzione, accendere contemporaneamente il laser a 405 nanometri e il laser a 561 nanometri in modo da fotoconvertire e visualizzare le specie rosse eMos2.

Utilizza una potenza laser molto bassa per il laser a 405 nanometri per consentire fotoconversioni stocastiche moderatamente costanti. Qui, un laser a 405 nanometri viene azionato allo 0,09% mentre un laser a 561 nanometri viene azionato al 50% Nelle opzioni dell'angolo TIRF sul software, far scorrere leggermente verso l'esterno l'angolo critico TIRF. Impostare il tempo di esposizione su 30 millisecondi.

Acquisire una serie temporale di immagini della giunzione neuromuscolare. Qui è stato acquisito un film di 15.000 fotogrammi. Salva il filmato come file in formato czi.

analisi dei dati. Analizzare i filmati acquisiti con opportuni software analitici a tracciamento molecolare singolo. Individua le coordinate x e y di ciascuna localizzazione proteica fluorescente mediante l'adattamento gaussiano della funzione di diffusione del punto di intensità.

Per tracciare la traiettoria di ogni localizzazione, impostate una soglia di almeno otto apparizioni di fotogrammi diversi continui per ogni localizzazione e un massimo di tre pixel di mobilità tra ogni fotogramma. Ottenere l'immagine della traiettoria, lo spostamento quadratico medio, nonché il coefficiente di diffusione di tutte le localizzazioni tracciate. Risultati rappresentativi.

È stato tracciato lo spostamento quadratico medio delle singole traiettorie di Syntaxin-1A-eMos2 da più giunzioni neuromuscolari in tre diverse larve, come media più meno errore standard della media. È stata anche tracciata l'area sotto la curva di spostamento quadratico medio. Il coefficiente di diffusione della sintassina-1A-mEos2 è stato ottenuto in modo simile da più giunzioni neuromuscolari e tracciato come un istogramma della distribuzione di frequenza relativa.

La soglia del coefficiente di diffusione ha rivelato due popolazioni di Syntaxin-1A, una popolazione mobile e una immobile. È stato calcolato il rapporto tra le popolazioni mobili e immobili di Syntaxin-1A-mEos2. Conclusione. Questo video dovrebbe fornire una comprensione di come il tracciamento di una singola proteina possa essere effettuato alla giunzione neuromuscolare delle larve di Drosophila.

La tecnica fornisce un modo per i ricercatori nel campo della comunicazione neuronale di visualizzare e osservare la mobilità e l'organizzazione di singole proteine ad alte risoluzioni in vivo.