Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre una proteina ricombinante composta da una miscela di domini ordinati e disordinati per l'analisi strutturale ibrida mediante cristallografia a raggi X e diffusione di raggi X a piccolo angolo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia strutturale sull'inserimento della funzione biologica in modo che la determinazione di tutte le soluzioni rimanga la struttura della proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per modellare regioni dinamiche di una proteina o macromolecola che non possono essere risolte con la cristallografia a raggi X.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà all'inizio a imparare a valutare correttamente la qualità dei loro dati SAXS. Per iniziare la procedura, trasformare un plasmide di espressione di Nsa1 in un ceppo di espressione di E.coli adatto. Coltiva le cellule, induce l'espressione di Nsa1 e raccoglie le cellule.

Risospendere le cellule in 25 millilitri di tampone di lisi, pre-raffreddare a quattro gradi Celsius, contenente una compressa di inibitore della proteasi priva di EDTA. Sonicare le celle a quattro gradi Celsius per sette minuti, con un ciclo di due secondi acceso e due secondi spento. Quindi, centrifugare il lisato a 26.900 volte la gravità per 45 minuti a quattro gradi Celsius.

Assicurarsi che la miscela non si congeli durante la centrifugazione. Quindi, equilibrare una colonna di flusso per gravità contenente 10 ml di resina di affinità al cobalto immobilizzata con tampone di lisi. Caricare il lisato chiarificato sulla colonna e lasciarlo fluire attraverso la resina a quattro gradi Celsius.

Quindi, lavare la resina due volte con porzioni da 100 ml di tampone di lisi. Eluire Nsa1 dalla colonna con 20 ml di tampone di eluizione. Eseguire un'aliquota di 15 mcl dell'eluere su un gel SDS-PAGE dal 4 al 15% per confermare l'eluizione della proteina.

Quindi, aggiungere 1 ml della soluzione madre di proteasi TEV da 1 mg/ml all'eluere. Incubare l'eluere a quattro gradi Celsius durante la notte per rimuovere l'etichetta MBP. Quindi, utilizzare un'unità filtrante centrifuga da 10 kilodalton per concentrare l'Nsa1 scisso MBP a circa 5 ml, facendo attenzione a non concentrare eccessivamente.

Purificare la proteina concentrata su una colonna di filtrazione su gel pre-bilanciata con il tampone A.Uno dei passaggi critici di questa procedura è assicurarsi di rimuovere tutti gli aggregati durante la purificazione. Gli aggregati interferiscono con la cristallizzazione e l'acquisizione e l'analisi dei dati SAXS. Analizza campioni da 15mcl da ciascuna frazione di colonna con SDS-PAGE per confermare la separazione di MBP da Nsa1.

Combina le frazioni contenenti Nsa1. Utilizzare un'unità di filtro centrifugo da 10 kilodalton per concentrare le frazioni combinate a circa 8 mg/ml. Misurare l'assorbanza a 289 nanometri e calcolare la concentrazione proteica.

Procedere immediatamente allo screening proteolitico e alle prove di cristallizzazione. Per iniziare lo screening proteolitico, preparare soluzioni madre da 1 mg/ml di alfa-comotripsina, tripsina, elastasi, capayina, septilisina ed endoproteinasi GluC. Diluire ogni soluzione madre con tampone di diluizione a 1:10, 1:100 e 1:1, 000.

Diluire la soluzione da 8 mg/ml di Nsa1 a 1 mg/ml con il tampone A.Quindi, per ogni diluizione della proteasi, combinare 1mcl della diluizione della proteasi con 9mcl dello stock proteico diluito. Incubare le soluzioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, aggiungere 10 mcl di campione 2x SDS-PAGE al tampone a ciascuna soluzione e riscaldare le soluzioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Esegui le soluzioni su un gel SDS-PAGE dal 4 al 15% per identificare i domini resistenti alla proteasi. Creare costrutti di espressione troncati che escludono le regioni labili della proteasi. Esprimi e purifica queste proteine per l'ottimizzazione della cristallizzazione.

Dopo aver acquisito i dati SAXS per la proteina Nsa1 in un intervallo di concentrazioni, impostare il percorso del file della shell terminale sulla directory contenente i dati. Quindi, avvia il software di analisi. Caricare le curve di scattering nel software di analisi.

Utilizzare lo strumento RG automatico per determinare il raggio di rotazione e l'intensità di diffusione in avanti per ogni curva. Quindi, genera grafici Kratky per ogni curva di scattering per determinare il grado di compattezza. Utilizzare lo strumento autonome per calcolare la funzione di distribuzione a coppie per ogni curva, utilizzando una dimensione massima iniziale di 3 volte il raggio di rotazione.

Ottimizzare la dimensione massima per ottenere una curva di funzione di distribuzione a coppie uniforme e coerente con la curva di scattering sperimentale. Confrontare i parametri strutturali tra le concentrazioni per verificare l'assenza di danni da radiazioni o di effetti dipendenti dalla concentrazione. È fondamentale confrontare i parametri strutturali chiave, tra cui il raggio di rotazione, la massa molecolare, lo scattering in avanti e le funzioni di distribuzione della distanza di coppia in una serie di concentrazioni.

E questo per garantire che non ci siano danni da radiazioni o effetti di concentrazione. Quindi, eseguire l'utilità del metodo di ottimizzazione dell'ensemble utilizzando il file iniziale della struttura cristallina della proteina, il file di sequenza della proteina target e il file di dati SAXS sperimentale. Confrontare i valori del chi quadrato dal file di struttura cristallina iniziale al file di ensemble per determinare se il modello di ensemble si adatta bene ai dati sperimentali.

Utilizzare il software di visualizzazione molecolare per sovrapporre la struttura cristallina con i conformeri generati. Notare il numero totale di conformeri e la frazione di occupazione per ciascun conformer che contribuisce alla curva di scattering. La scissione proteolitica della proteasi labile C terminale di Nsa1 ha portato alla formazione di cristalli ortorombici.

L'Nsa1 appena purificato ha formato cristalli cubici, ma la struttura cristallina mancava ancora di densità elettronica per il terminale c labile. Il dominio WD-40 dell'elica beta a sette blated n-terminale di Nsa1 era ben risolto in entrambe le strutture. Il dominio Nsa1 WD-40 da solo non era adatto per i dati sperimentali SAXS.

Una combinazione di modellazione a corpo rigido e ricostruzione abiniziale del capolinea C ha migliorato significativamente la bontà dell'adattamento. La modellazione d'insieme ha fornito un miglioramento ancora maggiore nella bontà dell'adattamento, rivelando il campionamento confermativo della coda C-terminale in soluzione. Sebbene SAXS sia una tecnica strutturale a bassa risoluzione, si integra molto bene con gli studi strutturali ad alta risoluzione, come la cristallografia a raggi X.

In questo modo è possibile modellare regioni flessibili e disordinate. Raccogliendo e analizzando i dati SAXS della macromolecola, puoi iniziare a capire il cambiamento di conferma che si è verificato dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come risolvere la struttura di una proteina composta da regioni ordinate e disordinate sia mediante cristallografia a raggi X che SAXS.