Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare i metaboliti in cellule vive di embrioni in via di sviluppo mediante microcampionamento in situ, elettroforesi capillare-spettrometria di massa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo perché consente l'analisi del metabolismo in singole cellule direttamente in embrioni vivi in via di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, scalabile a diverse dimensioni cellulari e consente un campionamento minimamente invasivo di singole cellule in embrioni vivi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto alcuni passaggi sono difficili da imparare perché l'embrione si sviluppa relativamente velocemente e viene utilizzato uno strumento di ionizzazione elettrospray per elettroforesi capillare costruito su misura. Iniziare questa procedura con la preparazione del 2% di agarosio in una soluzione di 1X Steinberg. Mentre è ancora liquido, rivestire il fondo di piastre di Petri da 60 millimetri con la soluzione.

Una volta che il gel di agarosio si è raffreddato e solidificato, fiammeggiare l'estremità di una pipetta Pasteur da sei pollici fino a formare una palla. Quindi, toccare leggermente l'estremità riscaldata per imprimere da cinque a 10 pozzetti a circa un millimetro di profondità nell'agarosio. Per fabbricare micropipette con punta conica, in primo luogo, estrarre i capillari borosilicati in un estrattore capillare di tipo Flaming/Brown utilizzando le impostazioni riportate nel protocollo di testo.

Quindi, rompere la punta della micropipetta estratta utilizzando un paio di pinze affilate fini per ottenere un diametro esterno della punta capillare di circa 20 micron. Eseguire questo passaggio sotto uno stereomicroscopio per favorire la precisione e la riproducibilità. Ottenere embrioni attraverso l'accoppiamento naturale indotto da gonadotropine di xenopus laevis adulto o tramite fecondazione in vitro come indicato nel protocollo di testo.

Rimuovere i rivestimenti gelatinosi che circondano gli embrioni quando iniziano a legarsi allo stadio a due cellule, lasciando prima riposare gli embrioni nella soluzione di degelizzazione per due minuti. Quindi, farli roteare delicatamente per altri due minuti per evitare che gli embrioni aderiscano alla superficie del piatto di raccolta. Versare delicatamente il contenuto del piatto in un bicchiere pulito e decantare rapidamente la soluzione degelante dal bicchiere.

Coprire immediatamente le uova con la soluzione di Steinberg 0,1X per risciacquare la soluzione degelante rimanente. Agitare delicatamente e poi decantare la soluzione. Ripeti questo passaggio quattro volte per lavare accuratamente gli embrioni.

Trasferire gli embrioni degelatinati nella soluzione di 1X Steinberg in una capsula di Petri. Per ridurre al minimo l'affollamento all'interno delle piastre, posizionare circa 100 embrioni per piatto da 100 millimetri. Ordina gli embrioni scissioni allo stadio di due cellule in un piatto separato in cui la pigmentazione stereotipata segna con sicurezza l'accesso ventrale dorsale con riferimento per stabilire mappe solfato.

Identificare correttamente gli embrioni scissioni assicurandosi che il primo solco di scissione, che delimita il piano sagittale medio, divida in due l'attrazione animale pigmentata scura e l'attrazione animale leggermente pigmentata in modo tale che le due metà siano immagini speculari. Successivamente, montare una micropipetta fabbricata su un micromanipolatore multiasse. Collegare la micropipetta a un microiniettore.

Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per aspirare circa cinque degli embrioni di otto cellule e trasferirli nel piatto di campionamento contenente la soluzione di Steinberg 0,5X. Utilizzando un anello per capelli, posizionare l'embrione da campionare in un pozzetto individuale e assicurarsi che la cellula di interesse correttamente identificata sia rivolta verso la microsonda con un angolo approssimativo di 90 gradi. Mentre si lavora sotto lo stereomicroscopio, guidare la punta della micropipetta nella singola cellula identificata all'interno dell'embrione vivo.

Prelevare una porzione desiderata del contenuto della cellula applicando impulsi di pressione negativa al microcapillare utilizzando il microiniettore. Ritrarre delicatamente la microsonda dalla cellula e trasferire la punta in quattro microlitri di solvente per l'estrazione del metabolita raffreddato in una fiala di dimensioni ridotte. Successivamente, applicare un picco di pressione di 80 psi positivi per un secondo al capillare utilizzando il microiniettore per espellere l'aspirato nel solvente.

Chiudere ermeticamente la fiala per evitare l'evaporazione e riposizionare la fiala sul ghiaccio fino al completamento del campionamento. Una volta completato il campionamento, mescolare a vortice il campione contenente le fiale di microcentrifuga per circa un minuto per accelerare l'estrazione dei metaboliti. Quindi, centrifugare le fiale a 8.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare detriti cellulari e altri particolati.

Conservare gli estratti cellulari insieme ai detriti cellulari e precipitare a meno 20 gradi Celsius per un giorno o a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un mese fino alla misurazione da parte di CE-ESI-MS. Costruire la piattaforma di iniezione CE in grado di traslare rapidamente in verticale uno stadio che contiene la fiala di elettrolita di fondo e la microfiala di caricamento del campione come indicato nel protocollo di testo. Assemblare l'interfaccia CE-ESI montando prima l'emettitore metallico elettrospray in un raccordo a T a tre porte.

Quindi, alimentare il capillare CE di separazione attraverso l'emettitore dell'elettrospray, permettendogli di sporgere di circa 40-100 micron oltre la punta dell'emettitore. Lavora sotto uno stereomicroscopio per migliorare la precisione. Collegare il capillare della soluzione in fogli alla porta rimanente per fornire la soluzione elettrospray.

Utilizzare manicotti appropriati e collegamenti serrati a mano per un funzionamento senza perdite dell'interfaccia CE-ESI. Utilizzando un portapiastra, montare l'interfaccia CE-ESI su uno stadio di traslazione a tre assi e posizionare la punta dell'emettitore di elettrospray a circa due millimetri dall'orifizio dello spettrometro di massa. Per pulire i componenti dell'interfaccia, fornire prima la soluzione di foglio elettrospray attraverso l'emettitore elettrospray a un microlitro al minuto e il BGE attraverso il capillare di separazione CE.

Utilizzare pompe a siringa per alimentare i solventi a una velocità costante. Quindi, lavare il capillare di separazione CE prima di ogni misurazione collegando una siringa all'estremità di ingresso del capillare. Utilizzare in modo efficiente siringhe di grandi dimensioni per ridurre al minimo il riempimento e l'adescamento delle linee di alimentazione del solvente.

Dopo aver risciacquato il capillare di separazione per circa cinque minuti, trasferirne l'ingresso nella soluzione BGE situata nella fiala di acciaio inossidabile. Posizionare la punta dell'emettitore dell'elettrospray a circa due millimetri dall'orifizio dello spettrometro di massa. Regolare con precisione questa distanza utilizzando uno stadio di traslazione per generare elettrospray nel regime stabile del getto a cono mentre si monitora lo spruzzo utilizzando uno stereomicroscopio.

Monitorare la stabilità della corrente ionica totale o TIC per circa 30-45 minuti per garantire un funzionamento stabile. Applicare 21 kilovolt più o meno due kilovolt alla fiala di BGE aumentando gradualmente il potenziale in circa 15 secondi, generando in genere circa 7,5 microampere di corrente attraverso il capillare di separazione utilizzando l'1% per cento di acido formico come BGE. Prima di ogni misurazione, garantire la stabilità del sistema monitorando il profilo TIC per circa 5-10 minuti, quindi ridurre gradualmente il potenziale di separazione a zero volt.

Pipettare un microlitro della soluzione standard di raffreddamento dell'acetil nel flaconcino per iniezione e trasferire il capillare di separazione dal flaconcino BGE nel flaconcino per iniezione. Sollevare lo stadio di iniezione CE di 15 centimetri in un secondo. Dopo 60 secondi, iniettare idrodinamicamente sei nanolitri di campione nel capillare di separazione.

Successivamente, traslare lo stadio ai livelli iniziali e spostare delicatamente l'estremità di ingresso del capillare nel BGE. Subito dopo, aumentare la tensione CE per avviare la separazione elettroforetica e l'acquisizione dello stato EMA. Una volta rilevato lo standard, interrompere l'acquisizione dei dati e abbassare la tensione di separazione gradualmente a zero volt.

Quindi, recuperare l'emettitore a due centimetri dall'orifizio. Sciacquare il capillare di separazione per cinque minuti prima di analizzare l'estratto cellulare. Misurare 10 nanolitri dell'estratto di una singola cellula ripetendo questi passaggi utilizzando 90 secondi per iniettare idrodinamicamente il campione.

Qui viene mostrato un elettroferogramma rappresentativo dell'estratto cellulare, in cui viene mostrata la separazione di una serie di metaboliti identificati. 70 diversi segnali sono stati identificati con elevata confidenza come piccoli metaboliti polari in base al tempo di migrazione e ai modelli di frammentazione MS/MS dei segnali dell'estratto cellulare rispetto a quelli provenienti da librerie spettrali di massa standard o tandem. L'identificazione dei metaboliti viene condotta confrontando la massa accurata, il tempo di migrazione e il comportamento di frammentazione del segnale sconosciuto dal campione con lo standard dei metaboliti o i dati disponibili in un database di metaboliti.

Questo passaggio è dimostrato per l'istidina. Qui, le singole cellule dorsali che sono state identificate e campionate utilizzando la microsonda CE-ESI-MS sono mostrate negli stadi embrionali di otto, 16 e 32 cellule. L'analisi multivariata dei metaboliti identificati nei tre diversi tipi di cellule ha rivelato diversi profili metabolici e tendenze metaboliche complesse tra gli stadi cellulari.

L'analisi delle componenti principali dei metadati quantitativi ha rivelato cambiamenti metabolici come cellula progenitrice identificata dell'embrione di otto cellule diviso per formare un clone cellulare nell'embrione di 16 e 32 cellule. Le tendenze rappresentative sono mostrate per metaboliti selezionati. Metaboliti come l'acetilcolina diminuivano in abbondanza con la divisione cellulare, mentre la trolamina e la serina/arginina mostravano tendenze opposte in questi tipi di cellule.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita molto velocemente, di solito in meno di 10 secondi per ogni cella. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato la mappatura dell'eterogeneità delle cellule metaboliche nell'embrione precoce di xenopus laevis. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'elettroforesi capillare con microsonda-spettrometria di massa per analizzare i metaboliti in singole cellule embrionali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare velocemente poiché il metaboloma è dinamico e le cellule si dividono rapidamente nell'embrione in via di sviluppo. Inoltre, esaminare i dettagli analitici per garantire che vengano raccolti dati di alta fedeltà qualitativa sul metabolismo cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di campioni vivi perché il nostro approccio di spettrometria di massa con microsonda funziona rapidamente, è minimamente invasivo e compatibile con piccoli campioni.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il monitoraggio dei solfati per rispondere a ulteriori domande come l'impatto dei metaboliti sulla specifica dei tessuti. Non dimenticare che lavorare con alimentatori ad alta tensione può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'isolamento elettrico delle interfacce elettrificate.