Name: Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Scopri la spettrometria di massa di elettroforesi capillare per analizzare metaboliti in singole cellule di embrioni vivi di Xenopus laevis. Questo metodo minimamente invasivo consente studi rapidi sul metabolismo durante lo sviluppo.

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Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute sovvenzioni GM114854 (a P.N.) e CA211635 (a P.N.), Arnold e Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator concedere (a P.N.), il premio DuPont giovane professore (a P.N.), la società americana per la massa Premio ricerca spettrometria (a P.N.) e COSMOS Club Fondazione borse di studio (per R.M.O. ed E.P.P). Le opinioni e conclusioni espresse in questa pubblicazione sono unicamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale delle fonti di finanziamento.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

MicroProbe CE-ESI-MS consente la caratterizzazione diretta dei metaboliti in singole cellule in vivo, liberamente lo sviluppo di embrioni. Nel cuore dell'approccio sono due tecniche sottocomponenti, vale a dire in situ capillare microcampionamento e ad alta sensibilità CE-ESI-MS. rispetto alla dissezione di cellule intere, Microcampionamento capillare ha il vantaggio di funzionamento veloce (pochi secondi vs 5 min / cella di dissezione), compatibilità con la complessa morfologia tridimensionale di embrioni e sca...

Una comprensione globale dello sviluppo embrionale richiede la caratterizzazione di tutti i cambiamenti molecolari che si dipanano in ogni cellula dell'organismo in via di sviluppo. Mentre la Next-Generation Sequencing con amplificazione molecolare permette profonda misura di singola cellula trascrittomi1 in sviluppo sistemi2,3, considerevolmente di meno è conosciuto circa la suite di molecole più piccole prodotta in singole cellule embrionali, tra cui proteine e, soprattutto, metaboliti (massa molecolare &#60; Da ~ 1.500). Con una risposta veloce e dinamica agli eventi intrinseci ed estrinseci, il metaboloma serve come un potente descrittore dello stato molecolare di una cella. Il metaboloma unicellulare, pertanto, aumenta il potenziale di seguire l'evoluzione spaziale e temporale delle eterogeneità cellulare nell'embrione precoce e di identificare nuove molecole per studi funzionali. Tuttavia, senza amplificazione molecolare disponibile per queste molecole, rilevamento del metaboloma esige sensibilità eccezionale utilizzando la spettrometria di massa (MS), che è la tecnologia scelta per analisi del metabolita.
Cella singola MS è un insieme di tecnologie con sufficiente sensibilità per misurare i metaboliti in singole cellule (Vedi recensioni 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Riproducibile campionamento delle cellule ed efficiente estrazione di metaboliti sono essenziali per l'individuazione dei metaboliti in singole cellule. La dissezione della intero-cellula delle cellule identificate da embrioni di Xenopus ha permesso la caratterizzazione di piccole molecole e peptidi16. Altri approcci utilizzano micropipette a campione singole celle dal vivo seguite da rilevamento tramite ionizzazione electrospray (ESI) MS. Ad esempio, i metaboliti sono stati misurati in pianta o cellule di mammifero di cella singola video MS17, pressione sonda18, singola sonda19e microscopia forza fluidico20, fra le altre tecniche21, 22,23,24. Inoltre, incorporazione di separazione chimica prima ionizzazione nel flusso di lavoro MS unicellulare semplifica in modo efficiente il metaboloma, attenuando le potenziali interferenze durante la generazione di ioni prima del rilevamento. D'importanza, separazione fornisce anche informazioni specifiche del composto per assistere in identificazioni molecolari. Elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per rilevare metaboliti nei neuroni2726 o microsampled singoli dissecata25,, acquisizione della piccolo-molecola differenze tra fenotipi del neurone. Abbiamo recentemente adattato CE a tandem ESI MS per abilitare il rilevamento del livello di traccia di centinaia di metaboliti in singole celle che sono stati sezionati da primi embrioni di Xenopus laevis16,28. Questi studi hanno rivelato sorprendenti differenze metaboliche tra cellule embrionali in una fase iniziale di sviluppo e ha portato alla scoperta di metaboliti con precedentemente sconosciuto inerente allo sviluppo impatti16.
Qui forniamo un protocollo che abilitato il rilevamento dei metaboliti in singole cellule direttamente in un embrione di vertebrati dal vivo usando della microsonda unicellulare CE-ESI-MS29,30. L'organismo di modello scelto è la 8-32-cellula dell'embrione X. laevis , anche se l'approccio è applicabile anche alle successive fasi di sviluppo e altri tipi di organismi modello. Questo protocollo utilizza capillari affilati con il controllo traduzionale multiasse sotto la Guida di un sistema di imaging ad alta risoluzione per aspirare un ~ 10 nL parte delle cellule identificate in situ nell'embrione di sviluppo morfologicamente complessa. Questa microsonda è scalabile a celle più piccole e opera in pochi secondi, che è sufficientemente veloce per tenere traccia di stirpi delle cellule nell'embrione. Dopo l'estrazione polare o piccole molecole apolari, quali metaboliti e peptidi, dal campione prelevato in ~ 4-5 µ l di soluzione estrazione, un ~ 10 nL dell'estratto risultante viene analizzata in una piattaforma CE fuoriserie sillabata ad uno spettrometro di massa ESI. Costruzione e funzionamento della piattaforma CE-ESI-MS sfrutta i protocolli descritti altrove. 31 , 32 l'interfaccia CE-ESI co-axial è costruito come descritto altrove. 31 questa piattaforma è mantenuta in regime di spruzzatura getto a cono per raggiungere livello di traccia sensibilità con una capacità per quantificazione sopra una gamma dinamica (relativo28,29,30 Registro-ordine di 4-5 o assoluto16). La piattaforma di CE-ESI-MS offre un limite inferiore di 60-amol di rilevamento con 8% deviazione standard relativa (RSD) nella quantificazione sopra una gamma testata di 10 nM a 1 µM per piccole molecole16, che sono sufficienti per caratterizzare metaboliti endogeni in X. laevis cellule. Microprobed cellule continuano a dividersi il progredire dell'embrione attraverso sviluppo30, consentendo analisi temporalmente e spazialmente risolto del metabolismo cellulare. Infatti, la cella singola CE-ESI-MS può essere utilizzato per trovare differenze metaboliche tra cellule che occupano il dorso-ventrale16,29, animale-vegetale16e sinistra-destra28 assi dello sviluppo così come le cellule che formano il tessuto neurale fated lignaggio dorsale da una cellula progenitrice comune in X. laevis30. Oltre a una query su differenze metaboliche tra le singole celle embrionali nelle diverse fasi dello sviluppo dell' embrione X. laevis 30, prevediamo che i protocolli descritti qui sono applicabili a una vasta gamma di biomolecole e microsampled di cellule singole da diversi stadi di sviluppo embrionale, così come altri tipi di cellule e organismi modello. Inoltre, la microsonda potrebbe essere utilizzata per Microcampionamento, mentre un'altra piattaforma compatibile con minuscoli campioni potrebbe essere usata per separazione e/o caratterizzazione di biomolecole.

<table><tbody><tr><td>Reagenti per terreni di coltura embrionale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di calcio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cisteina</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Metabolita Solventi da estrazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Acqua (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Solventi e standard per CE-ESI-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua (grado LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di acetilcolina</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Configurazione di fabbricazione della microsonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estrattore Micropippette</td><td>Sutter Instrument Co.</td>Caglioni borosilicati <td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze affilate fini: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Resistente alla corrosione e autoclavabile.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Configurazione del campionamento della microsonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Stereomicroscopio TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Deve essere isolato dalle vibrazioni.</td></tr><tr><td>Illuminatore, ad es. Colli d'oca,</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr>, <tr><td>Microiniettore</td>, <td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr>, <tr><td>Pipette di trasferimento (plastica, monouso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M,</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri 60 mm e 80 mm</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur in vetro (borosilicato, monouso)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Configurazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore ad alta tensione</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>L'HVPS può essere controllato a distanza utilizzando un programma a bassa tensione generato da un personal computer. Attenzione: l'alta tensione presenta il rischio di scosse elettriche; Tutte le parti di collegamento devono essere messe a terra o accuratamente schermate per evitare l'esposizione accidentale degli utenti.</td></tr><tr><td>Pompe a siringa (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Stereomicroscopio in grado di ingrandire 4,5 volte, dotato di un illuminatore per monitorare la modalità di spruzzatura dell'interfaccia CE-ESI.</td></tr><tr><td>Stadio di traslazione XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>Stadio di traslazione XYZ</td><td>Costruito</td><td></td> su misura <td>Questa piattaforma è in grado di caricare quantità di nanolitri di campione nel capillare di separazione tramite iniezione idrodinamica e di fornire il BGE per CE. Entrambe le interfacce descritte in questo lavoro sono state in grado di iniettare 6&ndash; 10 nL di campione entro 1 minuto in un capillare di separazione da 1 m</td></tr><tr><td>Fiale per campioni in acciaio inossidabile</td><td>Fiala</td> BGE in acciaio inossidabile costruita su <td></td><td></td>misura</tr><tr><td></td><td>Capillare</td> in silice fusa su misura <td></td><td></td></tr><tr><td>(40 &micro; m/105 &micro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Tecnologie Polymicro</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>capillare in silice fusa (75 &; micro; m/360 &micro; m ID/OD; 100 cm)</td><td>Tecnologie Polymicro</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Emettitore in acciaio inox con punte smussate (130/260 &; micro; m ID/OD)</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>Per prestazioni migliori, tagliare al laser e lucidare con precisione la punta dell'emettitore.</td></tr><tr><td>Siringhe (a tenuta di gas): 500 - 1000 & micro; L</td><td>Hamilton Co.</td><td>Multimetro digitale 1750TTL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa ad alta risoluzione</td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>Spettrometro di massa tandem ad alta risoluzione dotato di un'interfaccia di pressione atmosferica configurata per ESI</td></tr><tr><td>Miscela di sintonizzazione per la calibrazione dello spettrometro di massa</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Analisi dei dati 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzatura ausiliaria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentratore a vuoto in grado di funzionare a 4&ndash; 10 gradi; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Microbilancia analitica (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore (-20 &deg; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore (-80 &deg; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore refrigerato</td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana live (xenopus laevis)

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

La quantificazione di piccole molecole in singole cellule genera nuove potenzialità per comprendere meglio i processi di base che sottendono lo sviluppo embrionale. Per abilitare unicellulare indagini direttamente in embrioni dal vivo, nuovi approcci analitici sono necessari, specialmente quelli che sono sensibile, selettiva, quantitativa, robusta e scalabile per celle di diverse dimensioni. Qui, presentiamo un protocollo che consente l'analisi in situ di metabolismo in singole cellule liberamente lo sviluppo di embrioni di Rana artigliata dell'africano del Sud (Xenopus laevis), un potente modello in biologia cellulare e dello sviluppo. Questo approccio utilizza una microsonda capillare per aspirare una porzione definita da singole cellule identificate nell'embrione, lasciando le cellule vicine intatto per la successiva analisi. Il contenuto della cella raccolti è analizzato da un interfaccia su microscala elettroforesi capillare electrospray ionizzazione (CE-ESI) accoppiato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione tandem. Questo approccio è scalabile a vari formati di cella e compatibile con la struttura tridimensionale complessa dell'embrione in via di sviluppo. Ad esempio, dimostriamo che microsonda che unicellulare CE-ESI-MS consente la delucidazione di eterogeneità metabolica delle cellule che si dispiega come una cellula del progenitor dà luogo a discendenti durante lo sviluppo dell'embrione. Oltre a cellulare e biologia dello sviluppo, i protocolli di analisi unicellulare descritti qui sono suscettibili di altre celle di dimensioni, tipi cellulari o modelli animali.

Abbiamo recentemente impiegato della microsonda unicellulare CE-ESI-MS per la caratterizzazione di metaboliti in singole cellule identificate nello sviluppo liberamente di Xenopus laevis embrioni29,30. La microsonda consente il veloce (~ 5 sec/cell), in situ aspirazione di ~ 10 nL da una singola cella, le aspirazioni multiple della stessa cella o più celle diverse entro la stesse o versioni successive fasi dello ...

Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l'invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare i metaboliti in cellule vive di embrioni in via di sviluppo mediante microcampionamento in situ, elettroforesi capillare-spettrometria di massa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo perché consente l'analisi del metabolismo in singole cellule direttamente in embrioni vivi in via di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, scalabile a diverse dimensioni cellulari e consente un campionamento minimamente invasivo di singole cellule in embrioni vivi.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto alcuni passaggi sono difficili da imparare perché l'embrione si sviluppa relativamente velocemente e viene utilizzato uno strumento di ionizzazione elettrospray per elettroforesi capillare costruito su misura. Iniziare questa procedura con la preparazione del 2% di agarosio in una soluzione di 1X Steinberg. Mentre è ancora liquido, rivestire il fondo di piastre di Petri da 60 millimetri con la soluzione.Una volta che il gel di agarosio si è raffreddato e solidificato, fiammeggiare l'estremità di una pipetta Past

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Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Qui, presentiamo i protocolli per eseguire sia l'imaging con spettrometria di massa ambientale (MSI) dei tessuti che l'analisi in situ di MS a singola cellula viva (SCMS) utilizzando la sonda singola, che è un dispositivo multifunzionale miniaturizzato per l'analisi MS.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

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Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

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In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

Scopri la spettrometria di massa di elettroforesi capillare per analizzare metaboliti in singole cellule di embrioni vivi di Xenopus laevis. Questo metodo minimamente invasivo consente studi rapidi sul metabolismo durante lo sviluppo.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis) (Video) | JoVE Journal

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

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