Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

L'obiettivo generale di questa tecnica è automatizzare le noiose misurazioni manuali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo criptococcico, come la relazione tra le dimensioni della capsula o del corpo cellulare e i diversi aspetti della virulenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi di enormi volumi di campione senza affaticamento.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della criptococcosi, perché le dimensioni della capsula e del corpo cellulare sono aspetti importanti del patogeno. Per preparare un vetrino a china china, iniziare pipettando 10 microlitri di campione di criptococcico su un vetrino. Qualsiasi ceppo yi circolare funziona, ma per questo esperimento, H99 è stato l'unico ceppo utilizzato.

Pipettare due microlitri di macchia di inchiostro di china sul campione e mescolarla spingendo fisicamente la punta della pipetta nel campione e muovendosi con un movimento circolare fino a quando l'inchiostro di china non appare distribuito uniformemente. Posizionare un vetrino coprioggetti sul campione tenendo premuto il bordo sinistro del vetrino coprioggetti contro la superficie del vetrino. Quindi, abbassare delicatamente e uniformemente il lato opposto del vetrino coprioggetti sul campione.

Lasciare asciugare il vetrino all'aria per cinque minuti. Quindi, applicare un leggero strato di smalto sul bordo del vetrino coprioggetto per formare un sigillo e preservare la macchia di inchiostro di china. Per visualizzare i campioni, posizionare un vetrino sotto un microscopio a campo chiaro con l'attacco della fotocamera e la conversione nota da pixel a micron.

Regola i filtri, gli obiettivi e i contrasti e assicurati che il campo visivo sia denso, ma non sovrappopolato, con cellule criptococciche con un chiaro contrasto tra la capsula cellulare e lo sfondo e correttamente focalizzato con il corpo cellulare visualizzato come una banda scura. Dopo aver scattato le immagini, salvarle in un'unica directory con titoli chiari, poiché l'algoritmo di misurazione verrà eseguito sulle immagini in un'unica directory e i dati di output saranno organizzati in base ai nomi dei file immagine. Dopo aver impostato l'algoritmo secondo il protocollo di testo, eseguire l'applicazione facendo doppio clic su QCA.py.

Seguendo i passaggi descritti nel programma, inserire il tipo di estensione dei file immagine, preceduti da un punto e separati da punto e virgola. Quindi, fai clic sul pulsante Invio. Scegli la directory in cui si trovano i file immagine facendo clic sul pulsante Seleziona directory e seleziona la cartella che contiene le immagini.

Generare l'elenco dei file immagine nella directory facendo clic sul pulsante Genera elenco immagini. Le immagini verranno elencate nella casella di testo a destra. Rivedi e assicurati che l'elenco sia accurato e completo.

Quindi, seleziona un'immagine casuale dall'elenco da utilizzare come anteprima facendo clic sul pulsante Seleziona immagine casuale. Quindi, inserire l'obiettivo del microscopio e le impostazioni di binning. Se le impostazioni predefinite non corrispondono al microscopio utilizzato, selezionare Conversione pixel personalizzata e inserire la conversione da pixel a micrometro per i file di immagine.

Una volta selezionato, fai clic sul pulsante Calcola conversione e assicurati che la conversione sia corretta in base alla casella di testo a destra. Per inserire i parametri dell'algoritmo per il rilevamento del cerchio, inserire il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento della capsula esterna, come le voci del raggio minimo e massimo della capsula. Quindi, inserire il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento del corpo cellulare come voci del raggio minimo e massimo del corpo della cella.

Ora, sposta i cursori di sensibilità della capsula e del corpo cellulare per regolare la soglia di sensibilità dell'algoritmo. Una sensibilità bassa sarà rigorosa e ridurrà il rilevamento dei cerchi falsi positivi, ma potrebbe anche rilevare meno cerchi reali. Al contrario, un'elevata sensibilità aumenterà il tasso di rilevamento, ma potrebbe anche causare falsi cerchi positivi.

Massimizza il numero di corpi e capsule rilevati e ispeziona visivamente se i cerchi sembrano adattarsi correttamente. Il numero di corpi all'interno delle capsule rilevate verrà visualizzato nella casella di testo a destra. In caso contrario, manipolare i parametri dell'algoritmo fino a quando i risultati non sono accurati.

Eseguire l'algoritmo di rilevamento sull'intera directory dei file di immagine facendo clic sul pulsante Inizia analisi. Ogni immagine verrà analizzata e il programma visualizzerà Finito nella casella di testo a destra quando tutte le immagini sono state analizzate. Quindi, fai clic sul pulsante Corrispondenza e pulizia.

Questo abbinerà i corpi cellulari rilevati alle capsule rilevate in cui risiedono e calcolerà il vero raggio della capsula sottraendo il corpo dalla capsula. Nella directory dell'immagine individuare i dati completati in CleanedOutput. file csv.

Se è stato selezionato un solo dato, il file verrà etichettato CleanedBodies. csv o CleanedCapsules.csv. Come si vede qui in questa immagine microscopica di un vetrino a china china, le cellule sono separate e in densità sufficientemente bassa da non sovraccaricare il campo visivo.

È stata utilizzata anche una quantità sufficiente di macchia per creare contrasto tra le cellule e lo sfondo. L'algoritmo determina una soglia univoca per ogni immagine prendendo il valore medio di intensità e aggiungendo la deviazione standard. Le intensità dei pixel con un'intensità superiore alla soglia sono considerate bianche e con un'intensità inferiore sono considerate nere.

Il corpo cellulare deve essere visualizzato come un robusto cerchio nero sullo sfondo bianco della capsula. Il miglior piano focale da utilizzare è quello in cui il corpo cellulare appare come una banda scura e concentrata. Questo piano focale è accettabile come standard, perché mette a fuoco correttamente la cella.

Questo è stato confermato visualizzando la parete cellulare con UVITEX, una sorta di macchia che chiaramente una parete cellulare nitida e focalizzata con un segnale debole al centro. Quando il protocollo viene seguito accuratamente e si ottengono immagini ottimali, l'algoritmo è accurato e affidabile. Tuttavia, se il protocollo viene seguito in modo errato e si ottengono immagini non ottimali a causa di scarsa colorazione, sovraffollamento o altri parametri precedentemente menzionati, l'algoritmo perde precisione e non può ricapitolare le misurazioni umane.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 10 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di acquisire in anticipo un'idea dell'acquisizione di immagini ottimali, in modo da essere preparati quando si acquisiscono campioni reali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca criptococcica per esplorare le dimensioni delle capsule e del corpo cellulare in qualsiasi sistema di imaging in cui le due sono chiaramente visualizzate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le capsule criptococciche e i corpi cellulari. Non dimenticare che lavorare con il criptococco può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la sicurezza di base BSL2.