Name: Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Impara a misurare la permeabilità della barriera epiteliale in organoidi intestinali umani in tempo reale mediante microiniezione di FITC-dextran e microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di visualizzare e quantificare gli effetti di tossine e trattamenti farmacologici sulla funzione epiteliale.

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Gli autori vorrei ringraziare d. ssa Stephanie Spohn e Abuaita di Basilea per molte discussioni utili su organoid microiniezione. Il JRS è supportato dal Consorzio intestinale delle cellule staminali (U01DK103141), un progetto di ricerca collaborativo finanziato dal National Institute of Diabetes e digestivo e malattie renali (NIDDK) e National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). Il JRS e VBY sono supportati dal romanzo NIAID, alternativa sistemi modello per Consorzio malattie enteriche (NAMSED) (U19AI116482). DRH è supportata la concessione di formazione meccanismi di patogenesi microbica dall'Istituto nazionale dell'allergia e malattie infettive (NIAID, T32AI007528) e il premio scienza traslazionale e clinici all'Istituto Michigan clinica e salute Ricerca (UL1TR000433).
I file di dati completi e il codice di analisi dei dati utilizzati in questo manoscritto sono disponibili presso https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

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Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse di rivelare.

Questo protocollo stabilisce un metodo generico per il microinjection di HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato organoids intestinale e la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale. Inoltre abbiamo dimostrato il nostro approccio all'analisi e interpretazione dei dati ottenuti con questi metodi. Dato il crescente adozione dei organoids intestinale sistemi modello16,20,21,28 e l'interesse di lunga data nella permeabilità della barriera intestinale come un fisiologicamente rilevanti funzionale risultato3,4,5,6, ci aspettiamo che gli altri che lavorano in questo campo sarà in grado di applicare e costruire su questi metodi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per l'applicazione di questa tecnica. Accesso a alta qualità hPSC - o tessuto derivata HIO tessuto dovrebbe essere stabilita prima sperimentazione estesa con microiniezione. HIO macrostruttura può essere eterogenea, con variazione di dimensioni e la forma, anche se identità del tessuto e la morfologia cellulare è altamente riproducibile quando si utilizza una metodologia consolidata per generare HIOs24. HIOs sferico costituito da un singolo lume semi-trasparente e misura circa 1 mm di diametro sono ideali per microiniezione e misura della fluorescenza luminal in tempo reale. In alcuni casi, microinjection avrà esito negativo, con conseguente crollo dell'HIO o evidenti perdite di materiale iniettato. HIOs fallito può essere rimosso dalla cultura bene a discrezione dell'utente utilizzando una micropipetta standard. Considerare le lenti dell'obiettivo su una piattaforma di imaging disponibili quando si seleziona HIOs microiniezione e imaging. In generale, 2-4 X lenti dell'obiettivo sono ideali per catturare il segnale fluorescente HIO completo, anche può essere usato un obiettivo 10x se lenti a bassa potenza non sono disponibili o se il HIOs disponibili sono &#60; 1 mm di diametro. Software di imaging dovrà consentire l'acquisizione automatizzata delle immagini fluorescenti in punti definiti nel corso del tempo.
Diverse modifiche del presente protocollo sono possibili al fine di soddisfare le esigenze sperimentali. Ad esempio, i risultati dei test di funzione di barriera possono essere dipendenti dal formato molecolare dei composti in uso43 e potrebbe essere appropriato testare preparazioni di destrano di peso molecolare variabile. Inoltre, campo chiaro imaging può essere eseguito oltre a formazione immagine di fluorescenza come un indicatore dell'integrità strutturale complessiva del tessuto25. Quando si esegue la microiniezione di batteri vivi25,28,31,32,33,44, può essere necessario aggiungere penicillina e streptomicina o gentamicina per terreni di coltura HIO prima o dopo microiniezione. L'esterno del microcapillary sarà contaminato durante il riempimento con la sospensione di coltura batterica e questo può essere trasferito ai media HIO. In alternativa, microinjection può essere eseguita su HIOs sospese nella matrice extracellulare (ad es., Matrigel) senza supporto, aggiungendo il supporto una volta completata la microiniezione. Questo potrebbe limitare la contaminazione per la matrice extracellulare e la faccia esterna della HIO. Quando si pianificano i saggi di crescita microbica, può essere necessario rimuovere gli antibiotici nei media dopo 1-2 h per evitare di rallentare o prevenire la crescita di organismi iniettati.
Infine, riconoscendo che non tutti i ricercatori avranno accesso alla microscopia attrezzature adatte a imaging in vitro , è importante sottolineare che le procedure descritte in questo protocollo per la raccolta dati di fluorescenza possono essere applicate alle immagini scattate timepoints fisso usando la microscopia epifluorescente standard senza cattura immagine automatizzati o di controlli ambientali. Esempi di questo approccio possono essere trovati nelle relazioni di Leslie e Huang et al. 25, che ha esaminato attività di tossina di c. difficile in hPSC-derivati organoids intestinale e Karve e Liliane et al. 44, che ha esaminato la permeabilità della barriera epiteliale in simili organoids intestinale hPSC-derivato microiniettati con live e. coli. Manuale di apparecchiature di imaging può comportare una maggiore variazione e difficoltà a normalizzare il segnale fluorescente. Quando eseguire imaging manuale del FITC-Destrano iniettato HIOs è essenziale mantenere ingrandimento fisso, l'intensità di fluorescenza eccitazione e tempi di esposizione in tutto l'esperimento per evitare di falsare le misure di intensità di fluorescenza.

L'epitelio intestinale forma una barriera selettiva che media il trasporto direzionale di nutrienti, H2O, ioni e prodotti di scarto, riducendo al minimo scambio di diffusione-mediata non specifico di altre particelle tra il lume e la mesenchimali del tessuto o sangue alimentazione1,2. La permeabilità non specifica della barriera epiteliale intestinale lungamente è stata considerata un parametro funzionale chiave sia in salute e in malattia3,4,5,6, che riflette il tasso di diffusione di piccole molecole attraverso l'epitelio tramite lo spazio paracellulare. Misura della permeabilità della barriera epiteliale possa essere condotti in modelli animali7 e in pazienti umani8 attraverso l'ingestione di lattulosio, che non ha nessun trasportatore specifico nel tratto gastrointestinale e la successiva raccolta e la misurazione delle concentrazioni di lattulosio nel sangue periferico. Marcatori ingeriti alternativi della funzione di barriera come carboidrati fluorescente contrassegnati sono anche disponibili9,10. Questo approccio è stato adattato per intestinale delle cellule epiteliali colture cresciute su Transwell supporta11, un approccio semplificato che consente un maggiore controllo sperimentale, ma inoltre è stato criticato come un preannunciatore povero di in vivo permeabilità a causa dell'assenza di sottotipi epiteliali differenziate e tessuto struttura12. Utilizzando camere rappresentano ancora un altro approccio e consentire la misurazione della funzione di barriera epiteliale nella mucosa intestinale complesso ex vivo13. Applicazione di questa tecnica è spesso limitata dal tessuto disponibilità e condizione13,14. Sono quindi necessari nuovi metodi che equilibrano la riproducibilità e la velocità effettiva con rilevanza fisiologica.
Recenti sviluppi nell'organogenesi in vitro hanno portato all'adozione di sistemi di coltura del tessuto 3D modello come una sofisticata piattaforma per ricapitolare le dinamiche di tessuti complessi15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. In particolare, pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) derivata organoids intestinale umano (HIOs)19,24 sono emersi come sistema modello riproducibile e sperimentalmente trattabili per lo studio delle interazioni ospite-microbiche e barriera epiteliale dinamica25,26,27,28. Analogamente, organoids tessuto-derivato umano (noto anche come enteroids) può essere derivato da una procedura di biopsia semplice e può essere utilizzato come un sistema trattabile per studiare la fisiologia umana e malattia15,29,30. Microiniezione di organoids intestinale umana permette per la consegna di composti sperimentali25 o live microbi25,31,32,33 per l'apicale epiteliale superficie del lume organoid. Leslie e Huang et al. 25 recentemente adattato questa tecnica per misurare la permeabilità della barriera in HIOs microiniettati con isotiocianato di fluorescina (FITC) etichettato destrano dopo esposizione a tossine batteriche.
Questo protocollo è inteso come una guida per la misura della permeabilità della barriera epiteliale in HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato HIOs utilizzando la microscopia a fluorescenza. Con modifiche minori, può anche servire come un iniettore generale il microinjection di HIOs con composti sperimentali. Gli utenti possono integrare questo protocollo con applicazioni aggiuntive o alternative a valle dopo microiniezione.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M sterile (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di matrice cellulare (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT sistema di imaging di cellule vive</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Telecamera</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluso con il sistema Deltavision</td></tr><tr><td>software softWoRx Imaging</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Incluso con il sistema Deltavision</td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Componente dei setti filtranti ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Componente dei setti filtranti ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutammina (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Componente dei setti filtranti ENR; vedi McCraken et al. 24Buffer </td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Componente dei terreni ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipolatore</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Porta pipetta</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternativo al portapipette Xenoworks</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione</td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Cannocchiale consigliato, anche se altri modelli sono probabilmente compatibili</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Incluso con il sistema Deltavision</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometrico</td><td>29065728</td><td>Incluso con il sistema Deltavision</td></tr><tr><td>Ricombinante C. difficile Proteina Tossina A/TcdA R</td><td>& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>Componente del media ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Componente del supporto ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Componente dei terreni ENR; vedi McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Filamenti di vetro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Porta micropipette</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Dispositivo preferito</td></tr><tr><td>Kit di tubi analogici</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 in ghiera trasparente</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm O-ring</td><td></td><td>Xenoworks V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in organoids intestinale umana

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Progressi nella cultura 3D dei tessuti intestinali ottenuti mediante biopsia o generate da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretto, hanno portato nei modelli sofisticati in vitro della mucosa intestinale. Sfruttando questi sistemi modello emergenti richiedono adattamento di strumenti e tecniche sviluppate per gli animali e sistemi di coltura 2D. Qui, descriviamo una tecnica per misurare la permeabilità della barriera epiteliale in organoids intestinale umana in tempo reale. Ciò avviene mediante microiniezione di destrano fluorescente etichettati e imaging su un microscopio invertito con filtri epifluorescente. Misura in tempo reale della permeabilità della barriera in organoids intestinale facilita la generazione di dati ad alta risoluzione temporale in tessuto epiteliale intestinale umano, anche se questa tecnica può essere applicata anche al timepoint fisso approcci di imaging. Questo protocollo è facilmente adattabile per la misura della permeabilità di barriera epiteliale dopo l'esposizione ad agenti farmacologici, prodotti batterici o tossine o microrganismi vivi. Con modifiche minori, il presente protocollo può anche servire come un iniettore generale il microinjection dei organoids intestinale e gli utenti possono decidere di integrare questo protocollo con applicazioni a valle aggiuntive o alternative dopo microiniezione.

HIOs sono stati differenziati da cellule staminali pluripotenti umane e coltivate in soluzione a matrice cellulare come in precedenza descritto19,24. Dopo 4 settimane nella cultura, il HIOs aveva ampliato sufficientemente per consentire per il microinjection. HIOs erano microiniettati con 4 kDa coniugato FITC Destrano sospese in PBS o PBS contenente la tossina di Clostridium difficile TcdA. C. difficile è un agente patogeno opportunistico gastrointestinale che presenta tossicità epiteliale tossina-mediata in HIOs25. Come controllo positivo, EGTA è stato aggiunto al terreno di coltura HIO in un sottoinsieme di HIOs iniettato con PBS e FITC-Destrano. EGTA è un chelante del calcio che causa de-rapida polimerizzazione dell'actina citoscheletrica42. Fluorescenza FITC è stato monitorato in tempo reale su un microscopio di imaging dal vivo all'interno di una camera ambientale controllata e immagini sono state catturate in intervalli di 10 minuti.
Analisi post-hoc dei dati di imaging ha rivelato differenze sostanziali nella conservazione di fluorescenza FITC (Figura 5). HIOs iniettato con PBS conservato quasi tutto il segnale fluorescente presente a t = 0, tuttavia HIOs che inoltre sono stati iniettati con TcdA di trattati con EGTA ha esibito una sostanza diminuzione nell'intensità fluorescente dal post-microinjection 8 ore (Figura 5a). dati di formazione immagine sono stati quantificati per HIOs tutti tutti gli intervalli di tempo generare un dataset ad alta risoluzione che rappresenta la variazione relativa intensità fluorescente nel tempo in ogni condizione sperimentale (figura 5B). Differenze nella permeabilità epiteliale sono state valutate dal calcolo del tempo di media di eliminazione (t1/2 ) di FITC per ciascun gruppo di trattamento (tabella 1) e confrontare le differenze t t 1/2 tra gruppi utilizzo dello studente t-test. Controllo-trattati HIOs mantenuto la maggior parte del segnale fluorescente FITC per più di 16 ore (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Trattamento con EGTA riduce significativamente il tempo di eliminazione di FITC-Destrano relativo controllo HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Coerente con risultati precedentemente pubblicati25, microiniezione di TcdA significativamente aumentata permeabilità di barriera epiteliale rispetto al trattamento di controllo (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Così, sia esterni (EGTA) e iniettati (TcdA) composti sono in grado di indurre alterazioni significative nella permeabilità della barriera epiteliale in HIOs. Questi risultati indicano che gli effetti di una vasta gamma di agenti farmacologici, metaboliti, prodotti batterici, citochine, fattori di crescita e altri composti sulla funzione di barriera epiteliale possono essere valutati mediante questo approccio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trattamento</td>
			<td>Half-Life (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Abbassare CI di 95% (h)</td>
			<td>Superiore 95% IC (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controllo</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0.3</td>
			<td>16.45</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2.58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1.78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7,56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5,93</td>
			<td>9,18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: significa tempo di eliminazione (t1/2) per FITC-Destrano in HIOs trattati con EGTA o TcdA. Le unità sono post-microiniezione ore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figura 1: layout di base di un microinjector e micromanipolatore per il microinjection HIO. Questa immagine mostra il complemento completo delle attrezzature utilizzate per l'esecuzione di microiniezione di HIOs. Componenti chiave sono etichettati e informazioni sugli ordini possono essere trovati nella tabella materiali. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figura 2: estrattore micropipetta. Il rame riscaldamento bobina hc, morsetto superiore c1, morsetto inferiore (c2), braccio estrattore (pa), attiva/disattiva selezione di calore (ht) sono identificati dalle frecce. L'impostazione corretta di calore 1 e PULL sono indicate in rosso. L'inserto mostra un filamento di vetro correttamente montato pronto per il riscaldamento. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figura 3: immagini rappresentative di un tessuto-derivato HIO iniettato con FITC-Destrano. (A) immagine dimostrando il posizionamento della microcapillary vetro appena prima dell'inserimento nel HIO e microiniezione. (B) immagine di campo chiaro di un tessuto-derivato organoids intestinale umano dopo microiniezione di FITC-Destrano. Si noti che il segnale di fluorescenza è apparente anche senza l'uso di un set di filtri specifici. Questa colorazione favorisce la precisione di microiniezione. Ingrandimento 3x <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figura 4: Live imaging del flusso di lavoro. (A) schermata che illustra i passaggi necessari per impostare i parametri del microscopio, trovare il HIOs sulla diapositiva e salvare la posizione del palco per ogni HIO essere imaged. Le impostazioni di pre-imaging (B) per catturare il canale FITC a intervalli regolari presso ciascuna delle posizioni specificate in A. (C) Post-imaging esportazione di dati in formato DV file come immagini TIFF con un'immagine TIFF per HIO per punto di tempo.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figura 5: risultati rappresentativi. (A) cellule staminali derivate organoids intestinale umano (HIO) microiniettati con 2 mg/mL FITC-Destrano (4 kDa) ripreso per 20 ore. HIOs erano anche microiniettati con PBS (controllo) o la tossina del Clostridium difficile TcdA (12,8 ng / µ l) o trattati con 2 mM EGTA aggiunto ai terreni di coltura esterno. Ingrandimento 4x. (B) trama di media intensità FITC normalizzato nel tempo in HIOs trattati con PBS (controllo), TcdA o EGTA. Barre di errore rappresentano s.e.m. e n = 11 HIOs (controllo), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la permeabilità della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della gastroenterologia, come ad esempio come tossine specifiche, prodotti batterici o persino trattamenti farmacologici possono alterare la permeabilità della barriera epiteliale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente sia la visualizzazione che la misurazione quantitativa della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale e utilizzando il tessuto epiteliale intestinale umano.Prima di microiniettare organoidi intestinali umani, il microiniettore deve essere impostato e il microcapillare preparato, installato e testato come descritto nel protocollo di testo. Per riempire il microcapillare con il materiale di iniezione, immergere la punta del microcapillare di vetro nella sospensione per iniezione FITC-destrano, facendo attenzione a non rompere la punta del microcapillare contro il lato o il fondo del tubo. Tirare indietro la siringa di olio minerale per aspirare circa 10 microlitri della sospensione di FITC-destrano nel microcapillare.Quando la sospensione per microiniezione riempie il 90% della lunghezza del microcapillare di vetro, interrompere il riempimento del microcapillare. Premere leggermente la siringa prima di estrarre il microcapillare dalla soluzione di microiniezione per assicurarsi che la punta del microcapillare non contenga sacche d'aria. Rimuovere la piastra di coltura di organoidi intestinali umani dall'incubatore per colture cellulari e trasferirla nella cabina di biosicurezza con il microiniettore.Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura e centrare il primo pozzetto sul tavolino del microscopio in modo che sia chiaramente visibile attraverso l'oculare del cannocchiale con l'impostazione di ingrandimento più bassa. Ruotare il braccio del micromanipolatore in modo che il microcapillare sia puntato verso il basso nel pozzetto della coltura con un angolo maggiore di 45 gradi rispetto al tavolino del microscopio. Posizionare la punta del microcapillare sopra il pozzetto della prima coltura a circa un centimetro sopra la superficie del terreno.Verificare che sia la punta del filamento di vetro che l'organoide intestinale umano siano visibili attraverso l'oculare. La chiave per una microiniezione di successo è allineare attentamente il microcapillare con l'organoide prima di tentare la microiniezione. E consiglio sempre ai nuovi utenti di esercitarsi con il tessuto di riserva prima di tentare un esperimento critico.Ruotando la manopola di controllo dell'asse z in senso orario, far avanzare lentamente il microcapillare. Forare l'organoide intestinale umano con la punta microcapillare. La superficie esterna dell'organoide intestinale umano si deprime leggermente quando il microcapillare inizia ad applicare pressione e riprende la forma quando la punta penetra nel lume.In caso di difficoltà a vedere la punta del microcapillare all'interno del lume, regolare le impostazioni di illuminazione o ingrandimento del microscopio da dissezione. Quando il microcapillare è posizionato correttamente con la punta del microcapillare vicino al centro dell'organoide intestinale umano, rimuovere le mani dai controlli del micromanipolatore. Premere leggermente la siringa piena di olio minerale per spingere la soluzione di microiniezione fuori dal microcapillare e nel lume dell'organoide intestinale umano.L'organoide intestinale umano può espandersi leggermente per accogliere il volume dell'iniezione. Con il microcapillare posizionato sopra il terreno per evitare danni accidentali agli organoidi intestinali umani durante le manovre, passare al successivo bersaglio dell'organoide intestinale umano. Tra un trattamento e l'altro o in caso di rottura, cambiare il microcapillare.Allentare il morsetto all'estremità del braccio del micromanipolatore e rimuovere il microcapillare dal supporto della micropipetta. Per testare i composti somministrati all'epitelio apicale, il composto deve essere risospeso in PBS sterile contenente due milligrammi per millilitro di FITC-destrano. In questo esperimento rappresentativo, risospendere la tossina TcdA di Clostridium difficile, aggiungere 12,8 nanogrammi per microlitro in PBS contenente FITC-destrano prima della microiniezione.Microiniettare il composto nel lume dell'organoide intestinale umano come dimostrato nella sezione precedente. Per testare i composti somministrati al compartimento laterale basale, dopo la microiniezione di FITC-destrano, sostituire il terreno di coltura esterno con nuovi terreni contenenti due EGTA millimolari come controllo positivo, il solo veicolo PBS come controllo negativo o un altro composto sperimentale. Iniziare l'imaging dal vivo subito dopo la microiniezione.Questa immagine rappresentativa in campo chiaro mostra un organoide intestinale umano derivato da un tessuto dopo microiniezione di FITC-destrano. Il segnale fluorescente è evidente anche senza l'uso di un set di filtri specifico. Organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali sono stati microiniettati con destrano coniugato FITC da quattro kilodalton sospeso in PBS, o PBS contenente la tossina Clostridium difficile TcdA.Come controllo positivo, EGTA è stato aggiunto ai terreni di coltura di organoidi intestinali umani in un sottogruppo di organoidi intestinali umani iniettati con PBS e FITC-destrano. Gli organoidi intestinali umani sono stati sottoposti a imaging per 20 ore. Come illustrato da queste immagini, gli organoidi intestinali umani iniettati con PBS hanno mantenuto quasi tutto il segnale fluorescente presente a T zero.Tuttavia, gli organoidi intestinali umani che sono stati iniettati con TcdA, o trattati con EGTA, hanno mostrato una sostanziale diminuzione dell'intensità fluorescente entro otto ore dopo la microiniezione. I dati di imaging sono stati quantificati per tutti gli organoidi intestinali umani in tutti i punti temporali per generare un set di dati ad alta risoluzione che rappresenta la variazione relativa dell'intensità della fluorescenza nel tempo in ciascuna condizione sperimentale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti a un'ora, a seconda del numero di condizioni sperimentali.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti e prendersi il tempo necessario quando si allineano gli organoidi intestinali umani con i microcapillari prima della microiniezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR, il western blot e la ricerca dell'RNA per rispondere a ulteriori domande riguardanti la risposta dell'organoide intestinale umano al materiale iniettato. Lo sviluppo di questa tecnica ci ha permesso di esaminare gli effetti di tossine batteriche, agenti farmacologici, citochine e persino microrganismi vivi sulla funzione della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microiniettare destrano marcato in fluorescenza e altri materiali sperimentali nel lume di un organoide intestinale umano. Non dimenticare che quando si lavora con tossine batteriche o organismi vivi, può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di DPI appropriati durante l'esecuzione di questa procedura. Infine, prestare particolare attenzione a evitare ferite da puntura poiché i microcapillari sono estremamente affilati.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive l'uso di preparati di tessuto intestinale asportati o "sacche intestinali" come modello ex vivo della funzione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'integrità sia della barriera epiteliale che dello strato di gel mucoso in specifici siti intestinali in modelli animali di malattia digestiva.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

Qui descriviamo una tecnica per quantificare l'integrità della barriera di piccoli organoidi intestinali. Il fatto che il metodo si basi su organoidi viventi consente l'indagine sequenziale di diverse sostanze o combinazioni di integrità della barriera in modo risolto nel tempo.

Indagare la rottura della barriera intestinale negli organiidi viventi

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.

Test della permeabilità epiteliale negli enteroidi derivati dal tessuto fetale

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.

Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Il protocollo presentato in questo studio descrive metodi per il monitoraggio in tempo reale di progressione riprogrammazione tramite la misurazione cinetica dei marcatori di cellule staminali pluripotenti positivi e negativi usando analisi citofluorimetrica. Il protocollo include anche la valutazione di imaging basata su morfologia, e pennarello o espressione giornalista durante la generazione IPSC.

Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

Impara a misurare la permeabilità della barriera epiteliale in organoidi intestinali umani in tempo reale mediante microiniezione di FITC-dextran e microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di visualizzare e quantificare gli effetti di tossine e trattamenti farmacologici sulla funzione epiteliale.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

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