Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la permeabilità della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani nel tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della gastroenterologia, come ad esempio come tossine specifiche, prodotti batterici o persino trattamenti farmacologici possono alterare la permeabilità della barriera epiteliale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente sia la visualizzazione che la misurazione quantitativa della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale e utilizzando il tessuto epiteliale intestinale umano.

Prima di microiniettare organoidi intestinali umani, il microiniettore deve essere impostato e il microcapillare preparato, installato e testato come descritto nel protocollo di testo. Per riempire il microcapillare con il materiale di iniezione, immergere la punta del microcapillare di vetro nella sospensione per iniezione FITC-destrano, facendo attenzione a non rompere la punta del microcapillare contro il lato o il fondo del tubo. Tirare indietro la siringa di olio minerale per aspirare circa 10 microlitri della sospensione di FITC-destrano nel microcapillare.

Quando la sospensione per microiniezione riempie il 90% della lunghezza del microcapillare di vetro, interrompere il riempimento del microcapillare. Premere leggermente la siringa prima di estrarre il microcapillare dalla soluzione di microiniezione per assicurarsi che la punta del microcapillare non contenga sacche d'aria. Rimuovere la piastra di coltura di organoidi intestinali umani dall'incubatore per colture cellulari e trasferirla nella cabina di biosicurezza con il microiniettore.

Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura e centrare il primo pozzetto sul tavolino del microscopio in modo che sia chiaramente visibile attraverso l'oculare del cannocchiale con l'impostazione di ingrandimento più bassa. Ruotare il braccio del micromanipolatore in modo che il microcapillare sia puntato verso il basso nel pozzetto della coltura con un angolo maggiore di 45 gradi rispetto al tavolino del microscopio. Posizionare la punta del microcapillare sopra il pozzetto della prima coltura a circa un centimetro sopra la superficie del terreno.

Verificare che sia la punta del filamento di vetro che l'organoide intestinale umano siano visibili attraverso l'oculare. La chiave per una microiniezione di successo è allineare attentamente il microcapillare con l'organoide prima di tentare la microiniezione. E consiglio sempre ai nuovi utenti di esercitarsi con il tessuto di riserva prima di tentare un esperimento critico.

Ruotando la manopola di controllo dell'asse z in senso orario, far avanzare lentamente il microcapillare. Forare l'organoide intestinale umano con la punta microcapillare. La superficie esterna dell'organoide intestinale umano si deprime leggermente quando il microcapillare inizia ad applicare pressione e riprende la forma quando la punta penetra nel lume.

In caso di difficoltà a vedere la punta del microcapillare all'interno del lume, regolare le impostazioni di illuminazione o ingrandimento del microscopio da dissezione. Quando il microcapillare è posizionato correttamente con la punta del microcapillare vicino al centro dell'organoide intestinale umano, rimuovere le mani dai controlli del micromanipolatore. Premere leggermente la siringa piena di olio minerale per spingere la soluzione di microiniezione fuori dal microcapillare e nel lume dell'organoide intestinale umano.

L'organoide intestinale umano può espandersi leggermente per accogliere il volume dell'iniezione. Con il microcapillare posizionato sopra il terreno per evitare danni accidentali agli organoidi intestinali umani durante le manovre, passare al successivo bersaglio dell'organoide intestinale umano. Tra un trattamento e l'altro o in caso di rottura, cambiare il microcapillare.

Allentare il morsetto all'estremità del braccio del micromanipolatore e rimuovere il microcapillare dal supporto della micropipetta. Per testare i composti somministrati all'epitelio apicale, il composto deve essere risospeso in PBS sterile contenente due milligrammi per millilitro di FITC-destrano. In questo esperimento rappresentativo, risospendere la tossina TcdA di Clostridium difficile, aggiungere 12,8 nanogrammi per microlitro in PBS contenente FITC-destrano prima della microiniezione.

Microiniettare il composto nel lume dell'organoide intestinale umano come dimostrato nella sezione precedente. Per testare i composti somministrati al compartimento laterale basale, dopo la microiniezione di FITC-destrano, sostituire il terreno di coltura esterno con nuovi terreni contenenti due EGTA millimolari come controllo positivo, il solo veicolo PBS come controllo negativo o un altro composto sperimentale. Iniziare l'imaging dal vivo subito dopo la microiniezione.

Questa immagine rappresentativa in campo chiaro mostra un organoide intestinale umano derivato da un tessuto dopo microiniezione di FITC-destrano. Il segnale fluorescente è evidente anche senza l'uso di un set di filtri specifico. Organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali sono stati microiniettati con destrano coniugato FITC da quattro kilodalton sospeso in PBS, o PBS contenente la tossina Clostridium difficile TcdA.

Come controllo positivo, EGTA è stato aggiunto ai terreni di coltura di organoidi intestinali umani in un sottogruppo di organoidi intestinali umani iniettati con PBS e FITC-destrano. Gli organoidi intestinali umani sono stati sottoposti a imaging per 20 ore. Come illustrato da queste immagini, gli organoidi intestinali umani iniettati con PBS hanno mantenuto quasi tutto il segnale fluorescente presente a T zero.

Tuttavia, gli organoidi intestinali umani che sono stati iniettati con TcdA, o trattati con EGTA, hanno mostrato una sostanziale diminuzione dell'intensità fluorescente entro otto ore dopo la microiniezione. I dati di imaging sono stati quantificati per tutti gli organoidi intestinali umani in tutti i punti temporali per generare un set di dati ad alta risoluzione che rappresenta la variazione relativa dell'intensità della fluorescenza nel tempo in ciascuna condizione sperimentale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti a un'ora, a seconda del numero di condizioni sperimentali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti e prendersi il tempo necessario quando si allineano gli organoidi intestinali umani con i microcapillari prima della microiniezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR, il western blot e la ricerca dell'RNA per rispondere a ulteriori domande riguardanti la risposta dell'organoide intestinale umano al materiale iniettato. Lo sviluppo di questa tecnica ci ha permesso di esaminare gli effetti di tossine batteriche, agenti farmacologici, citochine e persino microrganismi vivi sulla funzione della barriera epiteliale negli organoidi intestinali umani.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microiniettare destrano marcato in fluorescenza e altri materiali sperimentali nel lume di un organoide intestinale umano. Non dimenticare che quando si lavora con tossine batteriche o organismi vivi, può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di DPI appropriati durante l'esecuzione di questa procedura. Infine, prestare particolare attenzione a evitare ferite da puntura poiché i microcapillari sono estremamente affilati.