Name: Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri la nanolitografia a sonda a scansione su ampia area per studiare le interazioni tra cellule staminali mesenchimali e superfici nanostrutturate. Questo metodo fornisce criteri fondamentali per la progettazione di biomateriali avanzati.

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Gli autori riconoscono sostegno finanziario da una varietà di fonti, tra cui l'ingegneria UK e Physical Sciences Research Council (concedere refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) e una borsa di studio laureato per JH; il Leverhulme Trust (RPG-2014-292); il fondo di sostegno istituzionale strategica del Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); il British Council (216196834); e anche l'Università di Manchester per un'Università di Manchester Research Institute (fondo di adescamento pompa UMRI) e una borsa di dottorato presidenziale per assistenza SW. tecnica di Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) si ringraziano.

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</ol>

L'algoritmo di allineamento e il software sono stati sviluppati da e sono di proprietà di, l'Università di Manchester. È disponibile per il download su http://www.click2go.umip.com/.

Questo protocollo serve per fornire agli utenti una metodologia conveniente effettuare rapidamente nanolitografiche patterning con elevata uniformità e dimensione caratteristica controllabile sopra grandi aree (cm2). Substrati cuscinetto questi nanopatterns di ampia area possono poi essere ulteriormente elaborati per una varietà di applicazioni. Una importante applicazione di questa tecnologia è la generazione di superfici nanofabbricate per studi di interazione della cellula-superficie. Questo rapporto mostra alcuni esempi illustrativi di coltura cellulare su questi materiali, dimostrando la controllo della morfologia hMSC nanofabbricate substrati.
Il fattore chiave di questo protocollo è l'automazione della procedura di allineamento (passaggio 4) che permette la produzione altamente uniforme e di alto-rendimento delle caratteristiche su superfici, fino a risoluzione nanometrica, che consente la rapida rotazione di esperimenti della coltura cellulare. La litografia di penna di polimero effettuata utilizzando questo algoritmo di allineamento è in grado di generare caratteristiche su nanoscala entro circa 30 min. La riproducibilità e la precisione di allineamento automatico e quindi l'uniformità delle feature, è tuttavia criticamente dipendente sulla qualità delle matrici sonda che vengono prodotte (fase 1 e 2). Eventuali difetti nella loro preparazione che si traducono in sonde smussate, rotte o mancante; come aria intrappolata bolle (passo 1.5) o impropria separazione delle sonde dal master (passo 1,8) può provocare allineamento impreciso e Litografia di scarsa qualità.
Questo segnalato metodo condivide una limitazione in comune con altri metodi di allineamento che si basano sul feedback di forza. La determinazione accurata di quando le sonde sono a contatto con la superficie è vincolata dalla necessità di contabilizzare le vibrazioni di fondo causate dall'ambiente circostante e il movimento della fase del campione. In generale, i sensori hanno una sensibilità di forza in regime di µN (2 µN in questo caso), ma l'algoritmo di allineamento è progettato per registrare solo una forza di almeno 490 µN come definitivo contatto tra le sonde e la superficie, al fine di evitare qualsiasi resul 'falsi positivi' Ting, rumore di fondo. 13 in tal senso, questo metodo tende a produrre grandi caratteristiche (1-2 µm) poiché le sonde devono esteso a grande distanza sul z-asse (con una conseguente maggiore forza) al fine di registrare contatto. Al fine di compensare, caratteristiche minori possono essere generati riducendo l' z-asse distanza percorsa durante il passaggio di Litografia (ad es., entrando l'impostazione 'Nero' al punto 5.2.3.2 come µm 3 invece di 5 µm).
Tuttavia, anche con questa limitazione, l'algoritmo di automazione è in grado di affrontare un aspetto critico nell'applicazione parallelizzata metodi di scansione sonda Litografia, come allineamento era precedentemente più esigenti e imprecisa passo temporale nella implementazione di queste tecniche. Questa automazione ora sposta la tappa limitante del processo di fabbricazione dall'allineamento verso la scrittura litografica stessa. Mentre questo protocollo dimostra l'applicazione di questa procedura di allineamento per PPL, il quadro potrebbe essere applicato a una serie di tecniche SPL come lipido-DPN26 e tabella-aiutato Litografia27 , nonché futuro potenziale catalitico sistemi di sonde. 28

Progressi nel campo delle nanotecnologie sono dipendenti lo sviluppo di tecniche in grado di fabbricare di efficiente e affidabile caratteristiche su nanoscala su superfici. 1 , 2 tuttavia, generando tale presenta ampie zone (più cm2) in modo affidabile e a costo relativamente basso è uno sforzo non banale. La maggior parte delle tecniche esistenti, derivate dall'industria dei semiconduttori, si basano su ablativa fotolitografia per fabbricare materiali 'hard'. Più recentemente, tecniche litografiche derivati dalla scansione microscopia a sonda (SPM) sono emerse come un approccio conveniente e versatile per la prototipazione rapida di disegni su scala nanometrica. 3 tecniche basate su SPM sono in grado di scrivere comodamente e rapidamente '' qualsiasi modello definito dall'utente. Il più ben noto di questi è la nanolitografia dip-pen (DPN), introdotta da Mirkin et al.,4 dove una sonda di scansione viene utilizzata come una 'penna' per trasferire un molecolare 'inchiostro' a superficie producendo caratteristiche in maniera analoga alla scrittura. Condizioni ambientali, come una sonda è scandita attraverso una superficie le molecole di 'inchiostro' vengono trasferite per la superficie tramite un menisco di acqua che si forma tra la sonda e la superficie (Figura 1). DPN permette così la deposizione di nanolitografiche di una vasta gamma di materiali, tra cui 'soft' materiali come i polimeri e biomolecole. 5 tecniche correlate utilizzando le sonde ingegnerizzati con canali per erogazione di fluidi, variamente denominati 'nanopipettes' e 'nano-stilografiche', inoltre sono stati segnalati. 6 , 7 , 8
Il principale ostacolo all'applicazione più ampia della litografia SPM-derivato è la velocità effettiva, come richiede un tempo eccessivamente lungo per aree di centimetro-scala del modello con una singola sonda. Primi sforzi per affrontare questo problema incentrato sulla parallelizzazione di DPN basati su a sbalzo, con 'one-dimensional' e 'bidimensionale' matrici (2D) sonda viene segnalate per la litografia aree di dimensioni centimetro. 5 , 9 tuttavia, queste matrici a sbalzo sono prodotti attraverso metodi di fabbricazione più fasi relativamente complesso e sono relativamente fragili. L'invenzione della litografia di polimero penna (PPL) affrontato questo problema sostituendo il cantilever SPM standard con una matrice 2D di silossano morbido elastomero sonde accoppiata a una lastra di vetro. 10 questa configurazione sonda semplice riduce significativamente i costi e la complessità di patterning grandi aree, aprendo la pagina di nanolitografia a una vasta gamma di applicazioni. Questa architettura a sbalzo-free è stata ampliata anche alla punta dura soft-primavera Litografia,11 che fornisce un ibrido di morbido appoggio elastomerico con punte di silicone dà risoluzione migliorata rispetto ai modelli prodotti utilizzando morbido consigli di elastomero.
Un fattore cruciale nell'esecuzione di queste tecnologie di matrice 2D è che la matrice della sonda deve essere esattamente parallela al substrato superficiale modo che quando si utilizza una Litografia, tutte le sonde vengono a contatto con la superficie simultaneamente. Anche un piccolo disallineamento può causare una grande differenza nella dimensione caratteristica da un lato della matrice a altra, poiché alcune sonde entrerà in contatto con la superficie precedentemente, durante la discesa della matrice, mentre gli altri entreranno in contatto più tardi o non a tutti. 12 l'allineamento esatto è particolarmente importante con PPL a causa della deformabilità delle sonde elastomero morbido, dove le sonde di contatto con la superficie in precedenza verranno compressi, lasciando un'impronta più grande sulla superficie.
I primi lavori su PPL impiegato controllo puramente visivo per guidare il processo di allineamento, usando una telecamera montata sopra la matrice per osservare la deformazione delle sonde piramidale come ce li hanno portati a contatto con la superficie. 10 allineamento è stata giudicata osservando quale lato delle sonde entra in contatto con la superficie in primo luogo, quindi regolare l'angolo e ripetere la procedura in modo iterativo fino a quando la differenza di contatto su ogni lato della sonda era indistinguibili ad occhio. Questa procedura di allineamento si basa sull'ispezione visiva soggettiva da parte dell'operatore, riproducibilità è basso.
Successivamente, è stato sviluppato un approccio più obiettivo, che consiste di un sensore di forza montato sotto il substrato per misurare la forza applicata al contatto delle sonde sulla superficie. 12 allineamento è stato realizzato così regolando gli angoli di inclinazione per massimizzare la forza esercitata, che ha indicato che tutte le sonde erano contemporaneamente in contatto. Questo metodo ha mostrato che l'allineamento all'interno di 0,004 ° del parallelo di superficie era possibile. Questo 'force feedback livellamento' ora è stato implementato nei sistemi completamente automatizzati in due relazioni indipendenti. 13 , 14 sia utilizzare una triade di sensori di forza montata sotto il substrato o sopra la matrice e misurare la quantità di forza esercitata al contatto tra la sonda matrici e superficie. Questi sistemi offrono alta precisione, segnalazione disallineamenti di ≤0.001 ° sopra una scala di lunghezza di 1 cm,14 o ≤ 0,0003 ° sopra 1,4 cm.13 questi sistemi automatizzati allineamento forniscono anche grandi risparmi in tempo all'operatore e tempo complessivo impiegato per completare il processo di litografia.
Un'applicazione importante di alto-rendimento superficiale fabbricazione abilitati per questa tecnologia è la generazione di substrati di coltura delle cellule. È ormai ben accertato quello fenotipo delle cellule può essere manipolato controllando l'interazione iniziale fra le cellule e le caratteristiche della superficie, e che questo può essere migliorato su nanoscala. 15 in particolare, metodi di scansione sonda Litografia hanno dimostrati di essere un facile metodo per produrre una varietà di superfici nanofabbricate per tali esperimenti della coltura cellulare. 16 ad esempio, superfici che presentano modelli su scala nanometrica di monostrati auto-assemblati e matrice extracellulare proteine basato su modelli di PPL e DPN sono stati usati per studiare il potenziale di materiali nano-modificato in materiale ha indotto la differenziazione di cellule staminali. 17
Questo protocollo descrive l'utilizzo di un sistema di microscopio (AFM) modificate forza atomica che consente grande area PPL. Dettagliamo il rilevamento della forza utilizzando più sensori di forza come il mezzo per determinare contatto sonda-superficie, insieme con un algoritmo che consente di automatizzare il processo di allineamento iterativo. Successiva funzionalizzazione di questi modelli con la fibronectina di proteine della matrice extracellulare e la cultura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono descritti, come una dimostrazione di PPL-fabbricato superfici applicate per la coltura cellulare.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM montato su un motore a 5 assi (XYZ&Theta; &phi;) stadio di traslazione e goniometro</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo AFM</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>Penna per incisione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner Plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di servizio per ossigeno secco economica</td><td>Plasma Harrick</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore per tubi</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di umidità modulare</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipetta 100-1000 &; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>Silicon masters</td><td>NIL Technology</td><td>Microscopio</td><td></td></tr> a <tr><td>fluorescenza istantaneo verticale</td> su misura <td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivi per microscopio</td><td>Olympus</td><td>10x e 60x UPlan FLN &infin;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale a campo chiaro</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasuonatore</td><td>Ultrawave Ltd.</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di calcolo per la registrazione e l'interpretazione dei risultati dell'allineamento automatico</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td>FLAMMABLE</td></tr><tr><td>Microscopio Sildes, trasparente, macinato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash; 8% vinilmetilsilossano)-dimetilsilossano copolimero, trimetilsilossi-terminato</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-tetrametil-1,3,5,7-tetravinilciclotetrasilossano</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Platino(0)-1,3-divinil-1,1,3,3-tetrametildisilossano soluzione</td> complessa <td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>DANNOSO, TOSSICO(</td></tr><tr><td>25&ndash; 35% metilidrosilossano)-dimetilsilossano copolimero, trimetilsilossano-terminato</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>Weigh Boat 100 mL</td><td>Forniture per laboratorio scientifico</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo in carbonio</td><td>Agar scientific</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>acido 16-Mercaptoesadecanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>NOCIVO, TOSSICO</td></tr><tr><td>ETANOLO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>INFIAMMABILE</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio rivestito in oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>Una volta aperto, l'oro rimarrà reattivo ai tioli per almeno 1 mese</td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>NOCIVO, TOSSICO</td></tr><tr><td>Nitrato di ferro (III) nonaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>NOCIVO, TOSSICO</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>NOCIVO, TOSSICO</td></tr> <tr><td>(11-Mercaptoundecil) esa(glicole etilenico)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>DANNOSO, TOSSICO</td></tr><tr><td>Fibronectina dal plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di cobalto (II) esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>DANNOSO, TOSSICO</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali mesenchimali umane</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1 Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Provette per centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>DANNOSO, TOSSICO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>"Detergente" nel manoscritto</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mezzo di montaggio con vettore DAPI</td><td> Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-fibronectina di coniglio</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) di capra anti-coniglio, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>T75 tessuto pallone per coltura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>cantilever</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Microscopia a sonda di scansione ha permesso la creazione di una varietà di metodi per la realizzazione di top-down ("additiva") costruttiva delle caratteristiche su scala nanometrica. Un grave inconveniente di scansione sonda Litografia è storicamente il throughput intrinsecamente basso dei sistemi di singola sonda. Questo è stato affrontato mediante l'uso di matrici di sonde multiple per consentire velocità effettiva maggiore nanolitografia. Al fine di attuare tale nanolitografia parallelizzata, l'allineamento preciso delle matrici di sonda con la superficie del substrato è vitale, in modo che tutte le sonde fare contatto con la superficie simultaneamente quando inizia la campitura litografica. Questo protocollo viene descritto l'utilizzo della litografia di penna di polimero per produrre caratteristiche su scala nanometrica su aree di dimensioni centimetro, facilitate mediante l'uso di un algoritmo per l'allineamento rapido, accurato e automatizzato di matrici di sonda. Qui, nanolitografia di tioli su substrati d'oro dimostra la generazione di caratteristiche con elevata uniformità. Questi modelli sono quindi funzionalizzati con fibronectina per uso nel contesto di studi di morfologia di superficie-diretto delle cellule.

Per verificare se l'allineamento automatico aveva avuto successo, sono stati esaminati i grafici tracciati dai dati di allineamento (nel foglio di calcolo dal punto 4.8). Dove il processo di allineamento aveva avuto successo le due trame, corrispondente all'angolo da cui la fase del campione è stata inclinata lungo gli assi θ, φ ha mostrato una serie di crescente e decrescente i punti dati. In ciascuna delle trame, PF lineare dei punti dati hanno mostrato un intersect ben definito "picco" che indica il massimo z-estensione e l'angolo corrispondente in cui l'allineamento è stato raggiunto (Figura 4A e 4B). Questo processo è ripetuto quattro volte (vale a dire, due volte per ogni asse) e tracciate come un insieme di quattro coordinate. L'intersezione di ogni coppia di coordinate Mostra così gli angoli nel complesso ottimali (Figura 4). 13 in casi dove l'allineamento non è riuscita, si può osservare che loro corrispondente θ e φ angolo appezzamenti non dare buona qualità lineare adatta, oppure non si intersecano (Figura 5). Tali allineamenti non riusciti sono in genere come risultato le matrici viene impropriamente tagliato o montato al titolare della sonda (passaggi 1.7, 1.8 e 2.2). In questi casi, le matrici sono state scartate e uno nuovo preparato e montato (passaggi 1 e 2) e ripetuta il processo di allineamento (passaggio 4).
Al successo allineamento e litografia con MHA di PPL, substrati d'oro poi erano imaged utilizzando la microscopia a forza laterale di esaminare se la deposizione aveva avvenuto. Un esame più grande zona delle superfici stampate è stata condotta anche mediante microscopia ottica dei substrati dopo l'incisione dell'oro non protetto da depositato del tiolo (Figura 6 e Figura 7). Tuttavia, i modelli incisi non possono essere utilizzati per ulteriore funzionalizzazione e devono essere utilizzati solo per confermare la campitura su campioni rappresentativi di un batch di substrati superficie stampate. Se i modelli incisi Visualizza aree vuote corrispondenti ai recinti individuali (Figura 8), questo risultato indica che la produzione di matrici di sonda non è stato fatto con successo, e che alcune sonde sono danneggiati o mancanti. Questa disomogeneità delle sonde può essere dovuto l'uso di un vecchio maestro dove il rivestimento perfluorurati ha usurato (punto 1.3), con conseguente alcune sonde essere strappati via quando la matrice è separata dal master. In questi casi, deve essere utilizzato un nuovo master. Il risultato può anche essere dovuto alla presenza di aria bolle intrappolate tra il vetro di supporto e il master (punto 1.5), o se la matrice di sonda non era correttamente separata dal maestro dopo l'indurimento (passo 1,8).
Immagini di microscopia fluorescente delle superfici funzionalizzata fibronectina incubate hMSCs erano anche raccolti (Figura 9). In generale, tutti i substrati erano stabili all'interno dell'ambiente di coltura in vitro e le cellule hanno aderito e adattato la loro morfologia per i modelli stampati in caso di più piccolo isolato 20x20 serie di caratteristiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Figura 1. Rappresentazione schematica della litografia di penna di polimero risultati molecolari inchiostro trasporto tramite un menisco di acqua sulla punta della sonda. (A) vista laterale e (B) superiore vista della matrice polimerica penna indicano che quando la matrice di sonda ed il substrato superficiale sono completamente allineati, tutte le sonde entrano in contatto con la superficie simultaneamente, con conseguente parallelizzata Litografia. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Figura 2. Diagramma schematico della litografia di polimero penna set up (A) vista laterale espanso di impostazione sperimentale dove la matrice preparato sonda è collegata alla titolare della sonda e montata a scanner AFM. Il substrato è posizionato sul palco, sotto cui si trovano i tre sensori di forza. (B) una rappresentazione della strumentazione assemblato, mostrando la testa di scansione AFM rispetto allo stage di campione. Vista (C) inferiore mostra l'ubicazione del sensore di forza. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Figura 3. Rappresentazione schematica raffigurante il programma di spettroscopia per la procedura di allineamento. Lo scanner AFM è impostato per spostare le sonde verso campione da una distanza di 10 µm entro 100 ms, tenuta in posizione per 250 ms, seguita da una ritrattazione di 10 µm entro 100 ms e poi tenuto per 250 ms in posizione retratta. Il movimento viene quindi ripetuto durante tutto il processo di allineamento. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Figura 4. Grafici che illustrano un allineamento successo. Grafici di posizione z contro gli angoli di inclinazione (A) θ e φ (B) per un allineamento di successo, dove ● indica i valori effettivi misurati e + indica la migliore vestibilità con il metodo dei minimi quadrati. (C) il grafico di φ contro θ montato gli angoli con i quattro punti dove è stata raggiunta la massima posizione z. Il punto di intersezione contrassegnato è l'angolo di inclinazione ottimale finale attraverso entrambi gli assi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Figura 5. Grafici che illustrano un allineamento infruttuoso. Grafici di posizione z contro gli angoli di inclinazione (A) θ e φ (B) per un allineamento infruttuoso, dove ● indica i valori effettivi misurati e + indica la migliore vestibilità con il metodo dei minimi quadrati. (C) il grafico di φ contro θ montato gli angoli con i quattro punti dove è stata raggiunta la massima posizione z. Nessun chiaro optima o punto di intersezione sono stati osservati e pertanto non vengono risolti gli angoli di allineamento ottimale. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Nella figura 6. Microscopia ottica illustrativa e immagini di microscopia di forza atomica di substrati d'oro che erano modellate con MHA di matrici PPL allineate e poi inciso. (A) e (B) sono immagini di microscopia ottica in sequenza ingrandita di modelli incisi; (C) è un'immagine di topografia AFM di una singola griglia di pattern. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Figura 7. Immagini di microscopia ottica illustrativi di substrati d'oro che erano modellate con MHA di matrici PPL allineate e poi inciso. (A) e (B) sono immagini di microscopia ottica in sequenza ingrandita di modelli incisi e (C) è un'immagine di ingrandimento inferiore che mostra grande area modelli omogenei. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Figura 8. Immagine di microscopia ottica illustrativo di un substrato di oro che è stato modellato in modo non uniforme con MHA e poi inciso. I modelli previsti (mostrati nella rientranza) erano ripetere griglie di 20 righe di punti disposti in 20 linee, con ogni due linee prodotti aumentando la z-estensione di asse di 1 µm (che vanno da 5 a-5 µm). Può essere visto che in alcune zone non vengono generati modelli, a causa di mancante sonde in quei luoghi. Nelle aree dove vengono prodotti solo due linee di punti, questo risultato indica che una sonda è presente ma non è della stessa altezza come le sonde pienamente funzionante, così unico deposito dispone quando la matrice viene esteso per il completo z-distanza asse. In questa immagine, il contrasto è stato volontariamente modificato per consentire l'osservazione delle zone parzialmente stampate. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Nella figura 9. Immagini di microscopia epifluorescenza delle hMSCs coltivate su matrici fibronectina basato su modelli di PPL. (A) e (B) sono ad alto ingrandimento immagini visualizzando singole celle. (C) Mostra un modello di esempio della fibronectina matrice senza un aderente delle cellule e (D) è un'immagine di campo largo delle cellule coltivate in una disposizione di griglia (un disegno schematico del modello stampato appare anche nell'intarsio). Le cellule sono macchiate per mostrare la fibronectina (rosso), F-actina (verde) e delle cellule di nuclei (blu). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo un protocollo per wide area scansione sonda nanolitografia attivata per l'allineamento iterativo di sonda matrici, come pure l'utilizzo di modelli litografici per studi di interazione della cellula-superficie.

Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

C'è un grande bisogno di strumenti convenienti per generare caratteristiche e oggetti su scala nanometrica, in particolare nello studio delle interazioni biologiche con materiali e superfici nanostrutturate. Questo protocollo consente la replicazione rapida e omogenea di array di proteine su aree su scala centimetrica con risoluzione su scala nanometrica. Questo ci permette di studiare le interazioni delle cellule staminali mesenchimali su queste superfici.Queste superfici modello ci consentono di esaminare le interazioni controllate tra variabili di materiali specifici e cellule staminali mesenchimali, fornendo criteri fondamentali di progettazione dei materiali che informeranno i futuri progetti di biomateriali. Per iniziare la procedura, mescolare accuratamente i componenti del prepolimero PDMS in una barca di pesatura. Degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto per 20 minuti o fino a quando tutte le bolle di gas sono scomparse.Quindi, posiziona il master in silicio per l'array PPL in una capsula di Petri di quattro centimetri. Versare la miscela di prepolimero PDMS degassata sul master fino a coprirla completamente. Degassare il PDMS coprendo il master per altri cinque minuti.Durante il degasaggio, trattare un vetrino con plasma di ossigeno per un minuto. Dopo il degasaggio, posizionare con cautela il vetrino sul PDMS con il lato trattato rivolto verso il basso. Premere delicatamente il vetrino sul master in silicone per rimuovere l'aria intrappolata e per garantire che uno strato uniforme di PDMS sia inserito tra il master e il vetrino.Trasferire l'array PDMS a sandwich in un'altra piastra di Petri con il master in silicio sul fondo. Polimerizzare il PDMS in forno a 70-80 gradi Celsius per 24-48 ore. Quindi, rimuovere l'array PPL polimerizzato dal forno e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.Utilizzare una lama di rasoio per tagliare con cura il PDMS in eccesso dalla parte posteriore e dai lati del vetrino. Soffiare via i detriti PDMS sciolti con un flusso di azoto gassoso secco. È importante tagliare il PDMS in eccesso dalla parte posteriore e dai bordi dell'array per consentire un allineamento accurato.Questo aiuta anche l'utente a osservare meglio le condizioni delle sonde sotto l'AFM durante la litografia. Incastra una lama di rasoio nell'angolo dell'array a una profondità di un millimetro e solleva con cautela l'array dal master in silicio con un unico movimento di sollevamento continuo. Quindi tagliare e raschiare con cura 0,5 millimetri di PDMS ai bordi dell'array con una lama di rasoio.Gli utenti devono prestare molta attenzione quando fanno leva sugli array dal master per garantire una buona separazione ed evitare di danneggiare le sonde. Questo dovrebbe essere fatto in un'unica azione fluida senza che gli array ricadano sul master in silicio. Trattare l'array PPL con plasmide di ossigeno per 30 secondi, quindi far cadere 20 microlitri di acqua deionizzata sulla superficie dell'array.Se l'acqua non si diffonde uniformemente su tutto il pannello, ripetere il trattamento al plasma. Asciugare accuratamente l'array trattato al plasma, quindi utilizzare del nastro biadesivo di carbonio per fissare l'array al supporto della sonda per microscopia a forza atomica. Montare il supporto della sonda sul supporto cinematico AFM.Per inchiostrare l'array, applicare una goccia da 20 microlitri di una soluzione MHA millimolare in etanolo sull'array, evitando il contatto tra la punta della pipetta e la superficie dell'array. Consentire alla soluzione MHA di diffondersi in tutto l'array. Attendere che l'etanolo evapori.Montare il supporto della sonda con l'array PPL sull'AFM, quindi posizionare un substrato d'oro al centro dello stadio del campione AFM. Fissare il substrato in posizione con del nastro adesivo. Per iniziare l'allineamento, eseguire il programma di configurazione del controller di scena per reimpostare tutti gli assi e gli angoli su un punto zero precalibrato.Utilizzare la console di controllo dell'asse X e Y dello stadio campione AFM per spostare il substrato nella posizione di stampa desiderata. Spostare la leva di rilascio dello stadio per rilasciare lo stadio del campione e attivare i sensori di forza. Lasciare che i sensori si equilibrino per almeno 15 minuti, quindi utilizzare il controller dell'asse Z per sollevare lo stadio del campione fino a quando l'array non è visivamente il più vicino possibile al substrato.Assicurarsi che l'array si trovi entro un millimetro dal substrato. Quindi, apri il programma di allineamento automatico. Riempi il passo angolare, la distanza del passo grossolano e la distanza del passo fine.Impostare il percorso del file del foglio di calcolo e allegare il modello del foglio di calcolo. Quindi apri il software di controllo AFM e vai alla sezione spettroscopia. Configura l'oscillazione dell'asse Z della testina di scansione per estendere 10 micrometri su 100 millisecondi, tenerla premuta per 250 millisecondi, ritrarsi di 10 micrometri su 100 millisecondi e tenerla premuta per 250 millisecondi.Avviare l'oscillazione della testina di scansione ed eseguire l'allineamento automatico. Una volta che il software indica che l'allineamento è terminato, terminare il processo di allineamento. Ispezionare l'adattamento lineare generato automaticamente dei dati di allineamento per determinare se l'allineamento ha avuto successo e per identificare gli angoli ottimali complessivi, quindi aumentare lo stadio del campione con incrementi di 500 nanometri fino a quando non si osserva il contatto tra l'array e il substrato con la telecamera AFM dall'alto.Fare clic su Stop nel software di controllo AFM per ritrarre l'array di 10 micrometri. Per iniziare il processo PPL, aprire la sezione litografia del software di controllo AFM. Selezionare la modalità operativa di modulazione Z e navigare fino al modello di litografia da importare.Inserire le dimensioni del modello da generare. Impostare l'offset di origine su 25 micrometri su entrambi gli assi X e Y, quindi selezionare la posizione Z assoluta di modulazione, impostare lo strumento per semplificare su due livelli e impostare i valori di bianco e nero rispettivamente su cinque e cinque micrometri negativi. Fare clic su OK per applicare le impostazioni e chiudere la finestra.Apri l'editor dei livelli dalla finestra della litografia e imposta il tempo di pausa. Quindi, abbassare la camera di isolamento atmosferico sull'AFM e aprire il suo software di controllo. Impostare un'umidità relativa del 45%una temperatura di 25 gradi Celsius e una portata di scambio atmosferica di 500 millilitri.Implementare le impostazioni e attendere il raggiungimento del livello di umidità desiderato. Quindi avvia la sequenza litografica. Al termine della litografia, ritrarre il tavolino di 500 micrometri.Rimuovere la camera di isolamento atmosferico. Bloccare lo stadio campione per disattivare i sensori di forza. Infine, rimuovere il substrato dal tavolino per la visualizzazione o l'ulteriore elaborazione.La PPL è stata utilizzata per produrre modelli omogenei su larga scala di griglie di array fini o immagini dettagliate. I modelli sono stati visualizzati per la microscopia ottica incidendo l'oro non protetto dal tiolo depositato. Un modello irregolare indicherebbe sonde danneggiate o mancanti.Gli array MHA stampati su oro con PPL sono stati funzionalizzati con fibronectina e incubati con cellule staminali mesenchimali umane. Le singole cellule hanno aderito agli array funzionalizzati con fibronectina, adattando la loro morfologia ai modelli quando necessario. Questa tecnica PPL può essere utilizzata per depositare un'ampia gamma di pattern proteici per esperimenti di biologia cellulare.Un utente esperto può generare modelli come quelli mostrati in circa tre ore. Ricorda che la preparazione meticolosa degli array è la chiave del successo. La tecnica PPL è piuttosto generica e può essere utilizzata per la deposizione di composti che vanno da piccole molecole a polimeri e biomolecole, aprendo la strada a una varietà di studi in chimica, biologia e scienza dei materiali.

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