Grande area scansione sonda nanolitografia nei paraggi allineamento automatico e sua applicazione alla fabbricazione di substrato per gli studi della coltura delle cellule
12 giugno 2018
Qui presentiamo un protocollo per wide area scansione sonda nanolitografia attivata per l'allineamento iterativo di sonda matrici, come pure l'utilizzo di modelli litografici per studi di interazione della cellula-superficie.
C'è un grande bisogno di strumenti convenienti per generare caratteristiche e oggetti su scala nanometrica, in particolare nello studio delle interazioni biologiche con materiali e superfici nanostrutturate. Questo protocollo consente la replicazione rapida e omogenea di array di proteine su aree su scala centimetrica con risoluzione su scala nanometrica. Questo ci permette di studiare le interazioni delle cellule staminali mesenchimali su queste superfici.
Queste superfici modello ci consentono di esaminare le interazioni controllate tra variabili di materiali specifici e cellule staminali mesenchimali, fornendo criteri fondamentali di progettazione dei materiali che informeranno i futuri progetti di biomateriali. Per iniziare la procedura, mescolare accuratamente i componenti del prepolimero PDMS in una barca di pesatura. Degassare la miscela in un essiccatore sottovuoto per 20 minuti o fino a quando tutte le bolle di gas sono scomparse.
Quindi, posiziona il master in silicio per l'array PPL in una capsula di Petri di quattro centimetri. Versare la miscela di prepolimero PDMS degassata sul master fino a coprirla completamente. Degassare il PDMS coprendo il master per altri cinque minuti.
Durante il degasaggio, trattare un vetrino con plasma di ossigeno per un minuto. Dopo il degasaggio, posizionare con cautela il vetrino sul PDMS con il lato trattato rivolto verso il basso. Premere delicatamente il vetrino sul master in silicone per rimuovere l'aria intrappolata e per garantire che uno strato uniforme di PDMS sia inserito tra il master e il vetrino.
Trasferire l'array PDMS a sandwich in un'altra piastra di Petri con il master in silicio sul fondo. Polimerizzare il PDMS in forno a 70-80 gradi Celsius per 24-48 ore. Quindi, rimuovere l'array PPL polimerizzato dal forno e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.
Utilizzare una lama di rasoio per tagliare con cura il PDMS in eccesso dalla parte posteriore e dai lati del vetrino. Soffiare via i detriti PDMS sciolti con un flusso di azoto gassoso secco. È importante tagliare il PDMS in eccesso dalla parte posteriore e dai bordi dell'array per consentire un allineamento accurato.
Questo aiuta anche l'utente a osservare meglio le condizioni delle sonde sotto l'AFM durante la litografia. Incastra una lama di rasoio nell'angolo dell'array a una profondità di un millimetro e solleva con cautela l'array dal master in silicio con un unico movimento di sollevamento continuo. Quindi tagliare e raschiare con cura 0,5 millimetri di PDMS ai bordi dell'array con una lama di rasoio.
Gli utenti devono prestare molta attenzione quando fanno leva sugli array dal master per garantire una buona separazione ed evitare di danneggiare le sonde. Questo dovrebbe essere fatto in un'unica azione fluida senza che gli array ricadano sul master in silicio. Trattare l'array PPL con plasmide di ossigeno per 30 secondi, quindi far cadere 20 microlitri di acqua deionizzata sulla superficie dell'array.
Se l'acqua non si diffonde uniformemente su tutto il pannello, ripetere il trattamento al plasma. Asciugare accuratamente l'array trattato al plasma, quindi utilizzare del nastro biadesivo di carbonio per fissare l'array al supporto della sonda per microscopia a forza atomica. Montare il supporto della sonda sul supporto cinematico AFM.
Per inchiostrare l'array, applicare una goccia da 20 microlitri di una soluzione MHA millimolare in etanolo sull'array, evitando il contatto tra la punta della pipetta e la superficie dell'array. Consentire alla soluzione MHA di diffondersi in tutto l'array. Attendere che l'etanolo evapori.
Montare il supporto della sonda con l'array PPL sull'AFM, quindi posizionare un substrato d'oro al centro dello stadio del campione AFM. Fissare il substrato in posizione con del nastro adesivo. Per iniziare l'allineamento, eseguire il programma di configurazione del controller di scena per reimpostare tutti gli assi e gli angoli su un punto zero precalibrato.
Utilizzare la console di controllo dell'asse X e Y dello stadio campione AFM per spostare il substrato nella posizione di stampa desiderata. Spostare la leva di rilascio dello stadio per rilasciare lo stadio del campione e attivare i sensori di forza. Lasciare che i sensori si equilibrino per almeno 15 minuti, quindi utilizzare il controller dell'asse Z per sollevare lo stadio del campione fino a quando l'array non è visivamente il più vicino possibile al substrato.
Assicurarsi che l'array si trovi entro un millimetro dal substrato. Quindi, apri il programma di allineamento automatico. Riempi il passo angolare, la distanza del passo grossolano e la distanza del passo fine.
Impostare il percorso del file del foglio di calcolo e allegare il modello del foglio di calcolo. Quindi apri il software di controllo AFM e vai alla sezione spettroscopia. Configura l'oscillazione dell'asse Z della testina di scansione per estendere 10 micrometri su 100 millisecondi, tenerla premuta per 250 millisecondi, ritrarsi di 10 micrometri su 100 millisecondi e tenerla premuta per 250 millisecondi.
Avviare l'oscillazione della testina di scansione ed eseguire l'allineamento automatico. Una volta che il software indica che l'allineamento è terminato, terminare il processo di allineamento. Ispezionare l'adattamento lineare generato automaticamente dei dati di allineamento per determinare se l'allineamento ha avuto successo e per identificare gli angoli ottimali complessivi, quindi aumentare lo stadio del campione con incrementi di 500 nanometri fino a quando non si osserva il contatto tra l'array e il substrato con la telecamera AFM dall'alto.
Fare clic su Stop nel software di controllo AFM per ritrarre l'array di 10 micrometri. Per iniziare il processo PPL, aprire la sezione litografia del software di controllo AFM. Selezionare la modalità operativa di modulazione Z e navigare fino al modello di litografia da importare.
Inserire le dimensioni del modello da generare. Impostare l'offset di origine su 25 micrometri su entrambi gli assi X e Y, quindi selezionare la posizione Z assoluta di modulazione, impostare lo strumento per semplificare su due livelli e impostare i valori di bianco e nero rispettivamente su cinque e cinque micrometri negativi. Fare clic su OK per applicare le impostazioni e chiudere la finestra.
Apri l'editor dei livelli dalla finestra della litografia e imposta il tempo di pausa. Quindi, abbassare la camera di isolamento atmosferico sull'AFM e aprire il suo software di controllo. Impostare un'umidità relativa del 45%una temperatura di 25 gradi Celsius e una portata di scambio atmosferica di 500 millilitri.
Implementare le impostazioni e attendere il raggiungimento del livello di umidità desiderato. Quindi avvia la sequenza litografica. Al termine della litografia, ritrarre il tavolino di 500 micrometri.
Rimuovere la camera di isolamento atmosferico. Bloccare lo stadio campione per disattivare i sensori di forza. Infine, rimuovere il substrato dal tavolino per la visualizzazione o l'ulteriore elaborazione.
La PPL è stata utilizzata per produrre modelli omogenei su larga scala di griglie di array fini o immagini dettagliate. I modelli sono stati visualizzati per la microscopia ottica incidendo l'oro non protetto dal tiolo depositato. Un modello irregolare indicherebbe sonde danneggiate o mancanti.
Gli array MHA stampati su oro con PPL sono stati funzionalizzati con fibronectina e incubati con cellule staminali mesenchimali umane. Le singole cellule hanno aderito agli array funzionalizzati con fibronectina, adattando la loro morfologia ai modelli quando necessario. Questa tecnica PPL può essere utilizzata per depositare un'ampia gamma di pattern proteici per esperimenti di biologia cellulare.
Un utente esperto può generare modelli come quelli mostrati in circa tre ore. Ricorda che la preparazione meticolosa degli array è la chiave del successo. La tecnica PPL è piuttosto generica e può essere utilizzata per la deposizione di composti che vanno da piccole molecole a polimeri e biomolecole, aprendo la strada a una varietà di studi in chimica, biologia e scienza dei materiali.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la nanolitografia a sonda con scansione su vasta area, concentrandosi sull'allineamento iterativo di matrici di sonde. Inoltre, discute l'applicazione di modelli litografici per lo studio delle interazioni tra cellule e superfici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nanotecnologia
- Biomateriali
- Biologia cellulare
Sfondo
- Esiste un'esigenza significativa di strumenti per creare strutture su scala nanometrica per studi biologici.
- Questo protocollo consente la rapida replicazione di matrici proteiche su ampie superfici.
- Facilita l'esame delle interazioni tra cellule staminali mesenchimali e superfici nanostrutturate.
- La comprensione di queste interazioni può guidare la progettazione futura di biomateriali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la creazione di superfici nanostrutturate per la ricerca biologica.
- Studiare le interazioni delle cellule staminali mesenchimali con queste superfici.
- Stabilire criteri progettuali per biomateriali futuri basati su interazioni controllate.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del prepolymero PDMS per la creazione di array di sonde.
- Disgassaggio e polimerizzazione del PDMS per formare un array stabile.
- Utilizzo della microscopia a forza atomica (AFM) per l'allineamento e la litografia.
- Applicazione di soluzioni specifiche per modificare le proprietà della superficie ai fini dello studio delle interazioni cellulari.
Risultati principali
- Il protocollo crea con successo superfici nanostrutturate uniformi.
- Le interazioni delle cellule staminali mesenchimali possono essere studiate efficacemente su queste superfici.
- Condizioni controllate permettono una misurazione precisa delle risposte biologiche.
- I dati ottenuti possono guidare la progettazione di biomateriali futuri.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori nel campo della nanotecnologia e della biologia cellulare.
- Migliora la comprensione delle interazioni tra cellule e superfici a livello nanometrico.
- I risultati contribuiscono allo sviluppo di biomateriali avanzati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una nanolitografia ad alto rendimento per la creazione di schemi proteici uniformi su aree di scala centimetrica, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca sui biomateriali. Facilitando l'allineamento automatizzato di matrici di sonde, supporta una funzionalizzazione superficiale riproducibile per lo studio delle interazioni tra cellule e materiali. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella progettazione precoce dei biomateriali fornendo substrati nanometrici controllati per analisi meccanicistiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di come la nanotopografia influenzi l'adesione e la morfologia delle cellule staminali mesenchimali, supportando la validazione degli obiettivi nei percorsi di meccanobiologia.
- Valore operativo: Fornisce array proteici standardizzati su larga scala che riducono la variabilità nei saggi di screening fenotipico precoce.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera pattern quantificabili e omogenei di tioli su substrati d'oro funzionalizzati con fibronectina, consentendo una presentazione costante dei ligandi per saggi cellulari.
- Valore operativo: Permette la fabbricazione scalabile di substrati stampati per lo screening ad alto contenuto delle risposte delle cellule staminali ai segnali dei materiali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Crea substrati pertinenti alle malattie per lo studio delle interazioni delle cellule staminali mesenchimali, fornendo indicazioni per la progettazione di biomateriali in applicazioni di medicina rigenerativa.
- Valore operativo: Fornisce superfici nanostrutturate riproducibili che collegano i risultati della ricerca alla validazione preclinica delle prestazioni del materiale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio allo sviluppo del saggio fino alla preparazione del modello preclinico, in particolare per biomateriali diretti verso nicchie di cellule staminali.
- Biologia della Scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo un controllo preciso sulle variabili superficiali a livello nanometrico per isolare i loro effetti sul comportamento cellulare.
- Screening: Produce substrati pronti per i saggi con elevata uniformità e riproducibilità, fondamentali per uno screening affidabile di composti o materiali.
- Analisi: Genera schemi spazialmente definiti di proteine che permettono misurazioni quantitative delle risposte cellulari come adesione, espansione e differenziazione.
- Ricerca Translazionale: Favorisce la continuità dallo screening in vitro alla valutazione preclinica fornendo superfici regolabili che imitano i segnali della matrice extracellulare.
- Riutilizzo Aziendale: Rappresenta una capacità di piattaforma per generare svariati schemi biomolecolari in diversi progetti di scienza dei materiali e sviluppo di terapie cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulle interazioni alla superficie cellulare mediante un impaginamento nanometrico preciso.
- Valore operativo: Consente la standardizzazione e la scalabilità della fabbricazione dei substrati tra diversi laboratori e progetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di biomateriali fornendo dati predittivi sulle risposte cellulari a nanostrutture definite.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati biomateriali in base al rischio, basandosi su prestazioni validate in saggi di interazione controllati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a scansione con sonda e tecniche di nanofabbricazione basate su polimeri.
- Presuppone l'accesso a sistemi di microscopia a forza atomica dotati di software di allineamento automatico e camere di controllo ambientale.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di preparazione del PDMS, di fabbricazione degli array di sonde e di funzionalizzazione delle superfici tra diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora la tecnica venga estesa a tipi cellulari diversi o a proteine della matrice extracellulare diverse dalla fibronectina.
- I limiti pratici includono la necessità di una preparazione meticolosa degli array per garantire l'integrità delle sonde e un contatto uniforme durante la litografia, come indicato nel protocollo.
