Name: Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Impara il sequenziamento mirato del 16S rRNA da campioni di latte umano a basso biomassa con un protocollo semi-automatizzato. Questo metodo facilita lo studio del microbioma umano e le sue implicazioni per salute e malattia.

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Vorremmo ringraziare Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, dottorato di ricerca per lo sviluppo del protocollo. Supporto globale per l'International materno pediatrica adolescenziale AIDS clinico prove gruppo (IMPAACT) è stato fornito dal National Institute of Allergy e Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) sotto numeri del premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), con il co-finanziamento il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) e l'Istituto nazionale di salute mentale (NIMH). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Per tutti i passaggi di protocollo, dispositivi di protezione personale (PPE) devono essere indossati e approcci di prevenzione contaminazione rigorosi devono essere prese. Osservare il flusso di lavoro da pre-amplificazione aree di aree di lavoro di post-amplificazione per minimizzare la contaminazione dei campioni di lavoro. Tutte le forniture utilizzate sono sterili, libero della RNasi, DNasi, DNA e pirogeni. Tutti i puntali vengono filtrati. Un diagramma di flusso dei passaggi del protocollo è fornito (Figura 1).
1. lisi del campione
Nota: Lisi del campione ed estrazione di acidi nucleici vengono eseguite utilizzando un kit di estrazione di DNA/RNA in un ambiente pulito dove sia procedurali che ingegneria dei controlli sono in atto per ridurre al minimo l'introduzione di batteri ambientali ai campioni.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire l'armadio di sicurezza biologica (BSC) lavora zona con detergente appropriato superficie per eliminare eventuali contaminazioni di acido nucleico.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostarlo a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il tampone di lisi tiocianato di guanidinium (Vedi tabella materiali)
	<ol>
<li>Controllare il buffer di lisi per precipitati. Ri-sciogliere precipitati dal riscaldamento a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare 600 µ l di tampone di lisi con 6 µ l β-mercaptoetanolo (β-ME) per ogni campione. Si consideri un volume di 20% supplementare per campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Se il latte intero è congelato, scongelare su ghiaccio. Aliquotare 5ml di intero latte in un 15 mL o in una provetta sterile 5 mL in BSC e tenerlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Girare il latte 5 mL aliquota per 10 min a 5.000 x g a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
		<li>Rimuovere lo strato di grasso, ora lo strato superiore del tubo, con una spatola di plastica o grande foro punta della pipetta.</li>
		<li>Senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il supernatante ad eccezione di 100 µ l.</li>
		<li>Lavare la pallina di risospensione in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
		<li>Preparare 1 controllo negativo aggiungendo 1 mL di PBS sterile in una provetta 5 mL.</li>
		<li>Trasferire la sospensione in una provetta pulita 1,5 mL centrifuga e spin in una microcentrifuga per 1 min (a temperatura ambiente (TA) fino a 5.000 x g).</li>
		<li>Per scartare l'intero livello di surnatante/grassi, usare una punta di pipetta sterile filtrata 1.000 µ l.</li>
		<li>Se non estraendo lo stesso giorno, snap congela la cella a pellet inserendolo in un etanolo/a secco ghiaccio semiliquido e trasferire immediatamente al congelatore-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rottura del campione e l'omogeneizzazione (tallone-battente)
	<ol>
<li>Aggiungere 600 µ l di tampone di lisi contenente β-ME al pellet e trasferire la sospensione in una provetta di tallone.</li>
		<li>Ogni lotto di estrazione di 12 contiene 10 campioni, 1 controllo negativo (preparata al punto 3.7 sopra) e 1 controllo positivo (preparato nel passaggio successivo).<ol>
<li>Preparare 1 controllo positivo con buffer di lisi e 20 µ l del campione finto batterico (la comunità finta utilizzata ha una concentrazione, una volta estratta, di circa 0,2 ng / µ l di DNA).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortice tutti perlina tubi energicamente per 15 s.</li>
		<li>Riscaldare i campioni sul Vortex termostatato a 37 ° C per 10 min, con agitazione a 700-800 giri/min.</li>
		<li>Caricare il set di adattatori di apparecchiature automatiche disruptor tubi.</li>
		<li>Tallone battere per 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Smontare il set di adattatori e passare manualmente la scheda impostata con le piastre di campione dal braccio robotico di sinistra del braccio robotico destra dello strumento.</li>
		<li>Tallone battere per un altro 1 min a 30 Hz.</li>
		<li>Provette per centrifuga a 17.200 x g, per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Rimuovere tutti il surnatante con una pipetta 200 µ l, facendo attenzione a non ottenere qualsiasi dello strato di grasso nella parte superiore del campione o il tallone residua nella parte inferiore del campione e si applicano a una colonna di omogeneizzatore.</li>
		<li>Colonne di omogeneizzatore centrifuga alla massima velocità, 17.200 x g per 3 min a 25 ° C.</li>
		<li>Trasferire 350 µ l di eluato microcentrifuga di un produttore di 2 mL per uso con lo strumento automatizzato per la purificazione di DNA e RNA (non usare qualsiasi altro tubo). Fare attenzione a non trasferire qualsiasi strato residuo di grasso.</li>
		<li>Se il volume di flusso continuo è a meno di 350 µ l, aggiungere tampone di lisi con β-ME ad un volume finale di 350 µ l.</li>
		<li>I campioni di lasciare RT per fino a 2 h prima di procedere all'isolamento dell'acido nucleico utilizzando lo strumento di purificazione automatizzato del DNA, o congelare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Area di lavoro di pulizia
	<ol>
<li>Pulire tutte le superfici in utilizzano con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min, poi spruzzare con etanolo al 70% e pulire la superficie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolare il DNA/RNA
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Attivare il blocco di calore e regolare la temperatura di 70 ° C.</li>
		<li>Accendere il Vortex a temperatura controllata e impostare la temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Scaldare il buffer di eluizione (EB) contenente 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, in un tubo da 50 mL a 70 ° C.</li>
		<li>Scaldare 350 µ l di campione congelato lisati in provette da 2 mL a 37 ° C fino a quando completamente scongelato senza alcun precipitato (circa 10 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione del DNA
	<ol>
<li>Vortex e centrifugare le provette 2 mL con campione brevemente (3000 x g per 10 s).</li>
		<li>Inserire 2 mL provette nello shaker seguendo il grafico del carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA, secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Ottenere i rotore adattatori e impostarle sul vassoio in base al numero di campioni.</li>
		<li>Etichettare ogni adattatore rotore basata sull'identificazione del campione (ID).</li>
		<li>Tagliare i coperchi e lisciare i bordi delle colonne singole spin per DNA e RNA.</li>
		<li>Inserire la colonna di spin di DNA senza il tubo di raccolta nell'adattatore del rotore. Gettare la provetta di raccolta.</li>
		<li>Etichetta 1,5 mL provette per la raccolta e inserire gli adattatori del rotore.</li>
		<li>Set adattatori per rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Inserire 1.000 µ l-puntali del produttore con filtro in rack di punta.</li>
		<li>Aggiungere acqua RNAsi-libera al tubo del microcentrifuge del costruttore 2 mL dipenda dal numero di campioni (per istruzioni di macchina specifico protocollo).</li>
		<li>Inserire il tubo nella fessura del tubo "A" di slot di tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Scartare qualsiasi reagente che è rimasto in flaconi di reagente e riempire con un volume minimo di 10 mL.</li>
		<li>Il portabottiglie di reagente (tranne bottiglia EB), inserire i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Aggiungere EB caldo da un tubo da 50 mL per la posizione di bottiglia del Reagente 6.</li>
		<li>Verifica provette da 1,5 mL sono collocate strettamente negli adattatori del rotore.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "estrazione kit" → "Animale, tessuti e cellule" → "del kit nome 350 µ l parte A Custom DNA" → modificare Volume di eluizione per 100 µ l (impostazione predefinita) o 50 µ l per biomassa basso campioni → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna di spin di DNA dalla posizione del rotore adattatore 3.</li>
		<li>Non gettare gli adattatori del rotore, il RNA è in posizione 2.</li>
		<li>Rimuovere i tubi di raccolta 1,5 mL contenente DNA eluito nella posizione 3 e memorizzare in − 20 ° C.</li>
		<li>Raccogliere campione contenente tubi da shaker e negozio a − 20 ° C, se qualsiasi campione è lasciato sopra, altrimenti scartare.</li>
		<li>Continuare con il protocollo "del kit nome 350 µ l parte B RNA" per ulteriore purificazione del RNA.</li>
		<li>Purificazione RNA sarà fatto dai circa 350 µ l flusso continuo che è in posizione centrale di adattatori del rotore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificazione di RNA
	<ol>
<li>Inserire la colonna di spin di RNA privo di coperchio e tubo di raccolta nell'adattatore del rotore.</li>
		<li>Etichetta del nuovo 1,5 mL provette per la raccolta e inserirli nell'adattatore del rotore, come indicato nel manuale.</li>
		<li>Impostare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il grafico carico di strumento automatizzato per la purificazione del DNA/RNA.</li>
		<li>Chiudere il coperchio dello strumento e selezionare: "RNA" → "Kit del produttore" → "Animale, tessuti e cellule" → "Standard parte B RNA" → "Start".</li>
		<li>Al termine, rimuovere gli adattatori rotore fuori la centrifuga e metterli sul vassoio.</li>
		<li>Scartare la colonna spin RNA dalla posizione 3.</li>
		<li>Provette da 1,5 mL contenente 30 µ l eluiti RNA alla posizione 3 di rimuovere e conservare a − 80 ° C.</li>
		<li>Rimuovere i flaconi dei reagenti.</li>
		<li>Smaltire i contenuti di adattatore di rotore attraverso i canali appropriati rifiuti pericolosi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Postazione di lavoro pulita
	<ol>
<li>Spray accessori tutti automatizzato del DNA/RNA purificazione dello strumento, quali cremagliere del reagente, vassoio e qualsiasi altra superficie in uso con una soluzione di decontaminazione non enzimatici, lasciano per 10 min e risciacquare con acqua deionizzata (DI), poi lasciarli asciugare.</li>
		<li>Spruzzo strumento automatizzato con solo produttore approvato soluzione di decontaminazione non enzimatici, pulire l'interno della centrifuga insieme a tutte le superfici in uso, lasciare per 10 min e poi pulire con etanolo al 70%. Non utilizzare altri tipi di soluzioni di decontaminazione, poichè possono danneggiare lo strumento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mirati 16S PCR set-up
Nota: Il set-up per la PCR 16S avviene in un'area di lavoro pre-amplificazione designato che si trova all'interno della camera bianca. I reagenti ed i campioni sono preparati e quindi caricati su un gestore liquido per eseguire la PCR per ciascun campione in triplice copia (30 campioni, sono veri campioni e controlli positivi e negativi di estrazione, più 2 PCR acqua controlli in triplice copia, per un totale di 96 combinato di campioni e controlli). Una volta che le reazioni di PCR sono assemblate e sigillate, piatto del campione viene trasferito un termociclatore situato in una zona di post-amplificazione per il ciclismo.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation PCR. Spruzzo che tutte le superfici in uso con un DNA di RNasi, DNasi, decontaminante, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Preparare il foglio di lavoro di PCR 16S (vedere il foglio di lavoro di Targeted 16S PCR) con un elenco di esempi precisi e primer con codici a barre diversi assegna a ciascun campione9. Stampare il foglio di lavoro e le mappe di piastra (Vedi Tavola 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della master mix PCR Nota: selezione dell'iniettore 16S si basa sulla regione di interesse per lo studio particolare e può cambiare dal tipo studio o campione. Pertanto, prima di ordinare il primer, è importante confermare quale area del rRNA 16S migliori amplifica i microbi di interesse per lo studio particolare. Questo protocollo come scritto è per l'amplificazione della regione 16S V4. Se vengono selezionata diversa primer/regione, quindi la temperatura di annealing nel ciclismo termica potrebbe richiedere la modifica.<ol>
<li>Lavorare nella workstation PCR per preparare tutto.</li>
		<li>Prendere 50-100 µ l di campioni di DNA da-20 ° C e tutti i reagenti necessari e li scongelare su ghiaccio. Vortice e brevemente rotazione verso il basso.</li>
		<li>I primers sono pre-diluiti alla concentrazione di lavoro di 5 µM in un volume minimo di 20 µ l.</li>
		<li>Preparare il mix master di PCR nel tubo 5ml specifici con solo il primer in avanti secondo il calcolo del foglio di lavoro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando il manipolatore robotizzato liquido per l'installazione automatica di PCR
	<ol>
<li>Per i campioni, prendere fuori adattatore campione di uno strumento di 32-pozzo e caricare 50-100 µ l di campioni di DNA secondo la mappa di piastra a 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Per ogni piatto PCR, impostare 2 controlli negativi inserendo 30 µ l di acqua PCR in una provetta pulita.</li>
			<li>Posto tutti i campioni su adattatore campione dello strumento 32-pozzo con tappi bloccati in posizione aperta.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per iniettori d'inversione9<ol>
<li>Rimuovere il tappo di ogni primer reverse con codice a barre specifico # s uno alla volta (cambiare i guanti in mezzo per evitare la contaminazione incrociata).</li>
			<li>Inserire un massimo di 32 primer sull'adattatore Reagente dello strumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendete una piastra PCR a 96 pozzetti ed etichettarlo con Studio nome, numero di campioni, data e le iniziali del tecnico.</li>
		<li>Il gestore di liquido robotico di caricamento<ol>
<li>Posizionare l'adattatore reagente B1. Al fine di evitare un effetto contorno, posizionare un bordo dell'adattatore contro il lato di presa e portare lentamente l'altro bordo. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Inserire l'adattatore di campione in posizione C1. Assicurarsi di inserire tutti gli angoli di adattatori.</li>
			<li>Vortice il mix master 5 mL, aprire il tappo e inserirlo nella posizione al blocco dello strumento matrice mix e reagente.</li>
			<li>Posizionare la piastra PCR su adattatore 96 pozzetti dello strumento che è destinato a contenere metà costeggiava piastre PCR.</li>
			<li>Avviare l'esecuzione e salvare come nuovo file.</li>
			<li>Seguire le istruzioni e spunta ogni prompt: uno, i consigli sono disponibili, due, scatola degli scarti è disponibile, e tre, iniziare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, verificare che non siano presenti errori controllando la macchina per i messaggi di errore.</li>
		<li>Sigillare la piastra con i 12 o strip 8 tappi, vortice vigorosamente e spin giù per 1 min utilizzando un filatore piastra a 96 pozzetti e posizionarlo sul ghiaccio o in frigorifero.</li>
		<li>Rimuovere le provette contenenti i campioni e iniettori d'inversione.</li>
		<li>Prendere la piastra a 96 pozzetti per la camera di post-amplificazione e caricare la piastra sul termociclatore e ciclo in base alla tabella delle condizioni termiche-ciclismo (Vedi tabella 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. controllo di qualità Post-PCR 16S mirate utilizzando la piattaforma basata su nastro per elettroforesi del Gel
Nota: Post-PCR (controllo qualità) e tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una determinata area di post-amplificazione del laboratorio. Il DNA viene analizzato in un analizzatore automatico del frammento del DNA/RNA.
<ol><li>
Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
<li>Pulire la workstation spruzzando che decontaminante tutte le superfici in uso con RNAsi, DNasi, DNA, seguita da acqua DI due volte, e, infine, etanolo al 70%.</li>
		<li>Raccogliere tutte le forniture e le attrezzature necessarie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare i reagenti
	<ol>
<li>Tampone del campione posto e scaletta nel Vortex a temperatura controllata a 25 ° C per un minimo di 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mentre i reagenti si scaldano, preparazione di campioni PCR mettendo in comune i 3 repliche PCR per ogni campione in un singolo tubo</li>
	<li>Caricare i campioni sullo strumento.</li>
	<li>Brevemente vortex e centrifugare tubi con pool prodotto di PCR.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti dello strumento su una cremagliera a RT ed etichettarlo.</li>
	<li>Brevemente vortice e spin giù il buffer del campione e la scaletta.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di tampone di campione in ciascun pozzetto della piastra ben 96 (necessità almeno 53 µ l/schermo nastro).</li>
	<li>Eseguire un numero pari di campioni; Se c'è un numero dispari di campioni, è possibile aggiungere 4 µ l di sample buffer in un pozzetto vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di scaletta per una scaletta ben.</li>
	<li>Seguendo la mappa, aggiungere 1 µ l di prodotto PCR riunita al suo designato bene.</li>
	<li>Piastra di copertura con sigillo</li>
	<li>Vortice la piastra utilizzando lo strumento Vortex e adattatore a 2.000 giri/min per 1 min.</li>
	<li>Girare fino a posizione l'esempio nella parte inferiore del tubo, se ci sono bolle spin giù di nuovo.</li>
	<li>Avviare il software.</li>
	<li>Caricare la schermata di caricamento e nastro suggerimenti nello strumento.</li>
	<li>Caricare i campioni nell'analizzatore frammento con un adattatore di 96 pozzetti.</li>
	<li>Impostare una corsa con il software del controller.</li>
	<li>Assicurarsi di selezionare anche numerati pozzi.</li>
	<li>Scrivere ID campione.</li>
	<li>Verifica che tutti i pozzi del nastro schermo sono evidenziati in grigio.</li>
	<li>Assicurarsi che l'analizzatore riconosce tutte le punte di pipetta.</li>
	<li>Selezionare avvia e specificare un nome file per salvare i risultati (Studio nome, numero del campione e data).</li>
	<li>Riferimento alle istruzioni del produttore per maggiori dettagli.</li>
	<li>Dopo che viene completata l'esecuzione, scartare punta, nastro schermo e tubi.</li>
	<li>Analizzare i dati per nM picco 16S (tra 315-450 bp per V4). Questo picco variano a seconda i primers selezionati.</li>
</ol>5. Biblioteca calcolo, pool, Clean-up e QC
<ol><li>Dopo aver determinato la dimensione amplicone e molarità di tutti i campioni, le librerie per raggiungere il volume desiderato finale e nM per la libreria di pool della piscina (Vedi esempio di calcolo).</li>
	<li>Clean-up e concentrato la libreria pool utilizzando una purificazione basati su silice-membrana kit per i prodotti PCR, secondo il produttore di protocollo (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Eluire il DNA con un volume finale di 50 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare la concentrazione della biblioteca pulita immediatamente utilizzando un kit di alta sensibilità DNA incagliato doppio per un fluorimetro, secondo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Diluire 2 µ l della biblioteca in pool e pulita con 198 µ l di tampone di diluizione plus tintura (diluizione 1: 100).</li>
		<li>Registrare il valore misurato dal dispositivo fluorometrica e convertirlo secondo il fattore di diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando la concentrazione (ng / µ l) di lettura per la libreria di pool, calcolare la molarità di biblioteca in nM. Utilizzare 1 µ l non diluito libreria per misurare la OD260/280 su uno spettrofotometro di microvolume. Nota: Un valore di 1.8-2.0 indica purezza adeguata della biblioteca.</li>
	<li>Archiviare la libreria finale a-20 ° C fino al momento per il sequenziamento di nuova generazione.</li>
</ol>

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<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mirato nuova generazione sequenziamento del 16S rRNA è una tecnica ampiamente usata, rapid per microbiome caratterizzazione18. Tuttavia, molti fattori, tra cui effetti di batch, contaminazione ambientale, cross-contaminazione del campione, sensibilità e riproducibilità negativamente possono influenzare i risultati sperimentali e confondere loro interpretazione7,19 , 20. per meglio facilitare 16S robusta a...

Le comunità microbiche che colonizzano gli esseri umani sono credute per essere estremamente importante per la salute umana e la malattia che influenzano il metabolismo, lo sviluppo immune, suscettibilità alla malattia e le risposte alla vaccinazione e farmaco terapia1, 2. gli sforzi per comprendere l'influenza del microbiota sulla salute umana attualmente sottolineano l'identificazione di microbi associati definite compartimenti anatomici (cioè, pelle, intestino, orale, ecc.), così come siti localizzati all'interno questi scomparti3,4. Alla base di questi sforzi investigativi è il rapido emergere e la maggiore accessibilità delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) che forniscono una piattaforma massicciamente parallela per l'analisi del contenuto genetico microbico (microbiome) di un campione. Per molti campioni fisiologici, il microbioma associato è complessa e abbondante (cioè, sgabello), ma, per alcuni campioni, il microbioma è rappresentato dalla biomassa microbica bassa (cioè, latte umano, delle vie respiratorie inferiori) dove sensibilità, manufatti sperimentali e possibili contaminazioni diventano grossi problemi. Le sfide comuni del microbioma studi e appropriato disegno sperimentale sono stati oggetto di più recensione articoli5,6,7,8.
Presentato qui è una robusta pipeline NGS sperimentale basata su mirata sequenza del rRNA 16S V4 regione9 per caratterizzare il microbioma del latte umano. Microbioma analisi del latte umano sono complicato non solo da una biomassa microbica intrinsecamente bassa10, ma inoltre da alta livelli di DNA umano di base11,12,13,14 e riporto potenziale di PCR inibitori15,16 in estratti dell'acido nucleico. Questo protocollo si basa su piattaforme semi-automatizzate che consentono di ridurre la variabilità in batch di preparazione del campione e kit di estrazione disponibile in commercio. Esso incorpora una ben definita comunità batterica finta che viene elaborata insieme agli esempi come un controllo di qualità per convalidare ogni passaggio nel protocollo e fornire una metrica indipendente della robustezza della pipeline. Sebbene il protocollo come descritto è specifico per i campioni di latte umano, è facilmente adattabile ad altri tipi di campione tra cui sgabello, rettale, vaginale, pelle, tamponi areolare e orale10,17e può servire come punto di partenza per i ricercatori che desiderano eseguono analisi microbioma.

<table><tbody><tr><td>Mini kit AllPrep RNA/DNA Kit</td> di <td>estrazione DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80204</td></tr><tr><td>Elimina</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>decontaminante RNasi, DNasi, DNA</td></tr><tr><td>Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vortexer a temperatura controllata</td></tr><tr><td>Buffer RLT più</td><td>tampone di lisi tiocianato di guanidinio Qiagen 1053393/ Parte del kit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Allprep&szlig;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig;-ME è un agente riducente che denatura irreversibilmente le RNasi riducendo i legami disolfuro</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals 116914050</td><td></td><td>tubo a sfere</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>set di adattatori per disgregatori di campioni automatizzati</td></tr><tr><td>QIAshredder colonna</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Provetta</td><td>per microcentrifuga del produttore di</td>provette <td></td><td></td> QIAgen RB in kit</tr><tr><td>QIAcube e relativa plastica</td>, <td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>strumento automatizzato per la purificazione di DNA/RNA,</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td>, <td>soluzione di decontaminazione non enzimatica</td></tr>, <tr><td>EB Buffer</td>, <td>tampone di eluizione</td><td>Qiagen</td><td>19086</td>,</tr><tr><td>QIAgility e relativa plastica</td><td>Qiagen</td><td>9001532</td><td>manipolatore di liquidi robotizzato</td></tr><tr><td>PCR acqua</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Primer inversi con codice a barre</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #</td><td>progettato e ordinato</td></tr><tr><td>piastra PCR a 96 pozzetti</td><td>USA scientifica</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 e relativa plastica</td><td>Analizzatore</td><td>automatico di frammenti di DNA/RNA</td><td>Agilent G2964AA</td></tr><tr><td>Reagenti D1000 per Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Il tampone del campione e la scala fanno parte di questo kit Kit di</td>rimozione dell'inibitore</tr><tr><td>della PCR OneStep</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>La rimozione dell'inibitore della PCR viene eseguita secondo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td> Kit di purificazione del DNA <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: purificazione basata su membrana di silice dei prodotti PCR</td></tr><tr><td>Kit di analisi HS Qubit dsDNA Il tampone</td> di <td>diluizione a base di dimetilsolfossido Thermo Fisher Q32854 e il colorante fanno parte di questo kit.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorimeter</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>spettrofotometro per microvolumi</td></tr><tr><td>Kit MiSeq 300 V2</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td></td><td>Illumina No Catalog #</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per il sequenziamento del 16s mirato di campioni di latte umano

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studi delle comunità microbiche sono diventati diffusi con lo sviluppo di sequenziamento relativamente poco costoso, rapido e di alta. Tuttavia, come con tutte queste tecnologie, risultati riproducibili dipendono da un flusso di lavoro di laboratorio che incorpora controlli e precauzioni appropriate. Ciò è particolarmente importante con i campioni di basso-biomassa dove la contaminazione di DNA batterico può generare risultati fuorvianti. Questo articolo descrive in dettaglio un semi-automatico del flusso di lavoro per identificare i microbi da campioni di latte materno umano mediante sequenziamento mirato della regione 16S RNA ribosomiale (rRNA) V4 su una scala di basso - medio throughput. Il protocollo descrive la preparazione del campione da latte intero compreso: campione Lisi, estrazione di acidi nucleici, amplificazione della regione V4 del gene del rRNA 16S e preparazione di libreria con misure di controllo di qualità. D'importanza, il protocollo e la discussione considerare questioni che sono salienti per la preparazione e l'analisi di campioni di basso-biomassa tra cui adeguati controlli positivi e negativi, rimozione di inibitore PCR, contaminazione del campione di ambientale, reagente, o fonti sperimentali e progettati per garantire la riproducibilità sperimentale procedure consigliate. Mentre il protocollo come descritto è specifico di campioni di latte umano, è adattabile a numerosi tipi di campioni di biomassa bassa e alta, compresi i campioni raccolti su tamponi, congelati pura, o stabilizzato in un buffer di conservazione.

Il protocollo presentato qui include passaggi importante controllo qualità (QC) per assicurarsi che il soddisfare di dati generati i valori di riferimento per il controllo di sensibilità, specificità e contaminazione di protocollo. Primo passo QC del protocollo segue l'amplificazione di PCR della regione 16S V4 (Figura 2). Un µ l del prodotto PCR di ogni campione è stato analizzato tramite l'elettroforesi per confermare che era all'interno della gamma di dime...

Un flusso di lavoro semi-automatizzato è presentato per mirati sequenziamento del 16S rRNA da latte umano e altri tipi di campioni di basso-biomassa.

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di amplificare 16 SRRNA da latte materno e altri campioni a bassa biomassa utilizzando un protocollo semi-automatizzato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo e nelle perturbazioni del microbioma umano in relazione sia alla salute che alla malattia. Il vantaggio principale della tecnica è che è semi-automatizzata, relativamente facile da eseguire e adattabile a più tipi di campioni, tra cui secrezione, tamponi e feci.Dopo lo scongelamento e l'assegnazione del latte intero secondo il protocollo di testo, centrifugare i campioni a 5000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le cellule. Utilizzare una spatola di plastica o un puntale per pipetta di grande diametro per rimuovere lo strato di grasso superiore. Quindi, senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il surnatante, ad eccezione di 100 microlitri.Con un millilitro di PBS, risospendere e lavare il pellet. Quindi preparare un controllo negativo aggiungendo un millilitro di PBS sterile a una provetta da cinque millilitri. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga pulita da un punto da cinque millilitri e farla girar

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Caratterizzare la comunità microbica è stato un obiettivo di lunga data nella microbiologia ambientale. I metodi di sequenziamento di nuova generazione consentono ora la caratterizzazione delle comunità microbiche a una profondità senza precedenti, con costi e manodopera minimi. Descriviamo qui il nostro approccio al sequenziamento dei geni dell'RNA ribosomiale batterico 16S utilizzando un sequenziatore da banco.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Il latte è una fonte primaria di nutrimento per il neonato. L'analisi dei componenti del latte può fornire informazioni sui fattori materni che influenzano la salute della prole. Questo protocollo descrive un metodo manuale per raccogliere campioni di latte dal ratto in allattamento, che possono quindi essere utilizzati per ulteriori analisi a valle.

Milk Collection nella Rat Utilizzando tubi capillari e stima di tenore di materia grassa per Creamatocrit

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Descriviamo qui il rilevamento ad alta velocità e la quantificazione degli oligosaccaridi del latte umano fucosylated (HMOs) utilizzando un biosensore di cellule intere. Inoltre dimostriamo qui, l'adattamento di questa piattaforma nei confronti di ceppi di produzione HMO, concentrandosi sul miglioramento del rapporto segnale-rumore.

Analisi di Fucosylated Human latte trisaccaridi nel contesto biotecnologica utilizzando geneticamente codificato biosensori

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

Questo articolo descrive come assemblare un dispositivo che può essere utilizzato per raccogliere il latte dai topi da laboratorio. Questo dispositivo è economico, portatile e consente la raccolta di 0,1-0,5 ml di latte da parte di una persona addestrata. È incluso anche un protocollo di mungitura dettagliato.

Un'efficiente tecnica per una sola persona per il campionamento del latte da topi da laboratorio

L'articolo descrive un protocollo per ricostituire il microbiota del latte donato pastorizzato utilizzando il microbiota del latte materno in contesti pratici e reali. Dimostra un'efficace crescita batterica e modulazione del microbioma, supportando l'applicazione fattibile di questa procedura all'interno delle cure di routine di un ospedale di maternità e della banca del latte umano associata.

Ricostituzione individualizzata del microbiota del latte umano: un approccio fattibile in contesti del mondo reale

Questo protocollo è progettato per accelerare e consentire l'isolamento efficace delle vescicole extracellulari dal latte materno umano con elevata purezza.

Isolamento rapido di vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano

Questo protocollo consente una valutazione rapida ed economica della composizione microbica nei prodotti lattiero-caseari combinando la culturromica con MALDI-TOF MS. Fornisce risultati di tassonomia paragonabili al sequenziamento dell'rRNA 16S con un tempo di risposta più breve rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Impara il sequenziamento mirato del 16S rRNA da campioni di latte umano a basso biomassa con un protocollo semi-automatizzato. Questo metodo facilita lo studio del microbioma umano e le sue implicazioni per salute e malattia.

Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

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