Un metodo per il sequenziamento del 16S mirato di campioni di latte umano

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di amplificare 16 SRRNA da latte materno e altri campioni a bassa biomassa utilizzando un protocollo semi-automatizzato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo e nelle perturbazioni del microbioma umano in relazione sia alla salute che alla malattia. Il vantaggio principale della tecnica è che è semi-automatizzata, relativamente facile da eseguire e adattabile a più tipi di campioni, tra cui secrezione, tamponi e feci.

Dopo lo scongelamento e l'assegnazione del latte intero secondo il protocollo di testo, centrifugare i campioni a 5000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare le cellule. Utilizzare una spatola di plastica o un puntale per pipetta di grande diametro per rimuovere lo strato di grasso superiore. Quindi, senza disturbare il pellet, rimuovere tutto il surnatante, ad eccezione di 100 microlitri.

Con un millilitro di PBS, risospendere e lavare il pellet. Quindi preparare un controllo negativo aggiungendo un millilitro di PBS sterile a una provetta da cinque millilitri. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga pulita da un punto da cinque millilitri e farla girare a 5000 volte G a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi utilizzare un puntale per pipetta filtrato sterile da 1000 microlitri per scartare l'intero strato di grasso surnatante. Per disgregare e omogeneizzare il campione, aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi contenente beta mercaptoetanolo al pellet e trasferire la sospensione in un tubo a perline. Preparare un controllo positivo con tampone di lisi e 20 microlitri del campione di simulazione batterica.

Agitare energicamente tutti i tubi delle perline per 15 secondi. Quindi riscaldare i campioni su un vortice a temperatura controllata a 37 gradi Celsius e da 700 a 800 giri/min per 10 minuti. Caricare le provette nel set di adattatori per disgregatori automatici del campione.

Quindi battere i campioni a 30 hertz per un minuto. Smontare il set di adattatori e commutarlo manualmente con le piastre del campione dal braccio robotico sinistro al braccio robotico destro dello strumento. Perlina battere le provette a 30 hertz per un altro minuto, quindi centrifugare le provette a 17, 200 volte G e 25 gradi Celsius per tre minuti.

Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere tutto il surnatante, facendo attenzione a non prelevare lo strato di grasso nella parte superiore o i residui di perline nella parte inferiore del campione. Applicare il surnatante alle colonne dell'omogeneizzatore. Quindi centrifugare le colonne alla massima velocità e 25 gradi Celsius per tre minuti.

Trasferire 350 microlitri di eluido in una provetta da microcentrifuga da due millilitri del produttore. Per isolare il DNA secondo il protocollo di testo, tagliare i coperchi e levigare i bordi delle singole colonne di spin per DNA e RNA. Inserire la colonna di centrifuga del DNA senza la provetta di raccolta nell'adattatore del rotore.

Quindi gettare la provetta di raccolta. Quindi, inserire le provette da due millilitri vortex in un agitatore, seguendo la tabella di carico dello strumento di purificazione automatizzato del DNA/RNA secondo le istruzioni del produttore. Etichettare le provette di raccolta da cinque millilitri e inserirle negli adattatori del rotore.

Quindi posizionare gli adattatori del rotore nella centrifuga seguendo il diagramma di caricamento dello strumento di purificazione automatizzato del DNA/RNA. Dopo aver inserito i puntali del filtro, l'acqua priva di RNasi e i reagenti nel blocco reagenti dello strumento, chiudere il coperchio dello strumento ed eseguire il programma di purificazione del DNA personalizzato sullo strumento. Al termine della reazione, raccogliere il campione contenente le provette dall'agitatore e, se rimane del campione, conservarlo a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Dopo aver preparato l'area di lavoro e la miscela master PCR, secondo il protocollo di testo, caricare da 50 a 100 microlitri di campioni di DNA in un adattatore per campioni di strumenti a 32 pozzetti, seguendo la mappa della piastra a 96 pozzetti. Per ogni piastra PCR, impostare due controlli negativi pipettando 30 microlitri di acqua PCR in una provetta di raccolta pulita da cinque millilitri. Quindi posizionare tutti i campioni sull'adattatore per campioni dello strumento a 32 pozzetti con i tappi bloccati in posizione aperta.

Sull'adattatore per reagenti dello strumento, rimuovere il tappo di ciascun innesco inverso con numeri di codice a barre specifici uno alla volta. Per caricare il manipolatore robotizzato di liquidi, posizionare l'adattatore per reagenti in posizione B1.In modo da evitare l'effetto bordo, posizionare con cautela un bordo dell'adattatore contro il lato dell'impugnatura e abbassare lentamente l'altro bordo. Assicurati di spingere su tutti gli angoli degli adattatori.

Posizionare l'adattatore del campione in posizione C1, assicurandosi di spingere su tutti gli angoli degli adattatori. Quindi agitare la miscela master da cinque millilitri. Aprire il tappo e posizionarlo in posizione A sulla miscela master e sul blocco reagenti dello strumento.

Posizionare la piastra PCR sull'adattatore dello strumento a 96 pozzetti che ha lo scopo di contenere piastre PCR a metà bordo. Quindi avvia l'esecuzione e salvala come nuovo file. Al termine dell'esecuzione, verificare che non siano stati presenti errori.

Quindi utilizzare 12 o otto tappi a strisce per sigillare la piastra. Agitare energicamente e utilizzare una centrifuga per piastre a 96 pozzetti per far girare le piastre per un minuto. Infine, posizionare la piastra sul ghiaccio fino a quando non viene spostata nella sala di post amplificazione e caricata sul termociclatore.

Dopo l'amplificazione PCR, eseguire il controllo di qualità e la preparazione della libreria secondo il protocollo di testo. La prima fase di controllo qualità del protocollo segue l'amplificazione PCR della regione 16SV4. Come mostrato qui, un microlitro di prodotto PCR da ciascun campione è stato analizzato mediante elettroforesi per confermare che rientrava nell'intervallo di dimensioni previsto da 350 a 450 coppie di basi.

Alcuni campioni di latte umano hanno generato quantità inferiori di prodotto specifico, suggerendo bassi livelli di DNA microbico estratto in quei campioni o il carryover di inibitori della PCR durante l'estrazione. La quantificazione del prodotto specifico per ciascun campione è stata essenziale per determinare il volume richiesto per un pool molare uguale di campioni per il sequenziamento. Una libreria in pool per il sequenziamento mirato è solitamente dominata da uno specifico prodotto PCR.

Se nella libreria è presente una quantità significativa di prodotto non specifico, è necessario aggiungere al flusso di lavoro una fase di purificazione del gel. I risultati del sequenziamento dimostrano un'elevata diversità nei taxa associati al microbioma del latte umano e la variabilità nel numero di conteggi dei reed di sequenziamento per ciascun campione. Al contrario, la composizione dei taxa e il conteggio delle canne per la simulazione batterica erano paragonabili ai risultati ottenuti per la simulazione in precedenti esecuzioni del flusso di lavoro, suggerendo che la variabilità osservata per i campioni di latte umano è un risultato sperimentale autentico e non una funzione della variabilità intrinseca del flusso di lavoro.

Se si lascia un sequenziatore in funzione durante la notte, questa tecnica può essere eseguita in due giorni, da 12 a 24 campioni, se tutti i campioni si amplificano nell'esecuzione iniziale della PCR. In caso contrario, è necessario un altro giorno di shell. Quando si tenta questa procedura, è importante viaggiare solo dall'area pre-PCR all'area post-PCR per evitare contaminazioni.

È inoltre fondamentale cambiare frequentemente i guanti per evitare qualsiasi contaminazione incrociata. Non dimenticare che lavorare con campioni umani può essere pericoloso e che è necessario utilizzare sempre precauzioni, come dispositivi di protezione adeguati e cappe di sicurezza biologica.