Misura simultanea di perossido di idrogeno/del superossido e produzione di NADH di Flavin-contenente deidrogenasi mitocondriale
24 febbraio 2018
I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell'ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare il tasso di produzione di superossido/perossido di idrogeno e NADH delle deidrogenasi mitocondriali purificate contenenti flavina utilizzando la fluorimetria su micropiastra. I mitrocondri possono contenere fino a 12 diversi siti di formazione di superossido/perossido di idrogeno che sono stati identificati utilizzando diverse combinazioni di substrato e inibitori con mitocondri isolati. Tuttavia, permangono ancora alcune difficoltà per quanto riguarda la quantificazione accurata della capacità di rilascio dei singoli siti di produzione in mitocondri isolati.
E questo è associato a reazioni collaterali indesiderate che producono anche specie reattive dell'ossigeno, ma anche alla presenza di antiossidanti e all'uso di inibitori che mancano di specificità oltre all'uso di additivi che possono interferire con le misurazioni. Qui presentiamo il metodo per la misura simultanea della produzione di superossido/perossido di idrogeno e NADH da parte di deidrogenasi mitocondriali purificate flavina-dipendenti. Questo metodo è vantaggioso in quanto può consentire la quantificazione diretta e accurata del potenziale di produzione di ROS dei singoli siti di produzione, eliminando le reazioni collaterali indesiderate e qualsiasi sistema di estinzione delle specie reattive dell'ossigeno.
La misurazione simultanea della produzione di ROS e NADH consente anche un confronto diretto del potenziale di formazione di superossido/perossido di idrogeno e dell'attività dei singoli enzimi, che possono essere preziosi per lo screening degli inibitori per la produzione di ROS prima di condurre saggi con i mitocondri. Per i nostri scopi qui, utilizzeremo come esempi il complesso della piruvato deidrogenasi e il complesso dell'alfa-chetoglutarato deidrogenasi di origine cardiaca suina. Entrambi sono enzimi contenenti flavina e fonti note per le specie reattive dell'ossigeno.
Inoltre, questi due enzimi possono essere facilmente purificati. La misurazione simultanea del superossido/perossido di idrogeno e del NADH si ottiene tracciando le variazioni della fioritura. Il NADH ha le sue proprietà intrinseche di florescenza che consentono una facile misurazione della sua produzione.
Le variazioni del superossido/perossido di idrogeno richiedono nel frattempo la superossido dismutatasi, la perossidasi di rafano e il reagente ultrarosso amplex. In presenza di perossidasi di rafano e perossido di idrogeno, l'amplex ultrared viene convertito da molecola non fluorescente a resorufina fluorescente. La superossido dismutasi assicura che qualsiasi superossido formato dalla deidrogenasi in studio venga convertito in perossido di idrogeno.
Prima di impostare il test, vengono preparate le soluzioni funzionanti. Per semplificare il test, tutti i reagenti vengono aggiunti ai pozzetti di una piastra nera da 96 pozzetti in aliquote da 20 microlitri. Il volume per ogni reazione nel pozzetto è di 200 microlitri, quindi le soluzioni di lavoro sono 10 volte la concentrazione trovata nel pozzetto di reazione.
Successivamente, programmare il lettore di micropiastre per eseguire un saggio cinetico per la doppia misurazione dell'autoflorescenza del NADH e della risororescenza della resorufina. Questo viene fatto selezionando prima Procedura e impostandola a 25 gradi Celsius. Quindi, fai clic su Avvia Kinetic.
Impostare il tempo di esecuzione per circa cinque minuti, seguito dalla selezione di un intervallo di lettura fluorescente di 30 secondi. Quindi, fare clic su Leggi e impostare i parametri di misurazione della fluorescenza per il test. Qui vengono inserite nel software la posizione della sonda, le lunghezze d'onda utilizzate per tracciare le variazioni della fioritura e i pozzetti che verranno letti.
Vengono selezionati anche i diversi canali per le letture fluorescenti, uno dei quali è dedicato all'autoflorescenza del NADH, che è impostata su un'eccitazione di 376 nanometri e lunghezze d'onda di emissione di 450 nanometri. I cambiamenti nella florirescenza della resorufina sono tracciati a 565 nanometri e 600 nanometri. Una volta impostate le condizioni di analisi, i singoli pozzetti vengono caricati con tampone e diversi reagenti necessari per misurare contemporaneamente la produzione di NADH e di superossido/perossido di idrogeno.
L'ordine per il caricamento dei pozzetti con diversi reagenti è il seguente. Innanzitutto, la quantità necessaria di tampone viene aggiunta al pozzetto, seguita dall'aggiunta di 20 microlitri di soluzione enzimatica purificata. L'enzima viene bilanciato nel tampone per alcuni minuti all'interno dello strumento.
Quindi, i reagenti rimanenti vengono aggiunti nell'ordine seguente. Una volta aggiunto il supporto di stampa, premere Start. Il portatarga entrerà nel lettore e verrà avviato il protocollo.
Durante il saggio, i risultati in tempo reale per le unità fluorescenti relative grezze, o RFU, possono essere tracciati utilizzando il software. L'utente può passare da una lettura fluorescente all'altra utilizzando la scheda Dati sopra il layout del pozzetto. Si noti che è possibile selezionare le curve per le diverse letture fluorescenti.
Inoltre, tenendo premuto Control sulla tastiera e facendo clic con il tasto sinistro del mouse sui pozzetti, si può ottenere un grafico composito che consente il confronto in tempo reale delle diverse reazioni. Al termine dell'esperimento, il supporto della micropiastra uscirà dallo strumento. A questo punto, i risultati nel grafico rappresentativo delle modifiche in RFU vengono esportati in Excel.
I valori RFU grezzi vengono esportati facendo prima clic su Dati nel grafico RFU rappresentativo. Questo produrrà una tabella dei valori grezzi di RFU per NADH e resorufina in fiore. Non che i numeri grezzi di RFU corrispondenti a variazioni della fioritura di NADH o resorufina non possano essere esportati contemporaneamente.
Una volta esportati, i risultati vengono organizzati per l'analisi. Utilizzando le curve standard per la fioritura di NADH e resorufina generate prima di condurre il test, è possibile calcolare la quantità di NADH nella micromole e di superossido/perossido di idrogeno nel picomolo formata nel tempo. A questo può seguire il calcolo del tasso di produzione di NADH e superossido/perossido di idrogeno.
Per questa procedura, è fondamentale verificare la purezza della deidrogenasi isolata contenente flavina prima di condurre i saggi. Ciò può essere ottenuto conducendo una semplice colorazione di coomassie per le proteine o dosando l'attività dell'enzima in presenza di diversi substrati. Si noti che si consiglia di omettere dal test agenti riducenti come il DTT poiché può fungere da substrato per la produzione di superossido/perossido di idrogeno da parte delle deidrogenasi legate alla flavina.
Nel complesso, questo metodo è altamente flessibile in quanto può essere utilizzato per lo screening di inibitori per la produzione di superossido/perossido di idrogeno e consente anche un confronto diretto della capacità di formazione di ROS di diverse deidrogenasi mitocondriali legate alla flavina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione approfondita di come misurare la produzione di ROS e NADH da parte delle deidrogenasi purificate. Questo test può fungere da trampolino di lancio per esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per quantificare i tassi di produzione di superossido/perossido di idrogeno e di NADH da deidrogenasi mitocondriali purificate contenenti flavina, mediante fluorimetria in micropiastre. Il metodo affronta le difficoltà nella misurazione del rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da singoli siti mitocondriali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica clinica
- Biologia mitocondriale
Sfondo
- I mitocondri contengono diversi enzimi dipendenti dalle flavine che generano ROS.
- La quantificazione accurata del rilascio di ROS da singoli siti è difficile.
- Reazioni collaterali indesiderate e la presenza di antiossidanti complicano le misurazioni.
- Sono state utilizzate diverse combinazioni di substrati e inibitori per identificare i siti di produzione di ROS.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la misurazione simultanea della produzione di superossido/perossido di idrogeno e NADH.
- Eliminare reazioni collaterali indesiderate nella quantificazione delle ROS.
- Fornire una valutazione diretta del potenziale di produzione di ROS nei siti mitocondriali.
Metodi Utilizzati
- Sono state utilizzate deidrogenasi mitocondriali dipendenti da flavina purificate.
- Per le misurazioni è stata impiegata la fluorometria in microplacca.
- È stata eseguita la quantificazione simultanea di superossido/perossido di idrogeno e NADH.
- Sono stati utilizzati inibitori e substrati specifici per valutare i singoli siti di produzione.
Risultati principali
- Il metodo consente una quantificazione accurata dei tassi di produzione di ROS.
- Le reazioni collaterali indesiderate sono state efficacemente ridotte al minimo.
- I singoli siti di produzione di ROS sono stati valutati con successo.
- L'approccio fornisce una comprensione più chiara della dinamica mitocondriale dei ROS.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la capacità di studiare la produzione mitocondriale di ROS.
- Offre uno strumento affidabile per i ricercatori che indagano sulla funzione mitocondriale.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per la comprensione dello stress ossidativo nelle cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione accurata della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da singoli enzimi mitocondriali è fondamentale per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci correlati allo stress ossidativo. Questo metodo consente un confronto diretto tra la formazione di ROS e l'attività enzimatica, supportando la riduzione del rischio meccanicistica per gli obiettivi delle deidrogenasi legate alla flavina. Eliminando sistemi antiossidanti interferenti e reazioni secondarie, il metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva per lo screening di inibitori, prima di eseguire saggi mitocondriali o cellulari più complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando i tassi di rilascio nativi di ROS da deidrogenasi dipendenti da flavina purificate.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante la misurazione diretta di superossido/perossido di idrogeno e della produzione di NADH da singoli siti enzimatici.
- Valore predittivo: Permette il triage del portafoglio consentendo lo screening della selettività e dell'efficacia degli inibitori sulla produzione di ROS prima di eseguire saggi mitocondriali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del Saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi fornendo letture quantitative standardizzate di ROS e NADH.
- Riproducibilità: Utilizza la fluorometria in microtitratore con lunghezze d'onda definite di eccitazione/emissione (NADH: 376/450 nm; resorufina: 565/600 nm) per un rilevamento del segnale costante.
- Scalabilità: Consente lo screening ad alto rendimento di inibitori mediante formato a piastra 96 pozzetti con volumi di reazione di 200 microlitri.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Funge da passo intermedio verso esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati o fibre muscolari permeabilizzate, stabilendo relazioni di base tra ROS ed enzimi.
- Sistema rilevante per le malattie: Utilizza il complesso della piruvato deidrogenasi (PDHC) e il complesso della alfa-chetoglutarato deidrogenasi (KGDHC) derivati dal cuore di suino come modelli per le fonti mitocondriali di ROS rilevanti per le malattie metaboliche e cardiovascolari.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce se le variazioni osservate nei ROS derivino dall'attività dell'enzima bersaglio o da effetti fuori bersaglio o da interferenze con gli antiossidanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto guida, fornendo dati quantitativi su ROS e attività che orientano le decisioni di proseguimento o interruzione prima di passare a modelli fenotipici complessi o preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando la produzione di ROS da specifiche deidrogenasi legate ai flavinici, riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'analisi dei percorsi metabolici.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio mediante la rilevazione standardizzata e simultanea dell'autofluorescenza di NADH e della fluorescenza di resorufina, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Produce risultati quantitativi (NADH in micromoli, superossido/perossido di idrogeno in picomoli nel tempo) che permettono il calcolo dei tassi di produzione per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica definendo i tassi di rilascio nativi di ROS per singoli enzimi prima dei test in sistemi mitocondriali integri.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di enzimi dipendenti dai flavinici in diversi progetti, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'attribuzione delle fonti di specie reattive dell'ossigeno (ROS).
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso un ordine definito dei reagenti, impostazioni cinetiche e separazione dei canali di fluorescenza.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo lo screening precoce di inibitori, riducendo i fallimenti in fasi avanzate dovuti a tossicità mediate da ROS non previste.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio quantificando il potenziale di produzione di ROS dei singoli siti enzimatici, informando le decisioni di selezione e avanzamento degli obiettivi.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella purificazione enzimatica e nell'allestimento di saggi fluorometrici, inclusa la validazione della purezza della deidrogenasi contenente flavina mediante colorazione con coomassio o saggi di attività.
- Richiede un lettore di micropiastre in grado di effettuare letture cinetiche a doppia lunghezza d'onda (376/450 nm per NADH, 565/600 nm per resorufina) con controllo della temperatura a 25°C.
- Necessita dell'esclusione di agenti riducenti come il DTT, che possono agire come substrati per la produzione di superossido/perossido di idrogeno e alterare i risultati.
- Richiede la preparazione di soluzioni operative a concentrazione 10x a causa del volume finale di 200 microlitri ottenuto da aliquote di 20 microlitri in piastre a 96 pozzetti.
- Comporta limitazioni pratiche, come la necessità di utilizzare la superossido dismutasi per convertire il superossido in perossido di idrogeno, al fine della rilevazione mediante sistema amplex ultrared/perossidasi da rafano.
