Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

L'obiettivo generale di questa procedura è stimare le cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta e negli xenotrapianti derivati da pazienti mediante citometria a flusso alla diagnosi e al follow-up del trattamento. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'ematologia/oncologia, come la rilevanza clinica della valutazione quantitativa delle cellule staminali leucemiche mediante citometria a flusso nella leucemia mieloide acuta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è applicabile alla maggior parte dei laboratori di ematologia/oncologia con anticorpi di uso comune.

Questa procedura sarà dimostrata da Thomas, un post-doc, Fanny, una studentessa laureata, e Adeline, un ingegnere del mio laboratorio. Per iniziare, raccogliere due millilitri di midollo osseo da LMA de novo in provette contenenti 1,8 milligrammi per millilitro di EDTA anticoagulante. Isolare le cellule mononucleate dai globuli rossi e dai granulociti diluendo prima il midollo osseo in tre volumi di PBS.

Quindi, sovrapporre con cura un volume di ficol con un volume di midollo osseo diluito. Centrifugare il gradiente di densità a 300 g per 30 minuti senza interruzioni. Quindi, trasferire lo strato bianco di buffy coat di cellule mononucleate in una nuova provetta sterile.

Per rimuovere i surnatanti che contaminano i componenti del siero, aggiungere 10 millilitri di PBS e centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti prima di ripetere il lavaggio. Lisi i globuli rossi aggiungendo due millilitri di tampone di lisi al pellet cellulare e agitare delicatamente. Quindi, incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti.

Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Quindi, usa il PBS per lavare le cellule. Dopo aver isolato le cellule blastiche dal midollo osseo secondo il protocollo di testo, sotto una cappa a flusso laminare, inserire un topo NSG non condizionato in un dispositivo di contenimento e iniettare cinque volte 10 alla sesta cellula blastica AML nella vena caudale.

Riportare il topo in una gabbia ventilata individuale in condizioni convenzionali e specifiche prive di agenti patogeni. Ogni due settimane, utilizzare un metodo di raccolta sottomandibolare con un capillare dell'ematocrito per prelevare 60 microlitri di sangue. Trasferire il capillare in una provetta da cinque millilitri, quindi con una garza sterile, applicare una leggera pressione per fermare l'emorragia.

Aggiungere un millilitro di tampone di lisi al tubo e agitare delicatamente. Quindi, incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare le celle a 300 g per cinque minuti.

Quindi, dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 100 microlitri di PBS con il 10% di BSA, tre microlitri di FITC CD45 anti-umano, incubare per 30 minuti. Quindi, lavare il pellet cellulare due volte in PBS, due millilitri, con il 10% di BSA e centrifugare a 300 g per cinque minuti. Ogni due settimane, utilizzare la citometria a flusso per analizzare l'attecchimento mediante analisi chimerica dell'espressione di CD45 umana rispetto a quella murina.

Quando la conta blastica è superiore al 70% o si osservano gravi segni clinici di malattia, sacrificare l'animale e raccogliere cellule blastiche mononucleate da una milza schiacciata e dal midollo osseo utilizzando la PBS per lavare tibie e femori come descritto in precedenza. Per eseguire la colorazione del pannello, combinare gli anticorpi coniugati con campioni di xenotrapianto umano primario o derivato da paziente, o PDX, e agitare le provette. Quindi, incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15-30 minuti.

Rimuovere gli anticorpi non legati utilizzando due millilitri di PBS per lavare le cellule. Risospendere le cellule in 450 microlitri di PBS, quindi procedere all'analisi della citometria a flusso e al monitoraggio MRD. Per valutare in modo accurato e riproducibile la membrana dei marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso, verificare l'allineamento ottico.

La corretta messa a punto del sistema 3D e la sensibilità ottica e la stomatizzazione utilizzando la calibrazione della stomazina battono ogni giorno. Utilizzare il midollo osseo normale per impostare i cancelli per il CD38. Sono necessari un minimo di 500.000 eventi e viene verificato che ogni flusso sia regolare e omogeneo.

Inoltre, vengono eliminati i doppietti, le cellule morte e i detriti cellulari. Le cellule ematopoietiche immature sono definite dall'essere CD45 intermedio, SSC basso. E il controllo CD38 positivo, o ematogoni, sono CD19/CD38 doppio positivo.

Quindi vengono definiti P8 o CD38 positivi, P7 o CD38 intermedio e P6 o CD38 negativo. Le cellule P6 possono essere ulteriormente suddivise in HSC, MPP e LSC. Trattandosi di un midollo osseo normale, è LSC negativo.

Utilizzando la citometria a flusso multiparametrica, è stato riscontrato che la frazione blastica CD34 positiva e CD38 negativa era più alta in PDX rispetto al campione diagnostico di paziente. È interessante notare che una percentuale più elevata di LSC putativa è stata trovata nel PDX rispetto al campione primario di pazienti, suggerendo un possibile arricchimento di cellule progenitrici maligne nei tessuti ematologici in questo modello murino. Al confronto delle popolazioni progenitrici dei blasti in due diversi campioni di pazienti, la frazione CD34 positiva e CD38 negativa è aumentata dallo 0,06% alla diagnosi al 3,33% al primo follow-up del trattamento nel primo paziente.

Al contrario, la frazione CD34 positiva e CD38 negativa è diminuita nel secondo paziente dal 7,8% alla diagnosi al 2,27% al primo follow-up del trattamento. Di conseguenza, la frazione putativa di LSC è aumentata nel primo paziente dallo 0% alla diagnosi allo 0,65% ed è diminuita nel secondo paziente dal 6,57% alla diagnosi all'1,44% al follow-up del trattamento. Il monitoraggio della malattia minima residua o MRD, utilizzando come marcatori molecolari la mutazione NPM1 nel primo paziente e la fusione genica CBF-beta MYH11 per il secondo paziente, ha dimostrato che la MRD molecolare è diminuita meno nel primo paziente rispetto al secondo paziente per il primo follow-up del trattamento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante questa procedura, è importante verificare le impostazioni della citofluorimetria e la misurazione del CD38. Dopo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi, come la selezione citofluorimetrica delle cellule per rispondere a ulteriori domande come la valutazione funzionale delle cellule staminali della leucemia.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come rilevare e quantificare le cellule staminali leucemiche in campioni di pazienti in xenotrapianti derivati da pazienti. Non dimenticare che lavorare con i campioni dei pazienti può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come le linee guida GOP e le procedure di sicurezza istituzionali.