Name: Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri come stimare le cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato mediante citometria a flusso. Questo metodo è applicabile nella maggior parte dei laboratori di ematologia/oncologia.

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Questo lavoro è stato supportato in parte il francese Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (centro nord), Fondation de France (Comitato di leucemia), Oncolille SIRIC e francese National Cancer Institute.

Seguiamo gli standard europei per l'uso di animali per scopi scientifici. Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (n. 3097-2015120414583482v3).
1. preparazione del campione
<ol><li>Raccogliere midollo osseo (2 mL) da de novo AML in provette contenenti l'acido etilendiamminotetracetico dell'anticoagulante (EDTA) ad una concentrazione di 1,8 mg / mL di midollo osseo.</li>
	<li>Eseguire Ficoll separazione, una separazione di gradienti di densità per isolare le cellule mononucleari da globuli rossi e granulociti, come seguito. Diluire il midollo osseo in 3 volumi di soluzione salina tampone fosfato (PBS: 137mm NaCl, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Attentamente sovrapposizione 1 volume di Ficoll con 1 volume di diluito del midollo osseo. Rotazione di 30 minuti a 300 x g senza freno. Trasferire lo strato bianco del cappotto buffy di cellule mononucleate in una nuova provetta sterile.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte in 10 mL di PBS) e centrifugare a 300 x g per 5 min, al fine di rimuovere contaminanti componenti del siero.</li>
</ol>2. lisi dei globuli rossi (RBC)
<ol><li>Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (cloruro di ammonio 0,8%) alla cella a pellet, vortice delicatamente ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Nota: se necessario, ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Celle di lavaggio in PBS come precedentemente descritto (1.3.).</li>
</ol>3. paziente derivato xenotrapianti.
<ol><li>Ottenere le cellule di scoppio dal midollo osseo dopo la separazione Ficoll e dopo lo svuotamento di linfociti utilizzando immunomagnetica negativa selezione (CD3 per T- e CD20 per B-linfociti). Seguire le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Iniettare le cellule di scoppio di 5 x 106 AML nella vena caudale dei topi NSG incondizionati. Utilizzare un dispositivo trattenente per facilitare l'iniezione della vena della coda. Tenere topi in condizioni convenzionali e soprattutto nelle circostanze specifiche-patogeno-senza affatto volte, utilizzando gabbie individuali ventilate e da manipolazione sotto cappa a flusso laminare. Ogni due settimane, prendere 60 µ l di sangue con il metodo di raccolta sottomandibolare utilizza un ematocrito capillare. Posto il capillare in un 5 mL fondo tubo tondo. Arrestare l'emorragia applicando leggera pressione utilizzando un tampone di garza sterile piccola. Expulse sangue con una siringa pulita.</li>
	<li>Aggiungere 1ml di tampone di lisi e incubare per 5min. Poi Centrifugare a 300 x g per 5 min. lavaggio con PBS e centrifugre a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, aggiungere 100 µ l PBS con 10% albumina di siero bovino (BSA) macchia con 3 µ l anti-CD45-FITC e anti-murino 1 µ l CD45-APC e incubare per 30 minuti a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare il pellet cellulare due volte in PBS (2 mL) con 10% BSA e centrifugare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Aliquota fino a 1 x 106 cellule per 100 µ l di PBS in tubi di citometria a flusso.</li>
	<li>Indagine engraftment ogni due settimane da analisi di chimerism di espressione di CD45 (umano e murino) mediante citometria a flusso (Figura 2A e B).</li>
	<li>A sacrifice (conteggio periferico esplosione superiore al 70% o gravi segni clinici di malattia), raccogliere le cellule mononucleari di scoppio dalle milze schiacciate e dal midollo osseo irrigando tibie e femori con PBS come precedentemente descritto13. Eutanasia topi di dislocazione cervicale seguendo linee guida internazionali.</li>
	<li>Se il pellet cellulare contiene RBC, eseguire la lisi dei globuli rossi con buffer di lisi (punto 2.1).</li>
	<li>Lavare le cellule pallina due volte in PBS (2 mL) con 10% BSA e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Raccogliere le cellule e aliquota fino a 1 x 106 cellule per 100 µ l di PBS in tubi di citometria a flusso.</li>
</ol>4. colorazione
<ol><li>Aggiungere vortice e anticorpi coniugati (cfr. punto 4.2). Incubare le cellule per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzare il seguente pannello per umano primario o campioni PDX composto da 10 µ l di anti-CD36-FITC, 5 µ l di anti-CD19-ECD, 5 µ l di anti-CD33-PC5.5, 5 µ l di anti-CD90-APC, 5 µ l di anti-CD34-AA700, 5 µ l di anti-CD45RA-APC-H7, 5 µ l di anti-CD38-Pacific Blue, 5 µ l di anti-CD123-PC7 e 2,5 µ l di anti-CD45-KO.</li>
	<li>Rimuovere gli anticorpi non legati lavando le cellule in 2 mL di PBS mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 450 µ l di PBS per l'analisi cytometric di flusso finale.</li>
</ol>5. strategia per analisi di citometria a flusso di gating
<ol><li>Effettuare l'acquisizione di dati (almeno 500.000 cellule) su un citometro a flusso dotato di laser rossi, blu e violetto. Verificare le impostazioni citometro ogni giorno per allineamento 1) ottico, sistema 2) fluidico, sensibilità 3) ottico e 4) standardizzazione utilizzando fluorosfere</li>
	<li>Seguire la strategia di gating sequenza per definire l'espressione di CD38 (Figura 1).<ol>
<li>Utilizzare le celle da campioni di midollo osseo normale per definire hematogones o cellule di plasma che servirà come controllo positivo per l'espressione di CD38. Nota: questa porta è particolarmente importante per valutare come popolazioni di LSC putativi successive dipendono dalla sua definizione.</li>
		<li>Definire le cellule precursori fisiologici (normali cellule di scoppio) di criteri di CD45dim/SSC (dispersione laterale) popolazione bassa (Figura 1A). All'interno di questa popolazione di scoppio, definire hematogones, che mostrano un CD38 + + CD19 + fenotipo (Figura 1B) e infine, utilizzare l'espressione CD36 e CD33 per definire i myeloblasts, monoblasts ed eritroblasti (Figura 1). Determinare l'espressione CD34 sui hematogones come mostrato in (Figura 1E). Valutare diverse sottopopolazioni di precursori all'interno delle cellule di scoppio definite come P6-P10 (Figura 1). Separare l'alloggiamento di CD34 delle cellule di scoppio nel P6, P7, P8 sottopopolazioni di cellule progenitrici basate su preset CD38 cancelli. Accertarsi che il vano P8 contiene le esplosioni che hanno la stessa intensità CD38 hematogones, che P6 include celle che sono basati su CD38 sulla fluorescenza CD38 meno un controllo (FMO) e che le cellule P7 sono tra i due estremi per quanto riguarda CD38 espressione (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dal CD34 + 38-(P6) cellule gated, separare HSC da presunti LSC utilizzando espressione CD90 e CD45RA (Figura 1F). Nota: il fenotipo HSC è CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- e i progenitori multipotenti (MPP) sono definiti come CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Il fenotipo LSC putativo è CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + e la popolazione a valle più immatura sono i progenitori linfoidi-innescato (LMPP), definiti come CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6. MRD monitoraggio mediante RT-PCR
<ol><li>Monitorare i livelli di MRD mediante RT-PCR come descritto in precedenza14.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Una valutazione accurata e riproducibile di membrana o marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso è necessario che le impostazioni dello strumento vengono verificate ogni giorno per allineamento ottico, corretto funzionamento del sistema fluidico, sensibilità ottica e standardizzazione usando le perle di calibrazione.
Rilevazione di popolazioni di cellule di scoppio in AML con CD90 e CD45RA attraverso l'analisi di citometria a flusso multiparametrica è un metodo relativamente sempli...

Leucemia mieloide acuta (AML) è la più comune causa di mortalità per leucemia-collegato. Inizialmente, AML è una malattia clonale di cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Recentemente, clonale eterogeneità della popolazione cellulare blast è stata stabilita essenzialmente utilizzando strategie di sequenziamento (NGS) prossime generazione e mostrando l'esistenza di sviluppo intra-clonale di cellule di tumore1.
Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemiche (LSC). È supposto che questo comparto dinamico delle cellule si evolve per superare varie pressioni di selezione imposte durante il trattamento e la progressione della leucemia. LSC dovrebbero pertanto essere resistente ai regimi chemioterapeutici correnti e mediare la ricaduta di malattia, con profonde implicazioni clinico2. Vari indicatori sono state descritte per caratterizzare LSC come CD1233, CLL-14, CD975 o6di TIM-3. Il CD34 + CD38-vano delle cellule di scoppio è considerato essere arricchita per LSC7 ma include anche normale HSC. CD90 e CD45RA espressione applicata per il CD34 + CD38-vano (P6) (Figura 1) consente di separare le diverse fasi di precursori emopoietici normali e maligne8. In particolare, CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotenti progenitori normali (MPP) come CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-cellule e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellule progenitrici multipotenti linfoide-innescato (LMPP) possono essere determinate nella maggior parte di AML casi8 ,9. L'intensità media di fluorescenza (MFI) di CD38 è particolarmente importante da considerare all'interno del compartimento delle cellule CD34 +. Perché CD38 intensità definisce tre compartimenti cellulari nuovi della stessa: CD38 negativo (P6), CD38 dim (P7) e CD38 brillante (P8) (Figura 1). Il MFI di CD38 può essere determinato utilizzando hematogones e/o cellule di plasma come controllo positivo interno come queste cellule esprimono fortemente CD38.
Il modello immunodeficiente del topo NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) è ampiamente usato per engraftment delle normali e maligne umane ematopoietiche cellule10,11. Lo xenotrapianto seriale dosaggi sono utilizzati per convalidare sperimentalmente funzione LSC o HSC. Questi studi sono stati ampiamente analizzati da approcci di sequenziamento su larga scala. Tuttavia, meno è conosciuto circa il immunophenotype LSC e HSC della popolazione di scoppio AML engrafted nei topi NSG rispetto al suo primario AML (Figura 2).
I numeri di LSC sono intrinsecamente bassi così, identificazione e quantificazione di LSC sono impegnativi e il metodo qui descritto può essere utilizzato come un test citofluorimetrico alla diagnosi e alla clinica seguire per valutare la risposta di chemioterapia (come residuo LSC può causare una ricaduta AML). La presenza di LSC può indicare positiva malattia minima residua (MRD). Ad oggi, MRD monitoraggio in AML per lo più si basano su metodi molecolari (cioè, RT-PCR, NGS)10,12. Tuttavia, in questo protocollo rileviamo l'espressione della proteina simultanea di diversi marcatori HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umana da multiparametrico flusso cytometry2,8,9. Questa combinazione di anticorpi può essere applicata in qualsiasi laboratorio di citometria a flusso standard e questo saggio MRD di flusso è particolarmente interessante quando MRD da reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) non è possibile, cioè, se specifico di leucemia molecolare gli indicatori non sono rilevabili nel campione diagnostico AML. Inoltre, questo protocollo, è complementare alle tecniche MRD molecolari più sensibili, come esso mira a individuare e quantificare le cellule progenitrici ematopoietiche anomale che rappresenta una caratteristica funzionale delle cellule (Figura 3).
Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici ematopoietiche e il vano di LSC putativo con diverso grado di maturazione da citometria a flusso con anticorpi disponibili nella maggior parte dei laboratori clinici. Inoltre, abbiamo confermato la presenza di questi compartimenti cellulari nel corrispondenti paziente-derivato-xenotrapianti (PDX) e al trattamento di follow-up.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi dei globuli rossi (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>Soluzione di lisi dei globuli rossi A : 8,29 g di NH4Cl + 0,037 g di Na2EDTA in 100 mL di H2O sterile e soluzione di lisi dei globuli rossi B: 1 g di KHCO3 in 100 mL di H2O</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2R&gamma; cnull&nbsp; (NSG)&nbsp; topi</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>Codice prodotto: 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco di life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash; Tampone di separazione MACS</td><td>Tampone MACS Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Coltro</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Set di flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Controllo del flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>Kit di selezione dell'EP umano EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp; magnete</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

il flusso cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al follow up

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Leucemia mieloide acuta (AML) è un eterogeneo e se non trattata, la malattia mortale. È la causa più comune di mortalità per leucemia-collegato in adulti. Inizialmente, AML è una malattia delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio di leucemia e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemia (LSC), con questa dinamica cella vano in evoluzione per superare varie pressioni di selezione imposto durante il trattamento e la progressione della leucemia. Per definire ulteriormente la popolazione di LSC, l'aggiunta di CD90 e CD45RA permette la discriminazione di HSCs normali e di progenitori multipotenti all'interno dello scompartimento CD34 + CD38-cella. Qui, descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di diversi markers putativi di LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umano mediante citometria a flusso multiparametrica. Inoltre, mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti. Questo metodo di rilevazione e quantificazione di putativi LSC può essere utilizzati per il follow-up clinico della risposta di chemioterapia (cioè., malattia residua minima), come residuo LSC può causare la ricaduta AML.

Qui presentiamo un metodo per determinare le popolazioni di cellule progenitrici in campioni normali e maligne del midollo osseo umano. Abbiamo raccolto della milza e del midollo osseo da un successo PDX ed eseguita la citometria a flusso multiparametrica come descritto sopra. Abbiamo confrontato diverse sottopopolazioni delle cellule di scoppio tra il campione diagnostico del paziente e il corrispondente PDX e particolarmente, il vano di CD34 + CD38-progenitore, in particolare arricchite nel presunto LSC. Abbiamo trovat...

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stimare le cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta e negli xenotrapianti derivati da pazienti mediante citometria a flusso alla diagnosi e al follow-up del trattamento. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'ematologia/oncologia, come la rilevanza clinica della valutazione quantitativa delle cellule staminali leucemiche mediante citometria a flusso nella leucemia mieloide acuta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è applicabile alla maggior parte dei laboratori di ematologia/oncologia con anticorpi di uso comune.Questa procedura sarà dimostrata da Thomas, un post-doc, Fanny, una studentessa laureata, e Adeline, un ingegnere del mio laboratorio. Per iniziare, raccogliere due millilitri di midollo osseo da LMA de novo in provette contenenti 1,8 milligrammi per millilitro di EDTA anticoagulante. Isolare le cellule mononucleate dai globuli rossi e dai granulociti diluendo prima il midollo osseo in tre volumi di PBS.Quindi, sovrapporre con cura un volume di ficol con un volume di midollo osseo diluito. Centrifugare il gradiente di densità a 300 g per 30 minuti senza interruzioni. Quindi, trasferire lo strato bianco di buffy coat di cellule mononucleate in una nuova provetta sterile.Per rimuovere i surnatanti che contaminano i componenti del siero, aggiungere 10 millilitri di PBS e centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti prima di ripetere il lavaggio. Lisi i globuli rossi aggiungendo due millilitri di tampone di lisi al pellet cellulare e agitare delicatamente. Quindi, incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti.Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Quindi, usa il PBS per lavare le cellule. Dopo aver isolato le cellule blastiche dal midollo osseo secondo il protocollo di testo, sotto una cappa a flusso laminare, inserire un topo NSG non condizionato in un dispositivo di contenimento e iniettare cinque volte 10 alla sesta cellula blastica AML nella vena caudale.Riportare il topo in una gabbia ventilata individuale in condizioni convenzionali e specifiche prive di agenti patogeni. Ogni due settimane, utilizzare un metodo di raccolta sottomandibolare con un capillare dell'ematocrito per prelevare 60 microlitri di sangue. Trasferire il capillare in una provetta da cinque millilitri, quindi con una garza sterile, applicare una leggera pressione per fermare l'emorragia.Aggiungere un millilitro di tampone di lisi al tubo e agitare delicatamente. Quindi, incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare le celle a 300 g per cinque minuti.Quindi, dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 100 microlitri di PBS con il 10% di BSA, tre microlitri di FITC CD45 anti-umano, incubare per 30 minuti. Quindi, lavare il pellet cellulare due volte in PBS, due millilitri, con il 10% di BSA e centrifugare a 300 g per cinque minuti. Ogni due settimane, utilizzare la citometria a flusso per analizzare l'attecchimento mediante analisi chimerica dell'espressione di CD45 umana rispetto a quella murina.Quando la conta blastica è superiore al 70% o si osservano gravi segni clinici di malattia, sacrificare l'animale e raccogliere cellule blastiche mononucleate da una milza schiacciata e dal midollo osseo utilizzando la PBS per lavare tibie e femori come descritto in precedenza. Per eseguire la colorazione del pannello, combinare gli anticorpi coniugati con campioni di xenotrapianto umano primario o derivato da paziente, o PDX, e agitare le provette. Quindi, incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15-30 minuti.Rimuovere gli anticorpi non legati utilizzando due millilitri di PBS per lavare le cellule. Risospendere le cellule in 450 microlitri di PBS, quindi procedere all'analisi della citometria a flusso e al monitoraggio MRD. Per valutare in modo accurato e riproducibile la membrana dei marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso, verificare l'allineamento ottico.La corretta messa a punto del sistema 3D e la sensibilità ottica e la stomatizzazione utilizzando la calibrazione della stomazina battono ogni giorno. Utilizzare il midollo osseo normale per impostare i cancelli per il CD38. Sono necessari un minimo di 500.000 eventi e viene verificato che ogni flusso sia regolare e omogeneo.Inoltre, vengono eliminati i doppietti, le cellule morte e i detriti cellulari. Le cellule ematopoietiche immature sono definite dall'essere CD45 intermedio, SSC basso. E il controllo CD38 positivo, o ematogoni, sono CD19/CD38 doppio positivo.Quindi vengono definiti P8 o CD38 positivi, P7 o CD38 intermedio e P6 o CD38 negativo. Le cellule P6 possono essere ulteriormente suddivise in HSC, MPP e LSC. Trattandosi di un midollo osseo normale, è LSC negativo.Utilizzando la citometria a flusso multiparametrica, è stato riscontrato che la frazione blastica CD34 positiva e CD38 negativa era più alta in PDX rispetto al campione diagnostico di paziente. È interessante notare che una percentuale più elevata di LSC putativa è stata trovata nel PDX rispetto al campione primario di pazienti, suggerendo un possibile arricchimento di cellule progenitrici maligne nei tessuti ematologici in questo modello murino. Al confronto delle popolazioni progenitrici dei blasti in due diversi campioni di pazienti, la frazione CD34 positiva e CD38 negativa è aumentata dallo 0,06% alla diagnosi al 3,33% al primo follow-up del trattamento nel primo paziente.Al contrario, la frazione CD34 positiva e CD38 negativa è diminuita nel secondo paziente dal 7,8% alla diagnosi al 2,27% al primo follow-up del trattamento. Di conseguenza, la frazione putativa di LSC è aumentata nel primo paziente dallo 0% alla diagnosi allo 0,65% ed è diminuita nel secondo paziente dal 6,57% alla diagnosi all'1,44% al follow-up del trattamento. Il monitoraggio della malattia minima residua o MRD, utilizzando come marcatori molecolari la mutazione NPM1 nel primo paziente e la fusione genica CBF-beta MYH11 per il secondo paziente, ha dimostrato che la MRD molecolare è diminuita meno nel primo paziente rispetto al secondo paziente per il primo follow-up del trattamento.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante questa procedura, è importante verificare le impostazioni della citofluorimetria e la misurazione del CD38. Dopo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi, come la selezione citofluorimetrica delle cellule per rispondere a ulteriori domande come la valutazione funzionale delle cellule staminali della leucemia.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come rilevare e quantificare le cellule staminali leucemiche in campioni di pazienti in xenotrapianti derivati da pazienti. Non dimenticare che lavorare con i campioni dei pazienti può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come le linee guida GOP e le procedure di sicurezza istituzionali.

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Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.

Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.

Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Qui, viene descritto un metodo basato sulla citometria a fosfoflusso per analizzare la segnalazione a valle delle vie mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK in cellule di leucemia mieloide umana acuta xenotrapiantate in topi e ottenute da aspirati di midollo osseo. I livelli di p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 vengono misurati simultaneamente utilizzando un citometro a flusso spettrale di nuova generazione ad alta sensibilità.

Citometria intracellulare a fosfoflusso di pazienti con leucemia mieloide acuta Xenotrapianti derivati da pazienti

Questo protocollo descrive in ovo xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) B e T derivate da pazienti, che si verifica 4 giorni dopo l'iniezione.

Nell'Ovo Xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti (PDX-ALL)

Il protocollo ha l'obiettivo di descrivere un modello murino per la generazione di recidive di leucemia linfoblastica acuta, basato sulla dinamica della risposta alla chemioterapia di induzione.

Modello murino di recidiva della leucemia alla chemioterapia di induzione per la leucemia linfoblastica acuta

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Scopri come stimare le cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato mediante citometria a flusso. Questo metodo è applicabile nella maggior parte dei laboratori di ematologia/oncologia.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up (Video) | JoVE Journal

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

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