Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire con successo una microiniezione negli embrioni di nasonia vitripennis al fine di facilitare la manipolazione genomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla biologia della nasonia vitripennis, come la produzione di veleno e la determinazione del sesso. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica è che consente la manipolazione diretta nel genoma della vespa e offre un'ampia varietà di modifiche genomiche avanzate.

A dimostrare la procedura sarà Ming Li, un post-doc del nostro laboratorio. Per iniziare, allestisci diverse colonie di N. vitripennis posizionando da 200 a 500 adulti con un rapporto di tre a uno tra femmine e maschi in gabbie per dormitori per insetti. Mantenere le vespe a 25 gradi Celsius più o meno con il 30% di umidità relativa e un ciclo luce/buio da 12 a 12.

Per due giorni, lasciare che le femmine accoppiate si nutrano di pupe fresche di S. bullata e di piccole goccioline di una soluzione di acqua di saccarosio da uno a dieci volumi. Per i due giorni successivi, rimuovere le pupe di mosconi per privare le vespe femmine di un sito di ovideposizione, rendendole molto gravide. Per mantenere freschi gli ospiti di S. bullota pupae, conservali a 4 gradi Celsius subito dopo averli ottenuti e rimuovili solo quando necessario.

Distingui tra ospiti giovani che hanno un pupario di colore rosso e ospiti più anziani che hanno un pupario di colore più scuro. Consenti alle vespe femmine di parassitare nel giovane ospite posizionando singole pupe fresche di S. bullata in un tappo di schiuma con un foro delle dimensioni di una pupa tagliato al centro. Per la massima concentrazione di parassitizzazione e una più facile raccolta degli embrioni, esporre solo circa 0,2 centimetri dell'estremità anteriore dell'ospite, che è arrotondata, rispetto all'estremità posteriore, che è più spessa e contiene un'apertura simile a un cratere.

Metti le pupe ospiti in questa disposizione nella gabbia e attendi circa 45 minuti per consentire alle vespe di parassitarle. Rimuovi gli ospiti parassiti recuperandoli a mano e picchiettando delicatamente o soffiando via eventuali vespe residue. Sostituirli con ostie fresche circa ogni 15 minuti per continuare a raccogliere gli ovuli in fase iniziale durante le iniezioni.

Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinza per staccare con cura l'estremità posteriore del pupario esterno di un ospite appena parassitato per esporre le uova di N. vitripennis. Quindi, preparare un vetrino per l'allineamento dell'embrione utilizzando un adesivo liquido per incollare un vetrino coprioggetti su un vetrino pulito. Con un pennello umido a punta fine, spazzola accuratamente gli embrioni dall'ospite, assicurandoti di non danneggiare la pelle morbida e pupale dell'ospite.

Quindi, con il pennello bagnato, trasferire circa 20 embrioni uno ad uno sul vetrino, immediatamente adiacente al lato del vetrino coprioggetti. Orientare l'estremità anteriore dell'embrione contro il bordo del vetrino di copertura, in modo che le estremità posteriori dell'embrione siano rivolte nella stessa direzione. Ciò consentirà una maggiore precisione dell'iniezione nella stessa posizione tra tutti gli embrioni.

Dopo aver estratto gli aghi da iniezione secondo il protocollo di testo, smussare la punta dell'ago toccando leggermente la punta con una piastra abrasiva diamantata a 25 gradi Celsius per circa 10 secondi. Preparare la miscela per iniezione costituita da reagenti per la modificazione del genoma e tenerla in ghiaccio. Utilizzare una punta per microloader per caricare l'ago per iniezione con due microlitri di miscela per iniezione.

Quindi, posizionare il vetrino con gli embrioni allineati sul tavolino di un microscopio composto. Inserire con cautela l'ago nell'estremità posteriore dell'embrione con un angolo verticale compreso tra 25 e 35 gradi. Quindi, iniettare da uno a cinque picolitri di miscela per iniezione e assicurarsi che l'embyro si gonfi leggermente con l'iniezione.

Se si verifica un intasamento, provare a smussare nuovamente gli aghi. Il citoplasma degli embrioni di N. vitripennis è insolitamente viscoso e appiccicoso, il che porta a frequenti ostruzioni dell'ago. Iniettare circa 20-40 uova alla volta, quindi interrompere.

Trasferire le uova iniettate con un pennello bagnato toccando leggermente le uova iniettate e metterle in un'ostia. Quindi, continuare l'iniezione, utilizzando un lotto di uova fresche e appena deposte. Idealmente, questo passaggio è più efficace quando una persona sta raccogliendo e allineando le uova, mentre un'altra persona sta iniettando componenti di modifica del genoma e trapiantando embrioni iniettati nelle pupe dell'ospite.

Dopo la microiniezione, utilizzare un pennello bagnato per posizionare con cura fino a 40 embrioni G zero iniettati uno alla volta su una pupa di S. bullata precedentemente punta. Metti le pupe ospiti in una capsula di Petri con carta da filtro umida e batuffoli di cotone e incubale a 25 gradi Celsius con circa il 70% di umidità fino a quando gli embrioni iniettati si schiudono in circa uno o due giorni. È importante sottolineare che gli ospiti possono essere lasciati con un pupario staccato e le uova di N. vitripennis si svilupperanno normalmente, purché siano incubate in una camera umidificata per prevenire l'essiccazione.

Dopo la schiusa degli embrioni G zero, trasferisci le pupe ospiti in una nuova capsula di Petri e incubale a 25 gradi Celsius e 70% di umidità. Monitorare quotidianamente le pupe ospiti e le larve G zero iniettate. Se le pupe ospiti hanno un cattivo odore, trasferire le larve iniettate a nuove pupe ospiti sane.

Per un'efficace penetrazione dell'ago e microiniezione negli embrioni di N. vitripennis, diversi estrattori per micropipette sono stati testati con diversi tipi di aghi capillari in vetro con filamenti, tra cui quarzo, alluminosilinato e borosilicato, per avere una punta lunga simile all'ipodermica desiderata, efficace per la microiniezione di embrioni di N. vitripennis. I componenti di modifica del genoma utilizzati qui erano RNA guida misti e proteina cas9 per un editing del genoma mediato più nitido. In questo esperimento, un sgRNA mirato al gene del cinabro è stato iniettato in quantità variabili, insieme alla proteina cas9, in N.vitripennis.

Questa tabella mostra che i tassi di sopravvivenza erano dose-dipendenti, poiché l'aumento della concentrazione di sgRNA e della proteina cas9 ha portato a una diminuzione dei tassi di sopravvivenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante fare attenzione a non perforare o essiccare gli embrioni di vespa durante la manipolazione o il trasferimento utilizzando con cura un pennello a punta fine inumidito o un plettro per embrioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare, microiniettare e trapiantare embrioni di vespa in modo efficiente al fine di eseguire con successo modifiche avanzate del genoma.