Name: Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Impara la microiniezione di embrioni e la tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis. Questo metodo consente modifiche ereditabili per studiare biologia delle vespe.

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Questo lavoro è stato supportato da generoso della University of California, fondo di avviamento di Riverside (UCR) laboratorio O.S.A, USDA National Institute of Food e del progetto di agricoltura (catino) Hatch (1009509) per o.s.a.

1. N. Vitripennis Colonia allevamento
<ol>
	<li>Impostare diverse colonie (~ 3-5) inserendo 200-500 vitripennis N. adulti (con un rapporto 3:1 donna e uomo) in gabbie dormitorio bug. Nota: Alternativa all'utilizzo di dormitori di bug, vespe può anche essere propagata in più, provette di vetro piccolo collegati con cotone con circa 15-20 vespe/flacone.<ol>
		<li>Mantenere le vespe a 25 ± 1 ° C con umidità relativa 30% e un ciclo di buio luce 12:12, nutrirli quotidianamente con piccole goccioline di 01:10 (v/v) soluzione di saccarosio/acqua. Nota: Propagazione delle colonie di Vespa e collezioni può essere condotta anche a temperatura ambiente senza umidità controllata; Tuttavia, temperature inferiori a 25 ° C si abbassa leggermente la tempistica dello sviluppo degli embrioni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Consentire vespe di accoppiarsi per almeno 4 giorni prima di iniezioni.<ol>
		<li>Per i primi due giorni, permettere a donne accoppiate di mangimi freschi S. bollata pupe, così come piccole goccioline di un 01:10 (v/v) soluzione di saccarosio/acqua.</li>
		<li>Per i due giorni seguenti, rimuovere le pupe blowfly per privare le vespe femminile di un sito di deposizione delle uova, che li rende molto gravid.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. raccolta e allineamento di embrioni in fase di pre-blastoderm N. Vitripennis
<ol>
	<li>Consentire femminile vespe di parassitare (oviposit embrioni) in giovani padroni di casa (S. bollata pupe). Per mantenere freschi gli host, memorizzare i padroni di casa a 4 ° C immediatamente dopo aver ottenuto loro e rimuovere solo quando necessario. Nota: Giovani padroni di casa può essere determinate avendo un pupario colorata di rosso, mentre più vecchi padroni di casa hanno un pupario colorato più scuro (Figura 1A).<ol>
		<li>Posto fresco individuali bollata di S. pupe in un tappo di gomma piuma con un foro di dimensioni pupe ritagliare al centro. Esporre solo ~ 0,2 cm dell'estremità anteriore (sito preferito di deposizione delle uova) dell'host per la massima concentrazione di spesso e più facile raccolta di embrioni. Nota: L'estremità anteriore è arrotondato, mentre l'estremità posteriore è più spessa e contiene un 'cratere-come' apertura (Figura 1B).</li>
		<li>Inserire pupe host (all'incirca 5 pupe di host per 100 vespe) in questa disposizione nella gabbia e aspettare circa 45 min per consentire vespe di parassitare loro (Figura 2- ii). Nota: È molto importante che gli embrioni sono giovani come possibile, idealmente entro la prima ora di essere oviposited, per garantire che essi sono in fase di pre-blastoderm. Vecchi embrioni (&#62; 1,5 h) non deve essere iniettato.</li>
		<li>Rimuovere gli host parassitati recuperandoli a mano e delicatamente spazzolatura/soffiando fuori qualsiasi residente vespe. Sostituirli con padroni di casa fresche dopo ogni ~ 15 min per continuare la raccolta presto in scena le uova durante le iniezioni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rimuovere a mano i padroni di casa appena parassitati dalla gabbia. Sotto un microscopio per dissezione, usando il forcipe, attentamente staccarsi l'estremità posteriore (0,4 cm) del pupario esterna (pupal shell) per esporre le uova N. vitripennis (Figura 2- iii). Nota: Si deve prestare attenzione per evitare di perforare la pelle pupal; Se questo accade, l'emolinfa sarà inumidire gli embrioni di Vespa, che saranno molto difficili da rimuovere per il microinjection.</li>
	<li>Usare liquido adesivo per incollare un vetrino coprioggetto su un vetrino pulito per preparare una diapositiva di allineamento di embrione (Figura 3). Nota: Un adesivo istantaneo ad alte prestazioni viene utilizzato per aumentare la forza di legame e rapidità di essiccazione, tuttavia qualsiasi colla che può mantenere il vetrino coprioggetto da muoversi sulla diapositiva è accettabile.</li>
	<li>Veemenza gli embrioni dall'host accuratamente con un pennello bagnato di multa-punta, facendo attenzione a non danneggiare la pelle morbida pupal dell'host. Nota: un «embrione pick,' che è essenzialmente una metà di una coppia di pinze ultrafini, può essere utilizzato invece di un pennello.</li>
	<li>Trasferimento ~ 20 embrioni uno-ad-uno nella diapositiva, immediatamente adiacente al lato del coprivetrino con un pennello bagnato. Orientare l'estremità anteriore dell'embrione contro il bordo della diapositiva coperchio in modo che il lato posteriore degli embrioni sia rivolto nella stessa direzione (Figura 2- iv). Ciò consentirà una maggiore precisione di stampaggio ad iniezione nella stessa posizione tra tutti gli embrioni. Nota: Questa tecnica migliorata non richiede bifacciale nastro adesivo per fissare gli embrioni alla diapositiva come descritto in precedenza21,22. Inoltre, non essiccare embrioni o coprire le uova con olio halocarbone durante l'iniezione, come descritto in precedenza per vitripennis N. embrione microiniezione22.</li>
</ol>
3. ago preparazione per microiniezioni
<ol>
	<li>Inserire un vetro capillare di silicato di alluminio in un estrattore dell'ago. Nota: Un ago di qualità è fondamentale per il successo vitripennis N. iniezioni di embrioni. Gli aghi per iniezione dovrebbero avere un sharp e belle-punta per consentire la facile penetrazione attraverso il corion. Quarzo e borosilicato aghi capillari possono anche essere utilizzato (Figura 4).</li>
	<li>È possibile impostare il calore a 605, la velocità a 130, il ritardo a 80, il tirare su 70 e la pressione a 500 su un estrattore dell'ago. Nota: Impostazioni di estrattore ferri aggiuntivi per la trazione al quarzo e aghi di borosilicato possono essere visto nella tabella 1; i parametri possono variare per diversi estrattori e filamenti.</li>
	<li>Attivare la levetta di regolazione dell'ago per creare l'ago corretta. Ripetere se necessario per la produzione di aghi multipli. Nota: Tirati aghi possono essere memorizzati inserendoli in una capsula di Petri contenente che parecchi paralleli rotoli di argilla di modeler commerciale.</li>
	<li>Smusso la punta dell'ago toccando leggermente la punta alla piastra abrasiva diamante circa 10 s a 25 ° C (Figura 2- iii). Nota: Gli aghi per iniezione beneficiano di smussatura promuovendo entrata in embrioni con danno minimo migliorando contemporaneamente il flusso dei reggenti attraverso l'ago.</li>
</ol>
4. embrione Microinjection
<ol>
	<li>Preparare la miscela di iniezione di reagenti di modificazione del genoma (ad es., trasposoni + helper transposase, o CRIPSR reagenti, ecc.) e tenerlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Caricare l'ago per iniezione con 2 µ l di miscela di iniezione utilizzando suggerimenti microloader. Nota: La miscela di iniezione ha dimostrata nel protocollo consiste di singolo-guida RNA (sgRNA) (s) e la proteina ricombinante Cas9 miscelati in H2O.</li>
	<li>Porre il vetrino di vetro con gli embrioni foderati sul palco di un microscopio composto.</li>
	<li>Inserire delicatamente l'ago nell'estremità posteriore dell'embrione con un angolo verticale di 25-35 °.</li></ol>Iniettare 1-5 pL della miscela di iniezione (circa il 2-10% del volume dell'embrione) e garantire che l'embrione sembra gonfiarsi leggermente, come la miscela viene iniettata in esso (Figura 2- iv). Nota: Se troppo miscela di iniezione viene iniettato l'embrione possono scoppiare dissipare il citoplasma dall'embrione. Inoltre, impropriamente smussato o rotto troppo grande di aghi con un'apertura può anche causare la rottura dell'embrione.<ol>
		<li>Prova a ri-smussatura aghi in caso di intasamento. Il citoplasma degli embrioni N. vitripennis è insolitamente densa e collosa, che conduce ai ferri frequenti intasamento (iniezioni di 1/25). Nota: È importante mantenere gli embrioni umido durante il periodo di iniezione regolarmente aggiungendo acqua deionizzata utilizzando il pennello. La quantità di acqua sul pennello è la chiave per muoversi embrioni e allineare con facilità. Troppa acqua si traduce in embrioni galleggiante e troppo poca acqua li rende difficile muoversi.</li>
		<li>Iniettare ~ 20-40 uova alla volta (dovrebbe prendere circa 10 min), poi fermarsi. Trasferire le uova iniettate con un pennello bagnato toccando leggermente le uova iniettate e inserirli in un host. Poi continuare iniettando nuovamente utilizzando un fresco appena partita di uova di cui (&#62; 1h vecchio). Nota: Idealmente questo protocollo è più efficace se una persona è continuamente raccogliendo e allineando le uova, mentre un'altra persona è iniettando i componenti di modificazione del genoma e il trapianto di embrioni iniettati di pupe di host.</li>
	</ol>
	

5. trapianto iniettato G0 vitripennis N. embrioni su Host Pre-stung
<ol>
	<li>Posizionare gli embrioni iniettati di0 G su una precedenza stung bollata di S. pupe (Figura 2- vi) con un pennello bagnato dopo microiniezione. Nota: Le pupe di host utilizzate per raccogliere gli embrioni per il microinjection funzionerà per questo scopo. Inoltre, nonostante il notevole sforzo, non c'è attualmente nessuna dieta artificiale disponibile che possa essere usate22.<ol>
		<li>Posto fino a 40 embrioni iniettati uno alla volta in un singolo host pre-stung per evitare sovraffollamento e larvale concorrenza. Nota: Iniezione causerà danni agli embrioni; sbadato trapianto di embrioni iniettati per le pupe di host può spremere il componente iniettato o il tuorlo fuori e portare alla morte degli embrioni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inserire le pupe di host in una capsula di Petri con carta da filtro umido e batuffoli di cotone e li Incubare a 25 ° C con circa 70% di umidità fino a quando embrioni iniettati schiudono (circa 1-2 giorni) (Figura 2- vii). Nota: Importante, padroni di casa possono essere lasciati con un pelati off pupario e vitripennis N. uova svilupperà normalmente fino a quando essi sono incubati in una camera umidificata (capsula di Petri con carta da filtro umido e batuffoli di cotone) per evitare il disseccamento. Incubare a temperatura ambiente e con umidità dai batuffoli di cotone inumidito è sufficiente nel caso in cui l'umidità non può essere controllato.</li>
	<li>Trasferire le pupe di host in una nuova piastra di Petri a 25°C e umidità 70% dopo il tratteggio di embrioni0 G.<ol>
		<li>Monitorare quotidianamente le pupe di host e iniettate larve di0 G. Se le pupe host hanno un cattivo odore, trasferire le larve iniettate al nuovo pupe ospite sano.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. lo screening per le modifiche del genoma
<ol>
	<li>Rimuovere ogni pupe N. vitripennis dall'host utilizzando un pennello fine o embrione pick. Le larve di0 G iniettate dovrebbero pupate circa 8 giorni dopo l'iniezione.</li>
	<li>Luogo ogni pupa rimosso in una fiala di vetro isolato collegato con cotone e consentire loro di emergere come gli adulti0 G, assicurando che le femmine nati sarà Vergine che vi aiuterà con incroci genetici a valle. Nota: Le femmine possono essere ordinate da maschi per lunghezza dell'ala: le femmine hanno ali più lunghe che si estendono oltre il profilo del corpo quando girato sul lato. Tutte le pupe femminili iniettati possono essere messi insieme in un flacone tappato, e lo stesso vale per pupe maschi.</li>
	<li>Gli individui0 schermo G, dopo eclosion, entrambi PCR o visivamente (se interrompere un gene fenotipico). Ad esempio, se CRISPR viene utilizzato per creare le eliminazioni in un dato gene e gene perturbato conferisce un fenotipo visibile, quindi ordinare e mantenere gli individui con una versione mutante del fenotipo interessato (Figura 2- viii)21. Se, tuttavia, il gene interessato codifica per un fenotipo non visibili, come un mutante di un gene essenziale, eseguire uno schema di attraversamento (Croce G0 maschio con femmina tipo selvaggio, o croce G0 femmina con maschio di tipo selvaggio) per recuperare e dello schermo per mutanti ereditabile attraverso analizzante letalità o sterilità. Nota: Simile a d. melanogaster, N. vitripennis adulti può essere immobilizzato da esposizione al CO2 permettendo per semplice manipolazione. Inoltre, le femmine spaiate darà luogo a 100% nidiate di maschi aploidi, così dunque che una donna mutante spaiata può dar luogo a gran numero di maschi mutanti che può essere utilizzato per la successiva analisi. Nota: Le mutazioni in geni essenziali dovranno essere tenuti dall'accoppiamento superstite G0 iniettato femmine (presumibilmente eterozigoti per una mutazione) ai maschi di tipo selvaggio; in questo caso particolare, la metà della prole maschio G1 dovrebbe morire a causa dell'ereditarietà della mutazione letale, mentre la metà della prole femmina1 G saranno portatrici della letale.</li>
	<li>Outcross G0 adulti e progenie1 schermo G per gli inserimenti di transgene usando gli indicatori transgenesi, se l'obiettivo è la transgenesi. Attualmente la transgenesi resta da dimostrare in N. vitripennis.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il recente sequenziamento del genoma di N. vitripennis ha scatenato un bisogno importante per strumenti molecolari per la caratterizzazione funzionale di geni sconosciuto all'interno di questa specie23. Il sistema di CRISPR-Cas9 e molti altri strumenti di editing gene, hanno dimostrato di essere utile per indagare le funzioni del gene per un certo numero di organismi24. Tuttavia, per generare mutazioni ereditabili, questi strumenti richiedono prestazioni microiniezioni di embrione. Pertanto, dimostrato qui è una tecnica visiva dettagliata che include una serie di innovazioni che consentono di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis .
Nel complesso, questa tecnica dettagliata offre una serie di innovazioni significative, rispetto alle attuali metodi23, che consentano di efficiente microiniezioni embrione N. vitripennis . Ad esempio, per facilitare la rapida raccolta degli embrioni, uno strumento di deposizione delle uova (tappo di gomma piuma) è creato e utilizzato per limitare la deposizione interamente all'estremità posteriore dell'host (Figura 1), che facilita notevolmente la raccolta di numerosi embrioni all'interno delle uova un breve periodo di tempo. Tecniche per l'allevamento di colonie di Vespa con un gran numero di raccogliere un numero maggiore di uova sono anche migliorati e definiti. Inoltre, per accelerare l'allineamento dell'embrione, è sviluppato un dispositivo di allineamento di embrione che consente per gli embrioni di essere allineati in modo efficiente e iniettato senza dover utilizzare nastro adesivo su due lati per proteggere gli embrioni in posizione (Figura 3).
Inoltre, si è accertato che mantenendo gli embrioni umido con acqua durante l'iniezione e non essiccare gli embrioni o coprendole con olio migliorato i tassi di sopravvivenza. Inoltre, diversi tipi di vetro capillare sono testati e sono determinati parametri per costruire gli aghi perfetti per il microinjection N. vitripennis (tabella 1, Figura 4). Inoltre, seguenti microiniezione, sopravvivenza dell'embrione tariffe sono in grado di aumentare in modo significativo a causa di incubazione uova iniettate in pre-stung host collocati in camere di alto-umidità (70%). Queste innovazioni consentono una procedura più snella e successo di microiniezione per N. vitripennis.
Piccole modifiche in termini di apparato di iniezione e procedure di allevamento possono essere fatto al presente protocollo, a seconda delle preferenze dell'utente. Tuttavia, un numero di passaggi critici sarà essenziale per la generazione di mutanti con successo in N. vitripennis. Ad esempio, lavorando rapidamente affinché embrioni iniettati sono &#62; vecchio h 1 e assicurando che gli aghi per iniezione sono abbastanza nitide minimizzare i danni per l'embrione sia sarà essenziale. Mentre questo protocollo dovrebbe essere efficace per la generazione di mutazioni nei geni di molti (se non tutti), uno dei principali limiti è il requisito di CRIPSR/Cas9 di destinazione una sequenza di PAM (NGG) che detterà alla sequenza di destinazione.
In conclusione, questa tecnica migliorata può essere utilizzata per generare molti tipi di modificazioni del genoma, come mutazioni, delezioni e forse anche inserimenti utilizzando CRIPSR/Cas9 tecnologie21, o persino transgene inserimenti per generare transgenici N. vitripennis, che dovrebbe accelerare notevolmente la ricerca funzionale in questo organismo.

La Vespa di gioiello, N. vitripennis, è una delle quattro specie del genere Nasonia che sono ectoparasitoids di carne mangiare mosche come Sarcophaga bullata1. A causa di loro periodi veloce-generazionale, facilità di allevamento in laboratorio e una gamma di attributi biologici unici e importante, N. vitripennis è stato un punto focale per lo sviluppo di molteplici strumenti sperimentali trovati in organismi modello tradizionale . Ad esempio, alcuni attributi biologici unici includono un sistema di riproduzione aplo-diploide2, una relazione con parassiti microbici e genetica3,4e un sovrannumero (B) del cromosoma5,6 ,7. Presi insieme, questi fanno N. vitripennis un importante sistema sperimentale per esperimenti volti a chiarire gli aspetti molecolari e cellulari di questi processi, oltre ad altri tra cui veleno produzione8, 9, sesso determinazione10,11ed evoluzione e sviluppo di asse modello formazione12,13,14. Inoltre, il toolkit genetico per studiare la biologia di N. vitripennis è aumentato drammaticamente negli ultimi dieci anni o così, con il sequenziamento di un genoma ad alta risoluzione15, espressione genica diversi studi16,17,18e il capacità di interferire funzionalmente basandosi su RNA interference (RNAi)19,20, che insieme hanno migliorato la trattabilità e la capacità di eseguire genetica inversa in questo organismo l'espressione genica.
Nonostante i molti importanti progressi scientifici e Toolkit espansa in questo organismo, a partire da conoscenze attuali solo un gruppo ha eseguito correttamente embrionali microiniezioni per generare ereditabile genoma modifiche21. Ciò è principalmente dovuto la difficoltà di operare con embrioni di N. vitripennis in quanto sono piuttosto fragile e piccola, essendo ~2/3 le dimensioni degli embrioni di Drosophila melanogaster , che li rende generalmente difficili da manipolare. Inoltre, N. vitripennis femmine depositano le loro uova in pupe blowfly pre-stung, all'interno del quale si verifica l'interezza dell'embriogenesi, larvale e sviluppo pupa. Pertanto, per successo microiniezioni, fase di pre-blastoderm, devono essere raccolti in modo efficiente il embrioni, da pupe host, microiniettati rapidamente e immediatamente trapiantato nel loro padroni di casa per lo sviluppo. Questi passaggi richiedono precisione e destrezza per evitare di danneggiare gli embrioni iniettati o i padroni di casa pupal, rendendo la tecnica estremamente impegnativo. Nonostante, c'è un protocollo a breve pubblicato oltre un decennio fa che descrive vitripennis N. embrione microiniezione22. Tuttavia, questa procedura richiede che gli embrioni appena deposte essere essiccata, usa il nastro adesivo per ancorare le uova per il microinjection e non include una dimostrazione visiva della tecnica. Pertanto, è descritto qui un protocollo aggiornato e riveduto, compresa una procedura visual, dettagliare un protocollo migliorato passo dopo passo per microiniezioni di embrione N. vitripennis che può essere seguito da qualsiasi base del laboratorio per generare ereditabile genoma modifiche a questo insetto importante modello.

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td><td>Gabbia per l'allevamento di insetti</td></tr><tr><td>Provette in vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Pupe di mosca della carne, Sarcophaga bullata</td><td>Carolina Insetti</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>Microelettrodo Smussatore</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>Piastra abrasiva diamantata (dimensioni della punta da 0,7u a 2,0u)</td><td>Sutter Strumenti</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kite R</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express microiniettore programmabile</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 o P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereo</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto</td><td>Leica DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro alluminosilicato 1 mm (diametro esterno) X 0,58 mm (diametro interno)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Può anche utilizzare tappi identitari in borosilicato o quarzo</td></tr><tr><td></td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>Tappi in schiuma</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Vetro Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>adesivo</td><td>Aron Alpha</td><td>AA471</td><td>Per incollare il vetrino coprioggetto sul vetrino del microscopio</td></tr><tr><td>Pennello a punta fine</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Pinza a punta ultrafine</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Punte per microloader</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di nasonia vitripennis

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

La Vespa gioiello Nasonia vitripennis è emerso come un sistema efficace modello per lo studio dei processi tra cui la determinazione del sesso, determinazione del sesso aplo-diploide, sintesi di veleno e interazioni ospite-simbionte, tra gli altri. Una limitazione importante di lavorare con questo organismo è la mancanza di efficaci protocolli per eseguire le modifiche dirette del genoma. Una parte importante della modificazione del genoma è consegna di reagenti, tra cui molecole CRISPR/Cas9, negli embrioni attraverso microiniezioni di editing. Mentre microiniezione è ben consolidata in molti organismi di modello, questa tecnica è particolarmente difficile da eseguire in N. vitripennis principalmente a causa della sua dimensione di piccolo embrione e il fatto che lo sviluppo embrionale avviene interamente all'interno un pupa blowfly parassitati. La procedura seguente supera queste sfide significative mentre dimostrando una procedura snella, visual per rimuovere efficacemente gli embrioni della Vespa da parassitato pupe host, microinjecting li, e attentamente trapianto loro nuovamente dentro l'host per la continuazione e il completamento dello sviluppo. Questo protocollo aumenterà fortemente la capacità dei gruppi di ricerca di eseguire modifiche avanzate genoma in questo organismo.

Questo protocollo fornisce linee guida dettagliate per Colonia allevamento, raccolta pre-blastoderm embrione, allineamento, microiniezione e successivo trapianto dopo l'iniezione e può essere utilizzato per l'ingegneria di genoma efficiente in N. vitripennis. Come illustrato nella Figura 2, la sequenza di passaggi per un successo microiniezione in N. vitripennis generale includono: (i) permettendo adulti maschi e femmine ad accoppiarsi (~ 4 giorni), (ii) fornitura di pupe volare fresco host (S. bullata) collocati in un spina di schiuma modificate alle femmine accoppiate e consentendo per la deposizione delle uova (~ 45 min), (iii) staccando accuratamente la cuticola di pupe parassitati host per esporre e raccogliere embrioni in fase di pre-blastoderm wasp (~ 15 min), (iv) allineando raccolti embrioni (~ 15 min), (v) microinjecting componenti di modificazione del genoma negli embrioni (~ 15 min), embrioni iniettati con attenzione immissione (vi) nuovamente dentro pre-stung host per consentire lo sviluppo corretto (~ 15 min), e (vii) prevenire la disidratazione dell'embrione/host iniettato trasferendo loro in una camera umidificata con circa 70% di umidità relativa (~ 15 min). Parassitati padroni di casa sono incubate per circa 14 giorni consentire lo sviluppo completo di N. vitripennis embrioni. Una volta iniettato, adulti emergono dall'host (viii), isolare, amico e li proteggi singolarmente per la presenza di mutazioni previste.
Per penetrazione efficace dell'ago e microiniezione in vitripennis N. embrioni, vengono sottoposti a diversi tipi di aghi di vetro capillare con filamento inclusi i tipi di quarzo, silicato di alluminio e borosilicato. Si è trovato che la qualità dell'ago è fondamentale per evitare la rottura/intasamento durante l'iniezione e per il raggiungimento di elevati tassi di entrambi efficienza di sopravvivenza e trasformazione di embrione. Per ogni tipo di vetro, un efficace protocollo è stato sviluppato per tirare aghi al fine di avere una lunga punta di desiderata ipodermica-come efficace per il microinjection di embrione N. vitripennis uso estrattori diversi micropipetta (P-1000 e P-2000) (tabella 1 Figura 4).
Per ottimizzare la procedura, i tassi di sopravvivenza sono misurati dopo iniezione di quantità variabili di componenti di modificazione del genoma. I componenti di modificazione del genoma utilizzati qui sono stati guida mista RNA e proteina Cas9 per genoma CRISPR-mediata di editing, che erano precedentemente dimostrato di lavorare bene in vitripennis N.21. Simile a quello che era precedentemente segnalato, qui un sgRNA con destinazione il gene di cinabro è progettato e sintetizzato. Di mira e interrompere questo gene, un cambiamento fenotipico facilmente identificabile è visto nel colore degli occhi del organismo19,21. Una miscela di iniezione combinando una serie di concentrazioni di sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) con la proteina Cas9 (0, 20, 40, 80, 160 e 320 ng / µ l) viene creato e iniettato in embrioni di tipo selvaggio N. vitripennis. Tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati è trovato per essere dose-dipendente (tabella 2)21. La maggiore concentrazione di sgRNA e Cas9 proteina provocare tassi di sopravvivenza in diminuzione (tabella 2), forse a causa di effetti additivi fuori bersaglio. Umidità elevata (~ 70%) trova anche ad per essere importante per la sopravvivenza dell'embrione dopo trapianto ai padroni di casa, come bassa umidità (~ 10%) ha provocato la morte di 100% per tutti gli embrioni iniettati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
Figura 1 . Preparazione di pupe di host (S. bullata) per vitripennis N. deposizione delle uova dell'embrione. (A) Giovane e vecchio S. bollata pupe. Pupe più anziani hanno una cuticola più scura mentre pupe più giovani hanno una tinta più rossastra a loro cuticola. Pupe più giovani sono preferiti per massimizzare la deposizione delle uova. Estremità anteriori e posteriori delle pupe si distinguono anche aprendo un"cratere-come sul lato posteriore, mentre l'estremità anteriore si tratta di un punto arrotondato. (B) preparazione di pupa Host (S. bullata) per la deposizione delle uova dell'embrione di vitripennis N. . Le pupe di host inserendo una spina di schiuma che ha avuto un pupe dimensioni foro scavato. Hanno il lato posteriore della faccia pupe host all'interno della spina mentre 0,2 cm dell'estremità anteriore esposti per consentire massima concentrazione di deposizione delle uova nella zona anteriore. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
Figura 2 . Timeline per la creazione di N. vitripennis mutanti dal microinjection. Timeline di raccolta degli embrioni vitripennis N. , CRISPR/Cas9 microiniezione e procedure di post-iniezione. N. vitripennis adulti sono stati permessi ad accoppiarsi in assenza di un sito di deposizione delle uova per 4 giorni (io). In seguito, un fresco, pupe di host Mosca di carne, S. bollata, collocato all'interno di un tappo di gomma piuma per esporre solo 0,5 cm dell'estremità posteriore, è stato introdotto per le femmine gravide per 45 min per consentire spesso (ii). Contemporaneamente iniezione materiali tra cui aghi di microinjection e componenti CRISPR/Cas9 sono stati preparati (iii). Gli embrioni sono stati raccolti dall'host (iv), allineati (v) e iniettati con componenti CRISPR/Cas9 (vi). Embrioni iniettati sono stati attentamente trasferiti un host pre-stung (vii) e incubati fino a completamente sviluppati (14 giorni) (viii). Quando gli adulti emersero, mutanti sono stati schermati per i fenotipi di previsto CRISPR/Cas9 indotto mutazioni nel gene dell'obiettivo (ix). L'intera procedura richiede generalmente 19 giorni per essere completato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
Figura 3 . Vetrino da microscopio modificate per fodera embrioni. (A) A vetrino coprioggetti. (B) un vetrino da microscopio. (C) un dispositivo di allineamento di embrione.Un vetrino coprioggetti possono essere incollato su un vetrino da microscopio attraverso il quale gli embrioni linea iniettabile. Lo scopo del coprivetrino è di agire come un bordo per consentire facile manipolazione e rivestimento degli embrioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
Figura 4 . Preparazione dell'iniezione dell'ago. (A) esempi di aghi di vetro alluminosilicato di buoni e cattivi. (B) i suggerimenti di un rilievo, correttamente smussato e scarsamente ago smussato. Tubi capillari di vetro alluminosilicato sono stati tirati utilizzando un estrattore micropipetta. Le punte dell'ago prodotte erano poi delicatamente aperto e raffinato utilizzando una Smussatrice. Il buon ago smussato ha una punta molto affilata, e l'ago smussato male ha una punta smussata. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tipo di vetro capillare</td>
			<td>SUTTER ago estrattore modello</td>
			<td>Calore</td>
			<td>Filamento</td>
			<td>Velocità</td>
			<td>Ritardo</td>
			<td>Tirare</td>
			<td>Pressione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quarzo</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicato di alluminio</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicato</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Impostazioni per estrattore dell'ago. Nota: Impostazione estrattore dell'ago variano da macchina a macchina quindi ogni laboratorio sarà necessario ottimizzare le proprie impostazioni di estrattore dell'ago. Questa tabella è stata modificata da Li et al. 21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA-1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">Totali embrioni</td>
			<td>Trapianto (10% di umidità)</td>
			<td colspan="4">Trapianto (70% di umidità)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sopravvissuti larve</td>
			<td>Sopravvissuti larve</td>
			<td colspan="3">Adulti sopravvissuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale (%)</td>
			<td>Totale (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Totale (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nessuna iniezione</td>
			<td>Nessuna iniezione</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqua</td>
			<td>Acqua</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>20 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>40 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>80 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>160 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>320 ng / µ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2. Iniezione e trapianto di sopravvivenza e mutagenesi tariffe basate su iniezioni delle concentrazioni differenti di sgRNA e Cas9. Questa tabella è stata modificata da Li et al. 21

Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire con successo una microiniezione negli embrioni di nasonia vitripennis al fine di facilitare la manipolazione genomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla biologia della nasonia vitripennis, come la produzione di veleno e la determinazione del sesso. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica è che consente la manipolazione diretta nel genoma della vespa e offre un'ampia varietà di modifiche genomiche avanzate.A dimostrare la procedura sarà Ming Li, un post-doc del nostro laboratorio. Per iniziare, allestisci diverse colonie di N. vitripennis posizionando da 200 a 500 adulti con un rapporto di tre a uno tra femmine e maschi in gabbie per dormitori per insetti. Mantenere le vespe a 25 gradi Celsius più o meno con il 30% di umidità relativa e un ciclo luce/buio da 12 a 12.Per due giorni, lasciare che le femmine accoppiate si nutrano di pupe fresche di S. bullata e di piccole goccioline di una soluzione di acqua di saccarosio da uno a dieci volumi. Per i due giorni successivi, rimuovere le pupe di mosconi per privare le vespe femmine di un sito di ovideposizione, rendendole molto gravide. Per mantenere freschi gli ospiti di S. bullota pupae, conservali a 4 gradi Celsius subito dopo averli ottenuti e rimuovili solo quando necessario.Distingui tra ospiti giovani che hanno un pupario di colore rosso e ospiti più anziani che hanno un pupario di colore più scuro. Consenti alle vespe femmine di parassitare nel giovane ospite posizionando singole pupe fresche di S. bullata in un tappo di schiuma con un foro delle dimensioni di una pupa tagliato al centro. Per la massima concentrazione di parassitizzazione e una più facile raccolta degli embrioni, esporre solo circa 0,2 centimetri dell'estremità anteriore dell'ospite, che è arrotondata, rispetto all'estremità posteriore, che è più spessa e contiene un'apertura simile a un cratere.Metti le pupe ospiti in questa disposizione nella gabbia e attendi circa 45 minuti per consentire alle vespe di parassitarle. Rimuovi gli ospiti parassiti recuperandoli a mano e picchiettando delicatamente o soffiando via eventuali vespe residue. Sostituirli con ostie fresche circa ogni 15 minuti per continuare a raccogliere gli ovuli in fase iniziale durante le iniezioni.Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinza per staccare con cura l'estremità posteriore del pupario esterno di un ospite appena parassitato per esporre le uova di N. vitripennis. Quindi, preparare un vetrino per l'allineamento dell'embrione utilizzando un adesivo liquido per incollare un vetrino coprioggetti su un vetrino pulito. Con un pennello umido a punta fine, spazzola accuratamente gli embrioni dall'ospite, assicurandoti di non danneggiare la pelle morbida e pupale dell'ospite.Quindi, con il pennello bagnato, trasferire circa 20 embrioni uno ad uno sul vetrino, immediatamente adiacente al lato del vetrino coprioggetti. Orientare l'estremità anteriore dell'embrione contro il bordo del vetrino di copertura, in modo che le estremità posteriori dell'embrione siano rivolte nella stessa direzione. Ciò consentirà una maggiore precisione dell'iniezione nella stessa posizione tra tutti gli embrioni.Dopo aver estratto gli aghi da iniezione secondo il protocollo di testo, smussare la punta dell'ago toccando leggermente la punta con una piastra abrasiva diamantata a 25 gradi Celsius per circa 10 secondi. Preparare la miscela per iniezione costituita da reagenti per la modificazione del genoma e tenerla in ghiaccio. Utilizzare una punta per microloader per caricare l'ago per iniezione con due microlitri di miscela per iniezione.Quindi, posizionare il vetrino con gli embrioni allineati sul tavolino di un microscopio composto. Inserire con cautela l'ago nell'estremità posteriore dell'embrione con un angolo verticale compreso tra 25 e 35 gradi. Quindi, iniettare da uno a cinque picolitri di miscela per iniezione e assicurarsi che l'embyro si gonfi leggermente con l'iniezione.Se si verifica un intasamento, provare a smussare nuovamente gli aghi. Il citoplasma degli embrioni di N. vitripennis è insolitamente viscoso e appiccicoso, il che porta a frequenti ostruzioni dell'ago. Iniettare circa 20-40 uova alla volta, quindi interrompere.Trasferire le uova iniettate con un pennello bagnato toccando leggermente le uova iniettate e metterle in un'ostia. Quindi, continuare l'iniezione, utilizzando un lotto di uova fresche e appena deposte. Idealmente, questo passaggio è più efficace quando una persona sta raccogliendo e allineando le uova, mentre un'altra persona sta iniettando componenti di modifica del genoma e trapiantando embrioni iniettati nelle pupe dell'ospite.Dopo la microiniezione, utilizzare un pennello bagnato per posizionare con cura fino a 40 embrioni G zero iniettati uno alla volta su una pupa di S. bullata precedentemente punta. Metti le pupe ospiti in una capsula di Petri con carta da filtro umida e batuffoli di cotone e incubale a 25 gradi Celsius con circa il 70% di umidità fino a quando gli embrioni iniettati si schiudono in circa uno o due giorni. È importante sottolineare che gli ospiti possono essere lasciati con un pupario staccato e le uova di N. vitripennis si svilupperanno normalmente, purché siano incubate in una camera umidificata per prevenire l'essiccazione.Dopo la schiusa degli embrioni G zero, trasferisci le pupe ospiti in una nuova capsula di Petri e incubale a 25 gradi Celsius e 70% di umidità. Monitorare quotidianamente le pupe ospiti e le larve G zero iniettate. Se le pupe ospiti hanno un cattivo odore, trasferire le larve iniettate a nuove pupe ospiti sane.Per un'efficace penetrazione dell'ago e microiniezione negli embrioni di N. vitripennis, diversi estrattori per micropipette sono stati testati con diversi tipi di aghi capillari in vetro con filamenti, tra cui quarzo, alluminosilinato e borosilicato, per avere una punta lunga simile all'ipodermica desiderata, efficace per la microiniezione di embrioni di N. vitripennis. I componenti di modifica del genoma utilizzati qui erano RNA guida misti e proteina cas9 per un editing del genoma mediato più nitido. In questo esperimento, un sgRNA mirato al gene del cinabro è stato iniettato in quantità variabili, insieme alla proteina cas9, in N.vitripennis.Questa tabella mostra che i tassi di sopravvivenza erano dose-dipendenti, poiché l'aumento della concentrazione di sgRNA e della proteina cas9 ha portato a una diminuzione dei tassi di sopravvivenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante fare attenzione a non perforare o essiccare gli embrioni di vespa durante la manipolazione o il trasferimento utilizzando con cura un pennello a punta fine inumidito o un plettro per embrioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare, microiniettare e trapiantare embrioni di vespa in modo efficiente al fine di eseguire con successo modifiche avanzate del genoma.

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

Vi presentiamo transgenesi transitori e silenziamento genico in Ciona intestinalis, un gruppo sorella chordate di vertebrati, utilizzando tecniche di microiniezione e elettroporazione. Tali metodi facilitano genomica funzionale in questo semplice invertebrato che dispone di caratteristiche rudimentali di vertebrati, tra cui notocorda e epiteli sensoriali della testa, e molti ortologhi di malattie associate geni umani.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Qui, descriviamo i metodi per iniezioni pupali e adulte efficienti in Nasonia vitripennis come alternative accessibili alla microiniezione embrionale, consentendo l'analisi funzionale dei geni di interesse utilizzando il silenziamento dell'RNA tramite interferenza dell'RNA (RNAi) o knockout genico tramite l'editing del genoma CRISPR / Cas9.

Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Qui sono presenti protocolli per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di cavallette di mais allo scopo di modificare il loro genoma tramite l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 o per l'aggiunta di elementi trasponibili marcati attraverso la trasformazione germinale.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Impara la microiniezione di embrioni e la tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis. Questo metodo consente modifiche ereditabili per studiare biologia delle vespe.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

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