Name: Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Scopri la tecnica di appiattimento e colorazione della corteccia cerebrale per visualizzare i moduli cellulari in modo stratificato nei mammiferi. Questo metodo consente analisi comparative dell'architettura corticale tra diverse specie.

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Questo lavoro è stato supportato da Humboldt Universität zu Berlin, il Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlino, il centro tedesco per Malattie Neurodegenerative (DZNE), il Ministero federale tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e Gottfried Wilhelm Leibniz premio del DFG. Ringraziamo Shimpei Ishiyama per la progettazione grafica eccellente e Juliane Diederichs per l'eccellente assistenza tecnica.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida tedesche sul benessere degli animali sotto la supervisione dei comitati etici locali (LaGeSo). Umano e pipistrello cervello dati sono stati derivati da Naumann et al. 5 la procedura riportata di seguito viene eseguita su un ratto adulto maschio di Wistar (ceppo: RJHan:WI).
1. aspersione ed estrazione del cervello
Nota: Al fine di ottenere un cervello omogeneamente fisso e privo di sangue, perfusione perfusione dell'animale è fortemente incoraggiata, come residui di sangue aumenta il segnale di fondo non specifico durante la colorazione. Tuttavia, è anche possibile ottenere sezioni appiattite dall'ONU-irrorato esemplare e li macchia. La facilità di movimentazione del campione varia con la concentrazione di fissativo utilizzato. Troppo poco fissazione aumenta il rischio di gestione danni al cervello durante la spianatura e taglio, mentre troppo alte concentrazioni abbassare la flessibilità per l'appiattimento e la qualità del segnale colorazione.
<ol><li>Via irrorare l'animale, utilizzando un ago di 23G. Per una guida più dettagliata, vedere Gage et al. 9<ol>
<li>Utilizzare fosfato tampone salino10 (PBS; 0,02 M; pH 7.4) per scovare il sangue dal cervello e il corpo dell'animale. Continuare fino a quando il liquido di infusione appare chiaro, con almeno 150 mL di PBS viene infusa attraverso il sistema vascolare. Nota: I risultati migliori si ottengono ad una pressione simile all'intervallo della pressione sanguigna fisiologica dell'animale viene irrorato (ad es., ratto: 120-130 mmHg). Facoltativamente, aggiungere alla soluzione per evitare la coagulazione di sangue11eparina (10 U/mL).</li>
		<li>Per correggere il cervello, via infondere un minimo di 100 mL paraformaldeide12 (PFA, 4%; in fosfato 0,1 M di tampone (PB)13) fino a quando il collo dell'animale è rigido. Attenzione: PFA è un potenziale cancerogeno. Nota: Migliori risultati istochimici attività colorazione, ad esempio per la citocromo ossidasi, si ottengono, quando si utilizza 2% PFA. Per altro la macchiatura, come immunohistochemistry, 4% PFA è preferito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre il cervello dal cranio. Nota: Vedere Gage et al. 9 per i dettagli.<ol>
<li>Isolare la testa con le grandi forbici o cesoie dell'osso.</li>
		<li>Utilizzando le forbici bene, tagliare la pelle lungo la linea mediana dal collo al naso. Tirare la pelle per esporre il cranio. Rimuovere il collo e dei muscoli temporali utilizzando forbici bene.</li>
		<li>Rendere un midline tagliare attraverso l'osso interparietale a partire dal magnum di orifizio fino all'osso parietale.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare l'osso interparietale. Far scorrere bene forbici lungo la sutura sagittale e tagliare dalla parte posteriore del parietale all'estremità anteriore delle ossa frontali.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare parietali e ossa frontali. In alternativa, sollevare le ossa distanza usando il forcipe. Utilizzare un cucchiaio per tagliare le corde del nervo ventrale e rimuovere il cervello. Trasferire il cervello al PB (0,1 M; pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Difficoltà cervelli ONU-irrorati mediante immersione in 4% PFA per 1-3 h a 4 ° C (a seconda delle dimensioni del cervello e la sonda: toporagno: ~ 1h, umani: ~ 3 h). Nota: Per grandi e girencefalici cervelli come gli esseri umani, isolare e tagliare fuori la zona di interesse per ridurre i tempi di fissazione.</li>
	<li>Per ottenere più grandi aree corticali in una sezione, appiattire il cervello prima della post-fissazione ulteriore; procedere al passaggio 2. Tuttavia, per ottenere sezioni di più difficile da raggiungere aree come la corteccia di entorhinal mediale, post-fissare il cervello nel 4% PFA per 24 h prima di procedere al passaggio 2.</li>
</ol>2. dissezione e appiattimento del cervello
<ol><li>Separare gli emisferi del cervello utilizzando una lama di rasoio (lissencephalic cervelli) o bisturi (girencefalici cervelli). Nota: Se il cervello post-non è stato risolto, è suscettibile ai danni di movimentazione.</li>
	<li>Passaggio facoltativo per favoreggiamento stima di registrazione ed il restringimento di sezione successiva:<ol>
<li>La corteccia in un'area di non-interesse, la puntura con un ago di 35G normale alla superficie corticale. Ripetere il passaggio due volte alle distanze definite lungo il foglio corticale. Per determinare la distanza lungo il foglio corticale, utilizzare un thread pre-tagliato a lunghezza fissa (ad es., 5mm) e posarlo lungo la superficie corticale per determinare i punti di foratura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic cervelli: rimuovere le strutture subcortical utilizzando una spatola per dissezione. Critico: Mantenere umido con PB (0,1 M; pH 7.4) durante l'intera procedura il cervello.<ol>
<li>Tenere il cervello dal cervelletto e inserire delicatamente la spatola per aprire un piano di dissezione in callosum del corpus. La punta rotonda di spatola dovrebbe puntare lontano la corteccia.</li>
		<li>Far scorrere la spatola ulteriormente e tirare delicatamente fino a quando la spatola è tra il talamo e la corteccia. Strutture subcortical separate con movimenti di graffiare.</li>
		<li>Ispezionare l'emisfero per anche lo spessore. Nota: Qualsiasi regioni irregolare potrebbero comportare un gradiente trans-strato durante il sezionamento. Per il sezionamento tangenziali, utilizzare un bisturi per fare un taglio pulito attraverso il cervello, parallela alla superficie pial della regione da cui sezioni tangenziali sono desiderati.</li>
		<li>Passaggi facoltativi per migliorare la qualità di conversione della trasparenza:<ol>
<li>Fare un taglio pulito attraverso il corpo striato, nucleo accumbens e nella corteccia orbitofrontal, poiché aumentano lo spessore della corteccia nella regione laterale. Inoltre, aggiungere un alleviamento taglio alla base della regione interna della corteccia prefrontale, che permette il dispiegarsi delle porzioni mediale della corteccia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare l'emisfero (corteccia rivolto verso il basso) su un vetrino. Procedere al punto 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girencefalici cervelli: rimuovere la materia bianca a svolgersi i gyri (per protocolli dettagliati, vedere: Sincich et al. 14; Tootell e Silverman15). Critico: Uso PB (0,1 M; pH 7.4) per mantenere il cervello umido in tutti i tempi.<ol>
<li>Mettere l'area di interesse su una carta da filtro umida in un grande piatto di Petri, con la corteccia rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Rimuovere la membrana aracnoide e la pia utilizzando due pinze.</li>
		<li>Utilizzare un batuffolo di cotone umido e inserire delicatamente in ogni solco per staccare aderenze tra circonvoluzioni.</li>
		<li>Girare il cervello intorno utilizzando un'altra carta da filtro umido.</li>
		<li>Utilizzare due curve micro spatole per dispiegare i gyri singoli. Utilizzare il lato convesso delle spatole per stuzzicare a pezzi la materia bianca fino ad arrivare vicino l'estremità concava del gyrus. Utilizzare un batuffolo di cotone umido e procedere con movimenti vorticosi di raggiungere l'estremità concava del gyrus.</li>
		<li>Stuzzicare apart gyri singoli. Se necessario, aggiungere alleviare piccoli tagli se la tensione è troppo alta.</li>
		<li>Appiattire il cervello spiegato nella capsula di Petri o un contenitore simile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Facoltativamente, posto di cervelli più grandi su una spugna filtro carta coperta, per garantire che le regioni non asciugarsi.</li>
	<li>Posizionare due pezzi arrotolati di argilla su entrambi i lati. Critico: Come lo spessore dell'argilla definisce quanto l'emisfero può essere appiattito, assicurarsi che l'argilla è 10-20% più sottile di corteccia del ONU-appiattita.</li>
	<li>Premere delicatamente una seconda diapositiva vetro/piccola capsula di Petri sulla corteccia finché l'emisfero è completamente piatto. Per ottenere i migliori risultati per una regione desiderata, posizionare il vetrino prima sulla zona rispettiva. Per ottenere i migliori risultati per i cervelli lissencephalic, posizionare il vetrino tangenzialmente alla parte laterale prima e applicare una pressione concentrata su questa regione.</li>
	<li>Mettere un peso (per esempio, un vetro da orologio in ceramica) sulle diapositive di vetro/Petri e appiattire l'emisfero per 3-5 h a 4 ° C in PB.</li>
	<li>Per post-fissazione, rilasciare la pressione e rimuovere le diapositive di vetro. Mettere l'emisfero appiattito in PFA (mobile) per 24 h in un agitatore a 4 ° C. Nota: Si ottengono migliori risultati per colorazioni istochimiche attività quando si utilizza 1% PFA. Per altre colorazioni, come immunohistochemistry, al posto del cervello non perfusi, 2% PFA può essere utilizzato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'appiattimento di un emisfero corticali del ratto e la visualizzazione dei moduli nella corteccia somatosensoriale. Successivamente la perfusione di perfusione, il cervello di un topo è stato dissecato (A). Strutture subcortical sono stati rimossi e corteccia è stato appiattito fra due vetrini in tampone fosfato (B). Appiattito emisfero (C) era post-fisso, tangenzialmente sezionato e macchiato per attività dell'ossidasi del citocromo (D). Scala bar = 1 cm. r: rostrale, c: Caudal, l: laterale, m: mediale. Figura adattata da Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. taglio di sezioni tangenziali
Nota: A seconda delle esigenze dei protocolli di colorazione, la procedura di taglio e lo spessore possono essere adattati. Un vibratomo è stato usato per tagliare gli emisferi per un'ulteriore elaborazione istochimica (punto 3.2) a 80-150 µm. Tuttavia, per l'elaborazione di immunohistochemical, sezioni più sottili sono desiderati e un congelamento microtomo è stato usato per sezionamento (punto 3.3) a 10-60 µm. Guarda il Video 1.
<ol><li>Lavare l'emisfero appiattito in PB (0.1 m; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un vibratomo.<ol>
<li>Mettete l'emisfero tangenzialmente sul supporto per affettare. Facoltativamente, premere di nuovo delicatamente con un vetrino prima di fissarla in posizione (ad es., con colla a presa rapida). Nota: Ridurre al minimo la quantità di colla utilizzata, perché gli artefatti di taglio potrebbero essere causa il piccolo spessore degli emisferi appiattiti.</li>
		<li>Tagliare l'emisfero dall'estremità più spessa e più stabile verso l'estremità più sottile (posteriore a anteriore, qui) lo spessore desiderato. Procedere al punto 3.4. Nota: Se le concentrazioni basse di fissazione sono state usate, tagliato ad una velocità lenta e un'elevata ampiezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un congelamento microtomo.<ol>
<li>Cryoprotect il cervello immergendolo in una soluzione di saccarosio al 30% (in PB) fino a quando si affonda. Nota: A seconda delle dimensioni del tessuto essere prelevate, affondando nella soluzione può variare da poche ore ad alcuni giorni. Per i più grandi cervelli crioprotezione alternativi metodi potrebbero essere considerati (Vedi Antonella et al. 16).</li>
		<li>Formare un ghiaccio base del congelamento microtomo per montare il cervello. Costruire il base di ghiaccio di congelamento PB sul viso di blocco del congelamento microtomo. Critico: Assicurarsi che la superficie della base del ghiaccio sia parallela alla lama del microtomo. Per effettuare questa operazione, tagliare il ghiaccio vuoto base utilizzando la lama del microtomo per allineare esattamente la base di ghiaccio parallela alla superficie di taglio.</li>
		<li>Incorporare il cervello in mezzo di congelamento e montarlo sul viso di blocco del microtomo con l'area di interesse parallelo alla faccia del blocco. Faccia la superficie pial del cervello verso la faccia di blocco del microtomo. Critica: Regolare la temperatura di congelamento a seconda delle dimensioni del campione; temperature più elevate assicurano migliore sezione integrità durante il sezionamento, ma più grandi sezioni richiedono temperature più basse per congelare il campione in modo uniforme.</li>
		<li>Tagliare il cervello tangenzialmente allo spessore richiesto (velocità di taglio più lento e uniforme risultato nella migliore qualità di sezione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni in PB per 15 minuti su un agitatore.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: video schematico della tangenziale di sezionamento da una corteccia di entorhinal mediale del ratto e il layout dei moduli Parasubiculare ed entorinale. La corteccia di entorhinal mediale di un cervello del roditore è situata all'estremità posteriore della corteccia ed è inclinata verso il lato mediale e ventrale. Sezioni tangenziali sono ottenute con un coltello lungo questo angolo di orientamento. Di conseguenza, colorazione specifica cellula-tipo appropriato rivela strutture modulari nella corteccia di entorhinal mediale e Parasubiculare adiacente. Video tratto da Ray e Brecht8. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
4. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura dell'ossidasi del citocromo
Nota: Diversi protocolli di colorazione sono stati sviluppati per il rilevamento di istochimica di attività dell'ossidasi del citocromo, ad es., in primo luogo da Wong-Riley17 e successivamente modificati da Divac et al. 18 il presente protocollo è basato su quello di Divac et al. 18, poiché l'uso di solfato di nichel-ammonio (NiAS) si traduce in un maggiore contrasto e meglio definiti moduli in aree corticali macchiate.
<ol><li>Preparare il citocromo ossidasi soluzioni di colorante (Vedi Divac et al. 18). per 10 mL di soluzione, aggiungere: 10 mL di tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4), 400 mg di saccarosio, 12,5 mg NiAS, citocromo C, 6mg diaminobenzidina (DAB) di 2 mg. Attenzione: DAB e NiAS sono cancerogene. Nota: Aggiungere DAB appena prima dell'incubazione delle sezioni.</li>
	<li>Lavare le sezioni nel tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4) su un agitatore per 15 min.</li>
	<li>Incubare le sezioni nella soluzione colorante a temperatura ambiente in un agitatore. Nota: Osservare la velocità della colorazione. Se non c'è nessuna reazione visibile, modificare in incubazione a 37 ° C. A seconda della quantità di fissazione, la colorazione può essere osservata dopo 10 min o in diverse ore.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 4% PFA; Questo impedisce indesiderate ri-morire e aumento del segnale di fondo.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte utilizzando tampone HEPES per 10 min.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni sulle lastre di vetro.</li>
	<li>Disidratare le sezioni con una riga di alcol crescente:<ol>
<li>Lavare i vetrini in etanolo al 60% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo di 80% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo al 96% per 2 min. lavare i vetrini in etanolo al 100% per 3 min. lavare i vetrini in isopropanolo per 5 min. lavare i vetrini in xilene per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immediatamente aggiungere un mezzo di montaggio a indurimento rapido e un vetrino coprioggetti. Critica: Non usare mezzi di montaggio a base acqua, come NiAS sarà lavato e degradare la colorazione.</li>
	<li>Mantenere le sezioni a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>5. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura Immunohistochemical
Nota: Protocolli multipli sono disponibili per l'immunoistochimica, ottimizzato per il campione e il tipo di sonda. Gli adattamenti possono essere fatto come richiesto, dalla variazione delle concentrazioni di anticorpi, agenti permeabilizing e tempi di incubazione. Il seguente protocollo porta a buoni risultati per la rilevazione di una vasta gamma di anticorpi e la visualizzazione di sonde fluorescenti.
<ol><li>Lavare le sezioni in PBS (0,1 M; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Facoltativo: Eseguire ricupero dell'antigene per smascherare un epitopo usando un bagno di acqua (basato su Jiao et al. 19; per metodi alternativi, vedere Pileri et al. 20).<ol>
<li>Preriscaldare un bagno di acqua a 80 ° C. Preparare tri-sodio citrato buffer19 (pH 8.0) e preriscaldarlo nel bagno d'acqua a 80 ° C.</li>
		<li>Trasferire le sezioni in tampone citrato tri-sodio. Incubare le sezioni per 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Raffreddare le sezioni fino a temperatura ambiente</li>
		<li>Lavare le sezioni in PBS per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni due volte in PBS-X (0,5% Triton-X, in 0.1 M PBS) per 15 min.</li>
	<li>Bloccare gli epitopi aspecifici incubando le sezioni in una soluzione di albumina di siero bovino (BSA; 2,5%) e Triton-X (0,75%) in PBS per 2 h.</li>
	<li>Incubare le sezioni in anticorpo primario, ad esempio, calbindina - D28k (1:5, 000, 1% BSA in PBS-X), per 2-3 giorni su un agitatore a 4 ° C. Nota: Una diluizione ottimale per l'anticorpo primario dipende l'anticorpo specifico utilizzato. Fare riferimento alle informazioni del fabbricante per ottenere criteri di diluizione per un anticorpo specifico. Anticorpi multipli possono essere utilizzati insieme, ma devono essere sollevati contro diverse specie.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte in PBS per 15 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare le sezioni pernottamento in anticorpo secondario (1: 200, 1% BSA in PBS) a 4 ° C in un agitatore. Nota: Più anticorpi secondari possono essere utilizzati a differenti spettri se gli anticorpi primari multipli sono stati usati.</li>
	<li>Lavare l'anticorpo secondario lavando le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti ciascuno.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni su un vetrino per microscopio. Nota: Le sezioni devono ancora essere umide prima di montare il vetrino coprioggetto.</li>
	<li>Applicare liquido di montaggio adatto per fluorescenza coloranti su sezioni di tessuto e applicare un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Asciugare le sezioni per 1 h.</li>
	<li>Per l'archiviazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto con smalto e tenere al buio a 4 ° C.</li>
</ol>

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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Modularità nella corteccia cerebrale è stato identificato usando una varietà di tecniche. I primi studi in genere identificati corticale moduli o visualizzando delle cellule dense regioni, o un'assenza di fibre1. I metodi successivi hanno utilizzato la presenza di fasci dendritiche24, afferenze da una particolare regione25, o l'arricchimento di neurotrasmettitori26. Qui dimostriamo due tecniche, l'istochimica (i) del citocromo...

Alcuni dei più significativi cambiamenti nella struttura del cervello attraverso la filogenesi può essere osservata nella corteccia cerebrale. Nonostante le differenze significative, la corteccia degli animali segue uno schema comune e possa essere suddivisi in due modi distinti, di strati e zone1. Strati corticali siano parallele alla superficie del cervello e variano in numero da 3 strati in cortecce rettile2 a 6 strati in cortecce dei mammiferi1. Aree corticali sono invece distinte regioni della corteccia che corrispondono in gran parte alle funzionalità distinte, ad esempio, la corteccia somatosensoriale è coinvolto nella sensazione di tocco o la corteccia visiva nell'elaborazione di input visivi. Queste aree corticali possono spesso essere suddivisi patch o moduli3, che si ripetono regolarmente strutture anatomiche, essenzialmente trovati parallele alla superficie pial del cervello. Moduli corticale possono essere limitati a un particolare livello4o estendono in diversi strati5.
Metodi standard di sezionamento del cervello coinvolgono sezioni normale alla superficie del cervello, come coronale e sagittale. Mentre questi metodi possono essere utilizzati per visualizzare moduli corticale, una moltitudine di caratteristiche interessanti possa essere rivelata quando i moduli corticali sono visualizzati tangenzialmente, in un piano parallelo alla superficie del cervello. Per esempio, somatosensoriali moduli nel cervello del roditore che rappresenta baffi, appaiono come barili quando visualizzato normale alla superficie del cervello, e così le regioni derivano la corteccia di canna di nome. Sulla visualizzazione le botti in un orientamento tangenziale, esse però rivelano una baffo-mappa, con le canne essendo disposti in un orientamento topografico del mirroring l'esatta disposizione dei baffi sulla superficie esterna del corpo. In alcuni casi, disposizione modulare è sfuggito anche rilevamento per lunghi periodi, quando visualizzati in un modo non tangente. La corteccia di entorhinal mediale, è noto per la presenza di celle della griglia, i neuroni che il fuoco in un reticolo esagonale regolare quando un animale attraversa un ambiente. Anche se è una zona fortemente indagata, fino a poco tempo fa, la presenza di patch o moduli di cellule nella corteccia entorinale mediale, che sono fisicamente disposti in un reticolo esagonale6, era fuggito il rilevamento. La presenza e la disposizione di questi moduli, nel cervello del ratto, è stata facilitata effettuando sezioni tangenziali della corteccia entorinale mediale e indagando la citoarchitettura in maniera strato-saggio.
A seguito di sezionamento, il particolare aspetto della visualizzazione dei moduli corticale può essere realizzato anche in più modi. Classicamente, gli studi hanno delineato moduli basati sul cellulare densità o fibra di formato1. Un altro approccio popolare è l'uso di istochimica di citocromo ossidasi, che rivela le aree di maggiore attività8. Approcci più recenti includono guardando tipi di cellule geneticamente determinata, distinti sulla base della loro espressione di proteina profili6,8.
In questo studio, evidenziamo i metodi per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi, ottenere sezioni tangenziali appiattite e visualizzare corticale moduli basati sul citocromo ossidasi istochimica e immunoistochimica di proteine specifiche del tipo di cella.

<table><tbody><tr><td><forte>Colorazione con citocromo ossidasi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c da cuore equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3'Diaminobenzidina tetracloridrato idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccarosio</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonio nichel (II) solfato esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Recupero dell'antigene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl</td><td>Roth 3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium idrogeno fosfato diidrato</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunoistochimica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindina D-28k purificata da intestino di pollo, Swant monoclonale di topo</td><td></td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindina D-28k da calbindina D-28k di ratto ricombinante, Swant RRID policlonale di coniglio</td><td></td><td>: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina V, Carl senza biotina</td><td> Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Montaggio o congelamento dei mezzi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescenza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt ( istochimica)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento dei tessuti</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Alcohol dehydration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolo</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dispositivi/strumenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinze - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Ropeps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per Ossa - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici smussate</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a iride fine</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

La corteccia del cervello dei mammiferi è parcellated in sottostrutture distinte o moduli. Moduli corticali in genere siano parallele al foglio corticale e possono essere delineate da alcuni metodi istochimici e immunohistochemical. In questo studio, segnaliamo un metodo per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi e appiattirli per ottenere parallelo di sezioni al foglio corticale. Abbiamo ulteriormente evidenziare selezionato istochimiche e immunohistochemical metodi per elaborare questi appiattito tangenziale sezioni per visualizzare moduli corticale. Nella corteccia somatosensory di vari mammiferi, eseguiamo la citocromo ossidasi istochimica per rivelare il corpo mappe o corticale moduli che rappresenta diverse parti del corpo dell'animale. Nella corteccia entorinale mediale, un'area dove vengono generate le celle della griglia, utilizziamo metodi di immunohistochemical per evidenziare i moduli dei neuroni geneticamente determinati, che sono organizzati in un modello di griglia nel foglio di corticale attraverso le diverse specie. Nel complesso, mettiamo a disposizione un framework per isolare e preparare layer-wise appiattito sezioni corticale e la visualizzazione di corticale moduli utilizzando istochimiche e immunohistochemical metodi in un'ampia varietà dei cervelli dei mammiferi.

Abbiamo ottenuto sezioni appiattite corticali della corteccia somatosensory in una varietà di cervelli ed elaborato li per la citocromo ossidasi istochimica visualizzare i moduli somatotopica che rappresenta diverse parti del corpo. Questo approccio comparativo permette di studiare le forze evolutive che corteccia forma, ad esempio, risultati altamente conservata rappresentazione delle vibrisse baffi in roditori e lagomorpha come botti21 (<strong class="xf...

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura per l'appiattimento e la colorazione della corteccia è quello di visualizzare i moduli cellulari nelle regioni corticali in modo stratificato. Questo metodo può rispondere a domande chiave nelle neuroscienze, come il modo in cui la struttura corticale si diffonde nel cervello e come potrebbe essere correlata alla funzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile confrontare l'architettura corticale in modo laminare e confrontare vari aspetti di essa, come il modo in cui è conservata l'evoluzione della classe o il modo in cui varia la funzione.A dimostrare la tecnica saranno Simon Lauer e Undine Schneeweib, studentessa e tecnica del laboratorio della professoressa Michelle Black. Per iniziare, perfondere transcardicamente l'animale per ottenere un cervello fissato in modo omogeneo e privo di sangue. Dopo aver rimosso il cervello, immergerlo in un tampone fosfato molare 0,1.Se si desiderano sezioni con ampie aree corticali, appiattire il cervello prima di un'ulteriore postfissazione. Tuttavia, per ottenere sezioni di aree più difficili da raggiungere, come la corteccia entorinale mediale, postfissare il cervello al 4% di PFA per 24 ore prima di appiattire. Prepararsi a mantenere il cervello umido con tampone durante l'intera dissezione.Per iniziare, separa gli emisferi usando un bisturi. Se il cervello non è stato fissato, fai attenzione quando lo maneggi. Successivamente, mentre si fissa il cervello per il cervelletto, inserire delicatamente la spatola per aprire un piano di dissezione nel corpo calloso.La punta rotonda della spatola dovrebbe puntare lontano dalla corteccia. Quindi, manipola la spatola per dividere il talamo e la corteccia. Quindi, separa le strutture sottocorticali usando una lama di rasoio.Quindi, separa le strutture sottocorticali usando un bisturi o il bordo della spatola. Per migliorare l'appiattimento, fare un taglio netto attraverso lo striato, il nucleo accumbens e la corteccia frontale orbitale, poiché aumentano lo spessore della corteccia nella regione laterale. Quindi aggiungere un taglio di sollievo alla base della regione interna della corteccia prefrontale.Ciò consentirà il dispiegamento delle porzioni mediali della corteccia. Ora, posiziona una corteccia emisferica su un vetrino. Quindi, posiziona due cilindri di argilla su entrambi i lati del tessuto.L'argilla deve essere dal 10 al 20% più sottile del tessuto cerebrale, poiché l'argilla definisce l'entità dell'appiattimento. Quindi, posiziona un lato di vetro tangenzialmente sulla corteccia, contattando prima la parte laterale. Quindi, imposta un peso sul vetro, con la massa centrata sulla parte laterale.Ora, lascia riposare l'assemblaggio per tre o cinque ore in tampone fosfato a quattro gradi Celsius. La vera chiave di questa preparazione è quella di ottenere il cervello il più piatto possibile, poiché questo ha il maggiore impatto sulla visualizzazione della mappa corticale. Infine, se necessario, postfissa il cervello.Trasferire l'emisfero appiattito all'1% di PFA o al 2% di PFA se non è stato prelevato da un animale perfuso. Quindi, lasciare riposare per 24 ore a 4 gradi Celsius, agitando delicatamente. Per prima cosa, lavare l'emisfero appiattito in tampone fosfato per 15 minuti.Quindi, affetta l'emisfero tangenzialmente su un vibratomo. Fissare il tessuto in posizione utilizzando un piccolo volume di cianoacrilato e premendo delicatamente. Fai attenzione, poiché troppa colla può portare a tagliare artefatti.Ora, taglia l'emisfero dall'estremità più spessa e stabile verso l'estremità più sottile allo spessore richiesto. Se sono state utilizzate basse concentrazioni fissative, tagliare il tessuto lentamente con un'ampiezza elevata. Successivamente, lavare il tessuto sezionato in un tampone hepes per 15 minuti con una leggera agitazione.Durante il lavaggio, preparare una soluzione fresca per la colorazione della citocromo ossidasi. E aggiungi il componente DAB appena prima di usarlo. Ora, incubare le sezioni nella soluzione colorante appena fatta a temperatura ambiente con l'agitatore e tenere d'occhio.A seconda della quantità di fissazione, la colorazione potrebbe essere osservabile in 10 minuti o richiedere diverse ore. Se la reazione è troppo lenta, aumentare la temperatura a 37 gradi Celsius. Per fermare la reazione, trasferire le sezioni in un bagno di PFA al 4% e lasciarle incubare per 15 minuti con una leggera agitazione.Quindi, lavare le sezioni tre volte, con un tampone hepes per 10 minuti per lavaggio. A questo punto, montare e asciugare le sezioni su vetrini. E disidratarli usando bagni di etanolo progressivamente più forti.Quindi, lavare i vetrini in isopropanolo per cinque minuti, seguiti da xilene per cinque minuti. Dopo il bagno di xilene, aggiungere immediatamente un mezzo di montaggio a indurimento rapido, non a base d'acqua. I mezzi a base d'acqua degraderanno la macchia.Dopo aver aggiunto un vetrino coprioggetto, conservare i vetrini a quattro gradi Celsius fino a quando non vengono ripresi. Le sezioni corticali della corteccia somatosensoriale in una varietà di cervelli sono state elaborate, utilizzando le procedure descritte. Questo approccio comparativo consente lo studio delle forze evolutive che modellano la corteccia, come la rappresentazione altamente conservata del vibrisser mistificatore nei roditori e nei lagomorfi come barili.L'architettura della corteccia entorinale mediale è stata osservata sezioni parallele alla superficie della buccia, utilizzando la sezione tangenziale della corteccia entorinale medica in topi, ratti e pipistrelli della frutta egiziani. Inoltre, i cervelli umani sono stati elaborati utilizzando un delicato appiattimento della corteccia e delle fette tangenziali. Tutti i cervelli sono stati crioconservati e sezionati su un criostato a 60 micron.L'immunocolorazione è stata utilizzata per marcare i moduli di cellule parameatali positive alla calbindina. Nella corteccia entorinale i moduli della calbindina mostrano una notevole periodicità in ogni specie, e variano in dimensioni solo di un fattore 10, attraverso una variazione di 20.000 volte nelle dimensioni del cervello. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere sezioni tangenziali per l'analisi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un paio d'ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di appiattire correttamente il cervello, invece delle dimensioni, della qualità o dei risultati finali. Non dimenticare che lavorare con agenti come PFA e DAB può essere estremamente pericoloso e dovresti sempre indossare indumenti protettivi e lavorare sotto la luce del campo.

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Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la...

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Il video dimostra la preparazione di fette di cervello collicolo-talamocorticale da cervelli di cuccioli di topo. Un cervello isolato viene allineato su un vetrino marcato e tagliato ad angolo per allineare il mesencefalo uditivo e il proencefalo sullo stesso piano. Il cervello viene quindi tagliato utilizzando un vibratomo e le fette contenenti le principali strutture uditive del mesencefalo e del proencefalo vengono trasferite in una camera di contenimento per la conservazione.

Preparazione di fette collicolo-talamocorticali da un cervello di cucciolo di topo

&lt;p style='altezza-linea:1.2;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'&gt;Fonte: Lauer, S. M., et al. Visualizzazione dei moduli corticali in cortecce di mammiferi appiattite. J. Vis. Exp. &lt;span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;(2018) Questo video mostra un metodo per visualizzare i moduli...

Imaging istochimico di moduli corticali in sezioni cerebrali appiattite

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

Qui esempiamo una procedura per l'esecuzione di immagini su larga scala Ca 2+ con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi liberamente spostati. Centinaia di cellule attive possono essere osservate simultaneamente utilizzando un microscopio a testa in miniatura accoppiato con una sonda a prisma implantato.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Qui, presentiamo due protocolli per la registrazione della micro-elettrocorticografia ad alta densità (μEcoG) in ratti e topi, inclusi metodi chirurgici, di impianto e di registrazione. Le registrazioni μECoG vengono eseguite in combinazione con la registrazione di politrodi laminari nella corteccia uditiva del ratto o con la manipolazione optogenetica dell'attività neurale nella corteccia somatosensoriale del topo.

Indagini multiscala sull'elaborazione corticale integrando politrodi laminari e optogenetica con la microcorticografia nei roditori

Scopri la tecnica di appiattimento e colorazione della corteccia cerebrale per visualizzare i moduli cellulari in modo stratificato nei mammiferi. Questo metodo consente analisi comparative dell'architettura corticale tra diverse specie.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

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