Analisi di riparazione della membrana cellulare usando un microscopio a due fotoni Laser

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la riparabilità della membrana plasmatica nelle cellule dei pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella distrofia muscolare, come ad esempio qual è la relazione tra una data mutazione e la cinetica di risigillatura della membrana. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione in tempo reale della cinetica di risigillatura della membrana nelle cellule viventi.

Inizia coltivando le cellule dei fibroblasti in un pallone T225 contenente 40 millilitri di terreno di crescita in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Quando la coltura raggiunge il 70-80% di confluenza, sciacquare le cellule due volte con 40 millilitri di PBS per lavaggio, seguiti dall'aggiunta di cinque millilitri di tripsina allo 0,05% per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con 40 millilitri di terreno di crescita fresco e seminare due millilitri di cellule a una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro in piastre con fondo di vetro rivestite di collagene da 35 millimetri per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Aggiungere 150 microlitri di terreno fresco privo di siero a una provetta da 1,5 millilitri per coltura di trasfezione. Quindi aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione a ciascuna provetta e incubare le provette per almeno cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione delle provette, aggiungere 175 microlitri di terreno derivato dal siero e 3,5 microgrammi di DNA plasmidico di disferlina a un'ulteriore provetta da 1,5 millilitri per piastra.

Quindi combinare 150 microlitri della soluzione di DNA plasmidico con 150 microlitri del reagente di trasfezione in una nuova provetta per piastra per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. La mattina successiva, sostituire il terreno di coltura con due millilitri di terreno derivato dal siero. Al termine dell'incubazione, distribuire uniformemente tutti i 300 microlitri di soluzione plasmidica su ciascuna piastra e incubare le piastre per 24 ore nell'incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, sostituire il surnatante plasmidico con un terreno di coltura fresco e rimettere le piastre nell'incubatore per altre 24 ore. Per preparare le cellule per un test di ferita a due fotoni, sciacquare una volta le colture trasfettate con un millilitro di soluzione di Tyrode. Quindi aggiungere alle cellule un millilitro di soluzione fresca di Tyrode integrata con un microlitro di colorante FM4-64 da 2,5 millimolari.

Successivamente, utilizzando un microscopio confocale invertito, creare un bersaglio di 0,2 per due micron nel software del microscopio e posizionare il bersaglio sul bordo della membrana cellulare in modo che la linea del bersaglio si sovrapponga e si trovi perpendicolare alla membrana cellulare. Seleziona un laser al neon all'elio da 543 nanometri per eccitare il segnale del colorante FM e un laser ad argon da 488 nanometri per eccitare il segnale GFP e imposta l'intervallo di rilevamento rispettivamente da 600 a 760 nanometri e da 500 a 550 nanometri. Quindi crea una serie temporale di cinque minuti di scansioni sequenziali di immagini.

Per generare una lesione di membrana, utilizzare un laser a due fotoni a 820 nanometri al 15% di potenza laser con 10 iterazioni per sbiancare le cellule 25 secondi dopo l'inizio della serie temporale. Per quantificare la fluorescenza del colorante FM4-64, utilizzare il software per disegnare una regione di interesse di sei micron per sei e posizionare la regione di interesse adiacente alla posizione della ferita all'interno della cellula. Quindi sottrarre il valore di fondo e dividere l'aumento netto per il valore di fluorescenza al tempo zero per calcolare i valori di fluorescenza relativi per ogni punto temporale.

Le cellule sane dei fibroblasti umani mostrano bassi livelli di attivazione della fluorescenza FM4-64 dopo la ferita laser, mentre i fibroblasti dei pazienti non trattati mostrano un alto grado di intensità di fluorescenza relativa dopo la lesione. Le cellule dei pazienti che sono state trasfettate con plasmide di disferlina a lunghezza intera dimostrano una ridotta intensità di fluorescenza relativa di FM4-64 rispetto ai controlli dei pazienti non trattati, ma simile ai valori di fluorescenza osservati nei controlli sani. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le cellule moriranno lentamente nella soluzione tampone, quindi lavora rapidamente e passa a cellule fresche a intervalli regolari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rigenerare le lesioni della membrana utilizzando un microscopio a due fotoni e di come quantificare la risigillatura della membrana in tempo reale.