Name: Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Scopri come generare librerie Hi-C ad alta risoluzione da embrioni di Drosophila melanogaster in fasi precoci. Questo metodo consente di studiare l'architettura della cromatina e la regolazione genica durante lo sviluppo.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla società Max Planck. C.B.H. è stato sostenuto da una borsa di studio della scuola di ricerca internazionale Max Planck – biomedicina molecolare. Ringraziamo Shelby Blythe ed Eric Wieschaus per gentilmente fornire la linea di melanogaster della drosofila eGFP-PCNA.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato qui è molto efficace nella generazione di mappe di alta qualità dell'architettura della cromatina in primi embrioni della drosofila . Rispetto ad un precedente protocollo34, l'approccio descritto qui utilizza un sono aggiornati in situ Hi-C procedura5, con conseguente elaborazione più veloce, maggiore risoluzione e meno uso di reagente. La procedura complessiva, compreso il protocollo di Hi-C in situ è previsto di lavorare su una vasta gamma di sistemi sperimentali oltre Drosophilae fasi. Poiché il protocollo ha un requisito di ingresso basso, potrebbe essere utilizzato anche su popolazioni di cellule isolate. In Drosophila, quando utilizza il protocollo per gli embrioni nell'intervallo descritto qui, alcuni parametri, in particolare la fissazione del materiale, potrebbe essere necessario essere regolata. Poiché più vecchi embrioni si sviluppano una cuticola altamente impermeabile, aumentare la concentrazione di formaldeide e prolungare la fissazione può essere appropriati. Per la raccolta degli embrioni nelle fasi diverse nucleare ciclo 14, i tempi di incubazione degli embrioni a 25 ° C nel passaggio 1.4 devono essere regolato come segue: ciclo nucleare 12, 70 min; ciclo nucleare 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 03:30 h.
Durante le divisioni di 13 clivaggio (fase 1-4), la densità di nuclei raddoppia ad ogni divisione. I nuclei possono essere identificati facilmente da loro brillante fluorescenza di GFP. Durante la mitosi, eGFP-PCNA non si trova nel nucleo, e il suo segnale è dispersa in tutto l'embrione. Questa caratteristica rende l'identificazione degli embrioni che stanno subendo una divisione di clivaggio sincrono possibile. Per studiare la conformazione della cromatina, questi embrioni mitotici non sono solitamente desiderabili, poiché l'organizzazione mitotica della cromatina è drasticamente diverso da quello di organizzazione l'interfase35. È possibile adattare il protocollo specificamente selezionare embrioni sottoposti a una divisione mitotica sincrona. In questo caso, dovrebbero essere tenuti solo gli embrioni con distribuzione disperso, non-nucleari di eGFP-PCNA, e tutti gli altri embrioni devono essere eliminati. Poiché la densità nucleare non può essere determinata, metodi alternativi di embrioni in fase di loro morfologia hanno visualizzata in microscopia chiara trasmessa devono essere impiegati. Presenza di cellule del palo e nuclei alla periferia dell'embrione indicano che l'embrione ha completato il ciclo nucleare almeno 9, mentre indica cellularization visibili alla periferia nucleare ciclo 1412.
Hi-C esperimenti possono essere effettuati con successo usando una vasta selezione di enzimi di restrizione5. Approcci attuali utilizzano in genere gli enzimi che riconoscono una sequenza di 4-base, ad esempio MboI o un sito di riconoscimento 6-base, ad esempio HindIII. Il vantaggio di 4-base frese su frese 6-base è che essi offrono maggiore risoluzione potenziale, dato abbastanza profondità di sequenziamento e una copertura più uniforme dei siti di restrizione in tutto il genoma. Non c'è nessun chiaro vantaggio nella scelta di una lama 4-base sopra un altro5,23,36,37. I due enzimi più comunemente usati, MboI e DpnII, entrambe riconoscono il sito di riconoscimento stesso GATC. DpnII è meno sensibile alla metilazione di CpG, che è di alcuna preoccupazione in drosofila. Il protocollo presentato qui può anche essere completato con successo utilizzando DpnII come un enzima di restrizione. Nella sezione 4.2. enzima di restrizione e buffer devono essere regolati per la compatibilità DpnII, secondo le raccomandazioni del produttore.
Se la dimensione del frammento della biblioteca sequenziamento si discosta significativamente dalla gamma mostrata nella Figura 2A, formazione del cluster durante la sequenza può essere meno efficiente o fallire completamente. In questo caso, la distribuzione delle dimensioni dopo la tosatura deve essere controllata e parametri di taglio regolata di conseguenza. Picchi nella distribuzione di frammenti di DNA di piccolissime (< 100 bp) o molto grandi (> 1.000 bp) dimensioni indica problemi con selezione di dimensioni, ad esempio trasportare sopra di perline o surnatante che dovrebbero essere scartati. Spesso queste librerie con piccoli picchi a queste dimensioni indesiderabili, come quello nella foto, è ancora sequenziati con successo con solo una diminuzione secondaria in clustering di efficienza.
Alti tassi di duplicazione di PCR dovrebbero essere evitati perché questo riduce drasticamente il numero di sequenza utilizzabile letture. Il tasso di PCR duplicati è direttamente correlato alla quantità di materiale in ingresso. Pertanto utilizzando ulteriori input di solito allevia i problemi con duplicazione di PCR.
Un numero maggiore di letture filtrati a causa di leggere orientamento (Figura 2B) indica digestione insufficiente, che può essere il risultato dell'utilizzo di enzima troppo poco, troppo input materiale o incompleta omogeneizzazione degli embrioni.

Acquisizione di conformazione cromatinica (3C) è emerso come un metodo estremamente utile per studiare la topologia della cromatina nel nucleo1. La variante 3C Hi-C permette di misurare le frequenze di contatto di tutte le interazioni di cromatina che si verificano nel nucleo in un singolo esperimento2. Applicazione di Hi-C ha giocato un ruolo importante nella scoperta e caratterizzazione di molti principi fondamentali dell'organizzazione della cromatina, ad esempio TADs, comparti e cicli3,4,5.
Studi di architettura della cromatina nel contesto delle transizioni inerente allo sviluppo e differenziazione delle cellule sono sempre più utilizzati per svelare i meccanismi di regolazione genica durante questi processi6,7,8, 9. Uno degli organismi modello di grande interesse è la Drosophila melanogaster, cui sviluppo e genoma sono ben caratterizzati. Tuttavia, pochi studi che indagano l'architettura della cromatina in Drosophila di fuori della coltura in vitro del tessuto le impostazioni sono state condotti10,11. Negli embrioni fertilizzazione post 16 – 18 h, TADs e scomparti che ricorda di strutture simili a mammiferi erano identificati10, che solleva la questione di quale ruolo giocano nella regolazione genica durante l'embrione di Drosophila sviluppo. Soprattutto nelle prime fasi di sviluppo, prima della gastrulazione, tali studi sono tecnicamente impegnativi. Prima di gastrulazione, embrioni della drosofila subiscono 13 divisioni nucleari sincroni che procedono ad un ritmo estremamente rapido di 8 – 60 min per ciclo12,13. Oltre a questo, la mancanza di funzionalità visive a distinguere le diverse fasi rendono difficile ottenere materiale strettamente in fasi embrione in quantità sufficienti.
Al fine di sviluppare un protocollo che permette di studiare architettura della cromatina nello sviluppo iniziale di Drosophila a ciclo nucleare ad alta risoluzione, abbiamo combinato due tecniche esistenti: in situ Hi-C, che consente la generazione di alta risoluzione tutta genoma contatto mappe5e messa in scena di embrione tramite riga di Drosophila transgenica che esprimono un eGFP-PCNA transgene13,14. Questo transgene si localizza nel nucleo durante l'interfase e si disperde in tutto il blastoderm sinciziale durante la mitosi. Utilizzare questa proprietà, è possibile facilmente distinguere diverse fasi dalla loro densità nucleare e mitotici embrioni mediante la dispersione del segnale GFP.
Insieme, queste tecniche consentono di studiare la struttura tridimensionale della cromatina in alta risoluzione da poco più di 20 embrioni della drosofila . Questo protocollo include le istruzioni per la raccolta e cernita embrioni della drosofila per ottenere popolazioni di embrioni da un ciclo di singola divisione nucleare. Inoltre descrive come gli embrioni ottenuti vengono utilizzati per eseguire in situ Hi-C. Il risultato finale è una libreria di nucleotidi adatta per il sequenziamento su macchine di prossima generazione sequenziamento. Le letture di sequenziamento risultante possono quindi essere elaborate in cromatina dettagliata interazione mappe che coprono l'intero genoma di Drosophila .

<table><tbody><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I Frammento di Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 DNA ligasi tampone incluso</td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori completi della proteasi ultra privi di EDTA</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos per Illumina&nbsp;( 1)</td>L'adattatore per sequenziamento <td>New England Biolabs</td><td>E7335</td><td>, il primer PCR diretto (non indicizzato) e il primer PCR inverso (indicizzato) e l'enzima USER utilizzati nella sezione di preparazione della libreria sono componenti di questo kit</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td> New <td>England Biolabs</td><td>E7645</td><td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix e Polymerase Master Mix utilizzati nella sezione di preparazione della libreria sono componenti di questo kit</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA System</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare Falcon 100 & micro; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cestelli per la raccolta degli embrioni 37</td></tr><tr><td>% formaldeide</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Eptano</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td></td> Stereomicroscopio <td></td><td></td><td>fluorescente M165 FC</td></tr> Leica <tr><td>M165 FC Fotocamera</td><td>DFC Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropestello in metallo</td><td>Carl Roth</td><td>P985.1</td><td>Utilizzato per lisare gli embrioni in passo 4.1.4</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>Perle magnetiche rivestite di streptavidina</td></tr><tr><td>Perline Ampure XP Beckman</td><td>Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Provette per test Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>mosche Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA</td><td>Dono di S. Blythe ed E. Wieschaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio 13%</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>tampone Tris pH 8,0 (1 M) per biologia molecolare</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS per biologia molecolare</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone</td> <td>CutSmartNew England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Tampone enzimatico di restrizione</td></tr><tr><td>PCR Miscela di nucleotidi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814362001</td><td>dCTP, dGTP, dTTP non modificati</td></tr><tr><td>BSA, grado di biologia molecolare</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M soluzione per biologia molecolare</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio 3 M pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Supporto magnetico</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>Mixer</td></tr><tr><td>Gabbie per la raccolta di piccoli embrioni</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>Centrifuga per la raccolta delle uova</td></tr><tr><td>5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>strisce di provette PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA polimerasi tampone</td></tr></tbody></table>

generazione di genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Studiando l'architettura tridimensionale della cromatina offre preziose informazioni sui meccanismi di regolazione genica. Qui, descriviamo un protocollo per l'esecuzione la cromatina conformazione acquisizione tecnica in situ Hi-C su organizzato popolazioni di embrione di Drosophila melanogaster . Il risultato è una libreria di sequenziamento che permette la mappatura di tutte le interazioni di cromatina che si verificano nel nucleo in un singolo esperimento. L'ordinamento dell'embrione è fatto manualmente utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo e una linea di volo transgenica contenenti un marcatore nucleare. Utilizzando questa tecnica, le popolazioni di embrione da ogni ciclo di divisione nucleare e con lo stato definito ciclo cellulare, può essere ottenuto con purezza molto elevata. Il protocollo può anche essere adattato per ordinare più vecchi embrioni di là di gastrulazione. Ordinato gli embrioni vengono utilizzati come input per in situ Hi-C. Tutti gli esperimenti, tra cui il sequenziamento preparazione libreria, possono essere completati in cinque giorni. Il protocollo ha bassi requisiti di ingresso e funziona in modo affidabile utilizzando 20 embrioni in fase blastoderm come materiale in entrata. Il risultato finale è una libreria di sequenziamento per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo l'ordinamento, i dati possono essere trasformati in mappe di interazione della cromatina genoma che possono essere analizzate utilizzando una vasta gamma di strumenti disponibili per ottenere informazioni sull'associazione topologicamente struttura di dominio (TAD), cicli di cromatina e cromatina compartimenti durante lo sviluppo della drosofila .

Ordinato di popolazioni di embrione al ciclo nucleare 12, 13 e 14 (corrispondenti a 01:30, 01:45 e 02:10 ore post fecondazione, rispettivamente12) e fecondazione post di 3 – 4 h (hpf) sono stati ottenuti secondo le procedure descritte nel protocollo. Scattando foto del segnale eGFP-PCNA di ciascun lotto di embrione ordinato, è possibile documentare il preciso stato di fase e ciclo cellulare di ogni singolo embrione che viene utilizzato negli esperimenti a valle. Immagini di esempio degli embrioni da popolazioni ordinati sono mostrate in Figura 1B-E. L'output del protocollo in situ Hi-C è una libreria di nucleotide pronta ad essere sequenziata sulla prossime generazione di macchine di sequenziamento. Per questo scopo, una concentrazione di raccolta finale di almeno 2 – 4 nM è richiesta solitamente. Utilizzando le quantità raccomandate di materiale in entrata, questa concentrazione è attendibilmente realizzato (tabella 1).
La distribuzione di dimensione prevista dei frammenti del DNA dopo la selezione della dimensione sono tra 300 – 600 bp, con un massimo a circa 500 bp (Figura 2A), a seconda la tosatura esatta e parametri di selezione dimensione. Per una sequenza, si consiglia di fine accoppiato letture di almeno 75 lunghezza bp per ridurre al minimo il numero di frammenti di restrizione unmappable nel genoma. Mappe ad alta risoluzione con 1 – 2 kb bin dimensione possono essere ottenute da 400 milioni di letture. Si consiglia di sequenziamento più replicati biologici ad una profondità inferiore di 150 milioni legge ogni, invece di sequenziamento di una singola replica a profondità molto elevate. Questo permette di valutare la variazione biologica e conduce a un minor numero di letture scartati a causa della duplicazione di PCR. Per la rappresentazione visiva, le repliche possono essere combinati. Prima di impegnarsi in un campione ad alta profondità di sequenziamento, si consiglia di eseguire i campioni mediante sequenziamento superficiale (qualche milione letture per campione) per determinare i parametri di qualità di libreria di base come in Figura 2B.
Analisi dei dati di Hi-C richiede significativa esperienza di bioinformatica e risorse computazionale. Come un quadro di massima, le letture accoppiate vengono mappate in modo indipendente per il genoma di riferimento, i tracciati risultanti sono filtrati per la qualità e l'orientamento, quindi una matrice di contatti a livello di risoluzione o un frammento di una determinata collocazione può essere generata dal filtrato allineamenti. La matrice di contatto è la base di tutto più a valle analisi esplorare TADs, cicli e scomparti. Per l'analisi iniziale del sequenziamento si legge, sono disponibili diverse condutture di bioinformatica che ne consentono l'elaborazione di crude letture in matrici di contatto senza molto specializzati bioinformatica conoscenza18,19, 2021,,22,23. Come ulteriore analisi è trasportata fuori dipende in larga misura esatta domanda biologica sotto studio e potrebbero richiedere significativa esperienza nella programmazione e di scripting in R o Python. Tuttavia, diversi strumenti e algoritmi di chiamare TADs sono disponibili5,24,25,26,27,28, nonché software per analizzare e Esplora Hi-C dati nel browser web e come applicazioni desktop autonome29,30,31,32.
Una volta elaborata, la qualità della biblioteca può essere determinata utilizzando diversi parametri (Figura 2B). In primo luogo, il tasso di duplicati PCR, che è il numero di coppie di lettura sequenziate derivanti dalla stessa molecola originale, dovrebbe essere più basso possibile limitare la quantità di letture di sequenza sprecato. Tuttavia, anche le librerie con &gt; 40% duplicazione di PCR possa essere trasformati in contattare mappe di alta qualità se i duplicati vengono filtrati. In secondo luogo, il tasso di letture filtrate a causa del loro orientamento, come descritto in4, deve costantemente essere inferiore al 10% delle coppie lettura allineate.
Durante lo sviluppo pre-gastrular di Drosophila tra ciclo nucleare 12 e 14, l'architettura nucleare è drasticamente ristrutturato33 (Figura 3). Al ciclo nucleare 12, pochi TADs vengono rilevati e la distribuzione complessiva dei contatti è molto liscia, senza molte caratteristiche distinguibili. Ciò è stata cambiata al ciclo nucleare 13 e 14, quando TADs sono sempre più prominenti e aspecifici contatti a lungo raggio sono esaurite.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figura 1: immagini rappresentative degli embrioni di eGFP-PCNA durante l'ordinamento. Segnale di eGFP-PCNA (A) da una popolazione indifferenziato di embrioni dopo 60 min raccolta e 2 ore di incubazione a 25 ° C (B-E) esempi di embrioni da popolazioni ordinati al ciclo nucleare 12 (B), nucleare ciclo 13 (C), 14 (ciclo nucleare D) e da embrioni in fase di mitosi sincrone (E). Scala bar = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figura 2: Esempi di metriche di qualità in situ Hi-C biblioteca. (A) Bioanalyzer tracce mostrano la distribuzione delle dimensioni del frammento del DNA da un successo Hi-C library (libreria 1, alto) e da una libreria che consente di visualizzare un picco di frammenti che sono troppo grandi per il sequenziamento (Biblioteca 2, in basso). Libreria 2 è stato sequenziato con successo, ma anche grandi quantità di frammenti di DNA indesiderati possono condurre ai rendimenti di sequenziamento in diminuzione. (B) filtro statistiche delle due librerie di Hi-C: sono visualizzati il numero di coppie di lettura allineate che sono esclusi da ulteriori analisi a causa di leggi orientamento e distanza (verso l'interno, verso l'esterno)4 o duplicazione di PCR (duplicato). In ogni battuta, vengono stampato il numero di letture passando il filtro (rimanenti) e in mancanza di (filtrato). La percentuale di letture passando il filtro viene inoltre visualizzata come testo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figura 3: mappe da embrioni in fasi: interazione Hi-C. Hi-C interazione mappe sono cestinate a risoluzione di 10 kb e bilanciate come descritto prima33. Mostrato è una regione sul cromosoma 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Biblioteca</td>
			<td>Fase</td>
			<td>Numero di embrioni</td>
			<td>Quantità del DNA prima tosatura (ng)</td>
			<td>Cicli di PCR</td>
			<td>Concentrazione finale biblioteca (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>nucleare ciclo 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>nucleare ciclo 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>nucleare ciclo 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>nucleare ciclo 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>nucleare ciclo 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>nucleare ciclo 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ciclo nucleare 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>ciclo nucleare 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>ciclo nucleare 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: elenco delle statistiche delle biblioteche di sequenziamento rappresentante. Per ogni libreria nell'elenco, il numero di embrioni che sono stati utilizzati per la sua generazione, la quantità di DNA totale prima di biotina pulldown e tosatura misurata da Qubit, numero di PCR di cicli utilizzati per l'amplificazione e la concentrazione finale della libreria di sequenziamento Dopo la selezione di purificazione e le dimensioni sono indicate.

Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di alta risoluzione in situ Hi-C librerie da strettamente in scena pre-gastrulazione Drosophila melanogaster embrioni.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'architettura della cromatina come il modo in cui la struttura 3D della cromatina può influenzare l'espressione e lo sviluppo genico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visione ad alta risoluzione dell'architettura della cromatina e degli embrioni di mosca messi in scena con precisione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione e lo sviluppo della cromatina, si possono anche utilizzare linee esistenti da librerie di volo transgeniche per testarne l'effetto nell'organizzazione della cromatina.Per iniziare il protocollo, regolare il volume totale degli embrioni raccolti in precedenza a due millilitri con PBST. Aggiungere sei millilitri di eptano e 100 microlitri di formaldeide al 37% in acqua. Dopo aver aggiunto la formaldeide, scuotere vigorosamente il tubo su e giù per un minuto.La fase acquosa e organica si combinerà per formare una consistenza simile a uno shampoo. Agitare la miscela su un miscelatore rotante per 10 minuti. Centrifugare il tubo a 500 volte g per un minuto a temperatura ambiente per raccogliere embrioni nella parte inferiore del tubo.Aspirare l'intero liquido simile a uno shampoo e scartarlo, facendo attenzione a non aspirare embrioni. 15 minuti dopo l'aggiunta di formaldeide, resuspend gli embrioni in cinque millilitri di PBST con glicina millimolare 125. Scuotere vigorosamente gli embrioni su e giù per un minuto.Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante. Utilizzando una pipetta da 1.000 microliter, trasferire un lotto di 100 embrioni su un piccolo recipiente di vetro adatto per la cernita, preferibilmente su uno sfondo scuro e posizionarlo sul ghiaccio. Ordinare gli embrioni in base alla densità nucleare e allo stato del ciclo cellulare utilizzando un ago o una punta della siringa.Rimuovere tutti gli embrioni mitotici riconoscibili dalla distribuzione non nucleare di EGFP PCNA ed embrioni che mostrano parzialmente un segnale GFP non nucleare. Per aiutare lo smistamento, allineare gli embrioni di riferimento ai cicli nucleari 12, 13 e 14 in ogni lotto per abbinare gli embrioni a uno degli embrioni di riferimento. Pipettare gli embrioni desiderati utilizzando una pipetta da 1.000 microliter.Trasferirli su un tubo fresco e metterli sul ghiaccio. Continuare fino a quando non vengono ordinati abbastanza embrioni per l'esperimento pianificato. Tubi di rotazione brevemente a 100 volte g a temperatura ambiente.Rimuovere il supernatante e assicurarsi che gli embrioni siano il più asciutti possibile per il congelamento. Flash congela gli embrioni immergendo i tubi in azoto liquido e immagazzinare a meno 80 gradi Celsius. Posizionare i tubi con embrioni congelati sul ghiaccio.Rimescolare gli embrioni in 500 microlitri di tampone di lysis ghiacciata. Attendere un minuto per consentire all'embrione di depositarsi sul fondo del tubo. Successivamente, macinare gli embrioni con un micro pestello metallico pre-raffreddato sul ghiaccio progettato per adattarsi strettamente a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Per evitare di agitare gli embrioni, inserire lentamente il pestello fino a tocchi il fondo del tubo. Spingere verso il basso e quindi macinare ruotando il pestello due volte in entrambe le direzioni. Sollevare il pestello molto leggermente.Spingere di nuovo verso il fondo del tubo e ripetere la procedura di macinazione 10 volte o fino a quando gli embrioni non sono completamente lisci. La soluzione dovrebbe essere omogenea e non dovrebbero rimanere grandi pezzi residui di embrioni. Incubare la sospensione omogeneizzata sul ghiaccio per 15 minuti.Gira a 1.000 volte g quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet riutilizzando in tampone di lisi fredda di ghiaccio da 500 microliter e tubazione su e giù. Dopo un altro giro, scartare il supernatante.Rimescolare il pellet lavato in 100 microlitri dello 0,5% sodio Dodecil Solfato o SDS. Quindi permeabilizzare i nuclei incubando il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Aggiungere 50 microlitri del 10%Triton X100 e 120 microlitri di acqua.Scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un blocco termico. Aggiungere 25 microlitri di tampone enzimatico di restrizione 10X e 20 unità di cinque unità per microlitro MBO1. Far scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il tubo in un blocco di calore per digerire il DNA.Aggiungere altre 20 unità di MBO1. Continuare l'incubazione per 90 minuti. Dopo la seconda incubazione di 90 minuti, incubare il campione a 62 gradi Celsius per 20 minuti per inattivo l'MBO1.Successivamente, aggiungere 18 microlitri di 0,4 millimolare biotina 14-dATP, 2,25 microlitri di un mix non modificato di 3,3 millimolare dCTP-dGTP-dTTP e otto microlitri di cinque unità per microlitro DNA polimerasi I Klenow frammento. Scorrere il tubo per mescolare il contenuto e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 90 minuti. Successivamente, aggiungere 657 microlitri di acqua, 120 microlitri di tampone di ligasi del DNA 10X T4, 100 microlitri del 10%Triton X100, sei microlitri di 20 milligrammi per albumina di siero bovino millilitro e infine cinque microlitri di cinque unità per microlitro T4 DNA ligasi.Quindi, ruotare delicatamente il tubo a 20 giri/min a temperatura ambiente per due ore. Aggiungere altri cinque microlitri di cinque unità per microlitro T4 DNA ligasi. Continuare a ruotare per altre due ore, quindi far girare i nuclei a 2.500 volte g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante. Rimescolare il pellet in 500 microlitri di tampone di estrazione e aggiungere 20 microlitri da 20 milligrammi per millilitro proteinasi K.Flick il tubo e incubare il tubo per digerire la proteina. Aggiungere 130 microlitri di cinque cloruri di sodio molare e incubare durante la notte per scollegare.Il giorno dopo, pipettare il campione in un nuovo tubo da due millilitri con basse caratteristiche di legame del DNA. Aggiungere un volume di 0,1X di tre acetato di sodio molare e due microlitri da 15 milligrammi per millilitro GlycoBlue. Aggiungere 1,6 volumi di etanolo assoluto puro e invertire il contenuto, quindi incubare il campione a meno 80 gradi Celsius per 15 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare il contenuto. Individuare il pellet di DNA che può essere individuato solo dal GlycoBlue. Rimuovere attentamente il supernatante, spostando la punta della pipetta nel tubo lungo la parete opposta dal pellet di DNA.Lavare il pellet con 800 microlitri di 70%etanolo. Mescolare il campione inverterlo e centrifugarlo a 20.000 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere le goccioline rimanenti durante questo passaggio e i seguenti lavaggi spingendoli fuori dai tubi con una punta P10, quindi aprire il coperchio per asciugare all'aria per un massimo di cinque minuti.Una volta che non rimane liquido, aggiungere 50 microlitri di cloruro di tris millimolare. Pipettare ripetutamente la soluzione sull'area in cui si trovava il pellet per solubilizzare il DNA. Aggiungere un microlitro di 20 milligrammi per millilitro RNasi A.Mescolare facendo scorrere il tubo.Incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti per digerire l'RNA. Infine, conservare il campione nel congelatore o nel frigorifero fino alla preparazione della biblioteca. Le immagini del segnale PCNA EGFP di ogni lotto di embrioni ordinato rivelano lo stato preciso dello stadio e del ciclo cellulare di ogni singolo embrione per gli esperimenti a valle.Le tracce di bioanalizzatore mostrano che la distribuzione delle dimensioni dei frammenti di DNA dopo la selezione delle dimensioni è compresa tra 300 e 700 coppie di basi con un massimo di circa 450 coppie di basi. Le mappe di interazione hi-C mostrano che al ciclo nucleare 12 vengono rilevati pochi domini o DATAD topologicamente associati che cambiano drasticamente ai cicli nucleari 13 e 14 quando i DATAD sono sempre più prominenti e i contatti a lungo raggio non specifici sono esauriti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavare accuratamente le perline e di non prolungare inutilmente i tempi di incubazione soprattutto alle alte temperature poiché ciò può portare a librerie Hi-C di bassa qualità.Questa tecnica che combina una stadiazione accurata e una mappatura di conferma della cromatina ad alta risoluzione ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare il ruolo dell'organizzazione tridimensionale della cromatina in un ambiente di sviluppo in vivo.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Recentemente high-throughput tecnologia di sequenziamento ha notevolmente aumentato la sensibilità di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) esperimento e ha spinto la sua applicazione con cellule purificate o tessuti sezionati. Qui delineare un metodo per usare la tecnica ChIP...

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Qui si descrive un insieme di montaggio...

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

Segnaliamo l'applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

Descriviamo una tecnica per profilare i microRNA nei primi embrioni di topo. Questo protocollo supera la sfida dell'input a bassa cellula e del piccolo arricchimento dell'RNA. Questo saggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione del miRNA nel tempo in diversi lignaggi cellulari dell'embrione del topo precoce.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.

Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Qui, presentiamo un protocollo di marcatura genica endogena semplificato per Drosophila, che utilizza una tecnica basata sulla PCR per l'identificazione senza marcatori di modificazioni genetiche di successo, facilitando lo sviluppo di linee knock-in stabili.

Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

Scopri come generare librerie Hi-C ad alta risoluzione da embrioni di Drosophila melanogaster in fasi precoci. Questo metodo consente di studiare l'architettura della cromatina e la regolazione genica durante lo sviluppo.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

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